專利名稱：：兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶，尤其涉及兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法。
背景技術：
：幾丁質(zhì)(Chitin)是一種以|3-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰葡萄糖胺(N-actylglucosamine，GlcNAc)，為生物多糖，是真菌細l包壁、非脊推動物如昆蟲、線蟲的外骨骼的重要結構成份。幾丁質(zhì)結合蛋白(Chitin-bindingproteins,CBPs)是一類能與幾丁質(zhì)(Chitin)特異結合的蛋白質(zhì)，廣泛存在于動、植物中，是動、植物防御細菌和真菌感染的天然防衛(wèi)體系的的組要成員，在動、植物受到傷害時、病蟲害侵染時大量表達。溶菌酶能催化水解構成細胞壁的N-乙酰葡萄糖胺(和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid,NAM)之間的|3-1，4糖苷4建，也能水解幾丁質(zhì)N-乙酰胞壁酸之間的|3-1,4糖苷鍵，生成粘多糖、粘多肽、N-乙酰葡萄糖胺等生物小分子。在動、植物、微生物中都有存在。其用途廣泛，在食品工業(yè)上，溶菌酶是雙歧桿菌的增值因子，用于乳制品中，可防止腸炎和變態(tài)反應，對嬰、幼兒的腸道菌群有平衡作用；在干酪中添加溶菌酶可抑制丁酸菌的污染；在海鮮、肉制品中，溶菌酶與氯化鈉和亞硝酸鹽一起應用可延長肉制品的保質(zhì)期，增強其防腐效果；在醫(yī)藥上，溶菌酶參與人體的多糖代謝，加速粘膜組織的修復，并具有抗感染、抗細菌、抗病毒的作用；溶菌酶還能分解粘膜蛋白，降解膿液或痰液的粘度，使之變稀而排出；還能與血液中的抗凝因子結合，具有止血作用等。蘿卜雙功能酶兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力，酶穩(wěn)定性高，酶活力在0~60°C,pH3.410.0穩(wěn)定;抑菌譜廣，對革蘭氏陰性細菌(G—)、革蘭氏陽性細菌(G+)、真菌、昆蟲等都由一定的殺滅作用。(蘿卜CBPs的分離及部分酶學特性研究。賴曉芳，深善瑞，王煒軍?；春９I(yè)院學報，第12巻第四期，47~50頁；中國專利CN02115151.2)。其作用機理是直接作用于靶標的細胞壁，使細胞壁降解、破裂，進而殺死靶標，對動、植物無毒副作用，也不會產(chǎn)生耐藥性；而目前使用的抗生素類藥物主要是通過阻斷細菌的復制繁殖，動、植物會產(chǎn)生嚴重的耐藥性，對動、植物危害很大。目前，這類酶制劑(如雞蛋清溶菌酶)的生產(chǎn)制備多用等電點沉淀法即原料(蛋清)稀釋，加入"/。NaCl，調(diào)節(jié)pH值至等電點(pl),加入晶種，離心收集。此工藝的缺陷是等電點時，酶沉淀不完全，還有部分酶處于溶解狀態(tài)，產(chǎn)率低，二是等電點時，酶變性失活，損傷了酶的活力。也可采用離子交換樹脂吸附法，但是，由于樹脂的疏水性，易引起蛋白變性，而且，雜蛋白多，酶的純度不高。兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶的性質(zhì)為其在生產(chǎn)、生活中應用提供了基礎。目前，可用于防治動、植物真菌感染的植物來源的工業(yè)產(chǎn)酶極少，如何實現(xiàn)兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶的工業(yè)化生產(chǎn)是限制兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶推廣應用和產(chǎn)品開發(fā)的瓶頸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種兼具幾丁質(zhì)酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)提取方法。該法操作工藝簡單，陳本低廉，所得蘿卜雙功能酶酶活力高，抗菌譜廣，穩(wěn)定性好，半衰期長，可用于醫(yī)藥，衛(wèi)生保健、農(nóng)藥等領域。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，先將原料洗凈，切碎，用勻漿液攪拌勻漿，通過離心，過濾，超過濾等步驟獲得蘿卜雙功能酶濃縮液，濃縮液分別加入保護劑，噴霧干燥后制得干粉蘿卜雙功能酶，包含以下步驟(1)原料處理取新鮮蘿卜葉或塊根洗凈；(2)勻漿提取取(1)所得原料，加入原料體積1~2倍的4。C預冷的勻漿液攪拌勻漿；(3)離心將(2)所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I;(4)過濾取上述上清液I,用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；(5)再離心取(5)所得濾液，常溫下，14000r/min離心，收集上清液III;(6)超過濾排阻相對分子量10000和60000的蛋白質(zhì)，截留相對分子量10000~60000的蛋白質(zhì)，得濃縮液；(7-l)蘿卜雙功能酶I:取(7)所得濃縮液，加入保護劑，噴霧干燥，進風溫度185°C~195°C，出口溫度80。C~85°C，獲得噴霧干燥粉即為蘿卜雙功能酶I。較佳地，所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，還包括如下任意步驟(1)蘿卜雙功能酶II:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I,加入穩(wěn)定劑，即得液體蘿卜雙功能酶II;(2)液體蘿卜雙功能酶III:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I，加入pH6.2，0.1M磷酸鈉緩沖液溶解后，親和層析，收集含酶洗脫液，再經(jīng)超濾濃縮，截留分子量10000以上的蛋白質(zhì)，得濃縮液加入穩(wěn)定劑，即得液體蘿卜雙功能酶III;(3)固體粉末蘿卜雙功能酶III:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I，加入pH6.2,0.1M磷酸緩沖液溶解，常溫下，14000r/min離心，收集上清液，超濾濃縮，截留分子量10000以上的蛋白質(zhì)，得濃縮液加入穩(wěn)定劑，冷凍干燥，所得干燥粉即為固體粉末蘿卜雙功能酶ni。較佳地，步驟(1)所得原料經(jīng)如下誘導條件誘導后再勻漿原料切碎，在10。C20。C，3000~50001ux光照條件下，i秀導5~10天；較佳地，所述誘導條件為14°C~18°C,3500~45001ux光照條件下，誘導6~8天。所述誘導條件為15。C，40001ux光照條件下，誘導7天。較佳地，所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，還包括如下步驟，取步驟(3)所得濾渣，加入濾渣體積1~2倍的4'C預冷的勻漿液攪拌勻漿，將勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II,上清液II與所述上清液I合并后，進行步驟(4)過濾；步驟(2)所述勻漿液選自但不限于5mM醋酸緩沖液，5mM磷酸緩沖液，5mM碳酸氫鈉緩沖液。步驟(7-l)所述保護劑為質(zhì)量/體積為5%的變性淀粉。所述穩(wěn)定劑為體積/體積為3%~6%甘油，質(zhì)量/體積為6%~12%葡萄糖。所述親和層析介質(zhì)為脫氨再生幾丁質(zhì)凝膠。本發(fā)明的有益效果為l.采用低溫光照誘導技術，使原料酶含量提高23倍；2.研制了特定的蘿卜雙功能酶活性穩(wěn)定劑和保護劑，在室溫下，蘿卜雙功能酶在2年內(nèi)活力基本不變，為原有酶活力的97%以上；3.原料來源廣、價格便宜，不受季節(jié)、氣候等因素影響，一年四季均可種植；4.工藝簡單，價格低廉。具體實施例方式以下將結合具體實施例對本發(fā)明有關細節(jié)做進一步的說明。實施例1取新鮮蘿卜葉或塊根1000公斤，洗凈，切碎；在15。C,40001ux光照條件下，誘導7天；加入原料體積1.5倍的4'C預冷的5mM碳酸氫鈉(NaHC(V)攪拌勻漿；所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I;濾渣加入1倍濾渣體積的4。C預冷的5mM碳酸氫鈉攪拌勻漿；所述勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；常溫下，1400Qr/min離心，收集上清液III;上清液III經(jīng)超過濾濃縮，排阻相對分子量10000和60000的蛋白質(zhì)，截留相對分子量10000-60000的蛋白質(zhì)，得濃縮液；取濃縮液，加入保護劑，噴霧干燥，進風溫度190°C，出口溫度83°C,獲得噴霧干燥粉即為蘿卜雙功能酶I。蘿卜雙功能酶I的得率為15~20公斤酶干粉/噸原料，酶活力為12~15萬單位/克。實施例2取實施例1所得濃縮液，加入4%(體積/體積)甘油，9%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，即得液體蘿卜雙功能酶II。蘿卜雙功能酶II的得率為180~22(^>斤/噸原^",酶活力為180~250萬單位/克。實施例3取1所得蘿卜雙功能酶I，加入pH6.2，0.1MNa3P04緩沖液溶解，離心取上清液，上清液以殼聚糖制備脫氨再生幾丁質(zhì)凝膠為介質(zhì)，進行親和層析，收集含酶洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量在10000以上的蛋白質(zhì)，加入6%(體積/體積)甘油，12%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，即得液體蘿卜雙功能酶in。液體蘿卜雙功能酶III的得率為45-55升/噸原^K酶活力為6.8~7.2萬單位/毫升。實施例4取l所得蘿卜雙功能酶I,加入pH6.2，O.IM磷酸緩沖液溶解，離心取上清液，上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量在10000以上的蛋白質(zhì)，加入3%(體積/體積)甘油，9%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，冷凍干燥即得干粉蘿卜雙功能酶III。干粉蘿卜雙功能酶III的得率為0.9~0.12%/噸原料，酶活力為2.5~3.0萬單位/毫克蛋白質(zhì)。實施例5分別取新鮮蘿卜葉或塊根100公斤，洗凈；稱取50公斤，切碎，在10。C,3000LUX光照條件下，誘導5天；和另50公斤原料一起，分別進行如下步驟加入原料體積1倍的4。C預冷的5mM磷酸緩沖液攪拌勻漿；所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I;濾渣加入1倍濾渣體積的4'C預冷的5mM磷酸緩沖液攪拌勻漿；所述勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；常溫下，14000r/min離心，收集上清液III;上清液III經(jīng)超過濾濃縮，排阻相對分子量10000和60000的蛋白，截留相對分子量10000-50000的蛋白，得濃縮液；取濃縮液，加入4%(體積/體積)甘油，9%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，即得液體蘿卜雙功能酶II。分別取新鮮蘿卜葉或塊根500公斤，洗凈；稱取250公斤，切碎，在1(TC，4000LUX光照條件下，誘導7天；和另250公斤原料一起，分別進行如下步驟加入原料體積2倍的4'C預冷的5mM醋酸緩沖液攪拌勻漿；所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I;濾渣加入1倍濾渣體積的4'C預冷的5mM醋酸緩沖液攪拌勻漿；所述勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；常溫下，14000r/min離心，收集上清液III;上清液III經(jīng)超過濾濃縮，排阻相對分子量10000和60000的蛋白，截留相對分子量10000-50000的蛋白，得濃縮液；取濃縮液，加入3%(體積/體積)甘油，6%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，即得液體蘿卜雙功能酶II。分別取新鮮蘿卜葉或塊根300公斤，洗凈；稱取150公斤，切碎，在20。C，5000LUX光照條件下，誘導10天；和另150公斤原料一起，分別進行如下步驟加入原料體積1.5倍的4'C預冷的5mM碳酸氫鈉(NaHCO;)攪拌勻漿；所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I;濾漆加入1倍濾渣體積的4。C預冷的5mM碳酸氫鈉攪拌勻漿；所述勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II,用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；常溫下，14000r/min離心，收集上清液III;上清液III經(jīng)超過濾濃縮，排阻相對分子量10000和60000的蛋白，截留相對分子量10000-50000的蛋白，得濃縮液；取濃縮液，力口入6%(體積/體積)甘油，12%(質(zhì)量/體積)葡萄糖，即得液體蘿卜雙功能酶II。檢測上述所得蘿卜雙功能酶II的酶活力，比較誘導前后酶活的變化，得表1如下表l.誘導前后蘿卜雙功能酶II的酶活力變化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表中數(shù)據(jù)可知，誘導前后，蘿卜雙功能酶n的酶活力提高了2~3倍。實施例6取6所得誘導后蘿卜雙功能酶II,室溫下，保存1年，2年后，分別纟金測酶活力，比較不同保存時間，酶活力的變化，得表2如下表2.蘿卜雙功能酶II保存1年、2年后的酶活力變化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2可知，加入穩(wěn)定劑和保護劑后，蘿卜雙功能酶n的酶活力，在室溫下，2年內(nèi)活力基本不變，為原有酶活力的97%以上。權利要求1.一種兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，先將原料洗凈，切碎，用勻漿液攪拌勻漿，通過離心，過濾，超過濾等步驟獲得蘿卜雙功能酶濃縮液，濃縮液分別加入保護劑、噴霧干燥后，制得干粉蘿卜雙功能酶，包含以下步驟(1)原料處理取新鮮蘿卜葉或塊根洗凈；(2)勻漿提取取(1)所得原料，加入原料體積1～2倍的4℃預冷的勻漿液攪拌勻漿；(3)離心將(2)所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I；(4)過濾取上述上清液I，用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；(5)再離心取(5)所得濾液，常溫下，14000r/min離心，收集上清液III；(6)超過濾排阻相對分子量10000和60000的蛋白質(zhì)，截留相對分子量10000～60000的蛋白質(zhì)，得濃縮液；(7-1)蘿卜雙功能酶I取(7)所得濃縮液，加入保護劑，噴霧干燥，進風溫度185℃～195℃，出口溫度80℃～85℃，獲得噴霧干燥粉即為蘿卜雙功能酶I。2.如權利要求1所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，還包括如下任意步驟(1)蘿卜雙功能酶II:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I，加入穩(wěn)定劑，即得液體蘿卜雙功能酶II;(2)液體蘿卜雙功能酶III:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I，加入pH6.2,0.1M磷酸鈉緩沖液溶解后，親和層析，收集含酶洗脫液，再經(jīng)超濾濃縮，截留分子量10000以上的蛋白質(zhì)，得濃縮液加入穩(wěn)定劑，即得液體蘿卜雙功能酶ni;(3)固體粉末蘿卜雙功能酶III:取(7-l)所得蘿卜雙功能酶I,加入pH6.2，0.1M磷酸緩沖液溶解，常溫下，14000r/min離心，收集上清液，超濾濃縮，截留分子量10000以上的蛋白質(zhì)，得濃縮液加入穩(wěn)定劑，冷凍干燥，所得干燥粉即為固體粉末蘿卜雙功能酶III。3.如權利要求1所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，步驟(1)所得原料經(jīng)如下誘導條件誘導后再勻漿原料切碎，在10。C2(TC,3000~50001ux光照條件下，誘導510天；4.如權利要求3所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，所述誘導條件為14°C~18°C，3500~45001ux光照條件下，誘導68天。5.如權利要求3所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，所述誘導條件為在15°C,40001ux光照條件下，誘導7天。6.如權利要求1所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，取步驟(3)所得濾渣，加入濾渣體積1~2倍的4。C預冷的勻漿液攪拌勻漿，將勻漿過濾，丟棄濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液II，上清液II與所述上清液I合并后，進行步驟(4)過濾；7.如權利要求1所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，步驟(2)所述勻漿液選自但不限于5mM醋酸緩沖液，5mM磷酸緩沖液，5mM碳酸氬鈉緩沖液。8.如權利要求1所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，步驟(7-1)所述保護劑為質(zhì)量/體積為5%的變性淀粉。9.如權利要求2所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為體積/體積為3%~6%甘油，質(zhì)量/體積為6%~12%葡萄糖。10.如權利要求2所述的兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，其特征在于，所述的親和層析介質(zhì)為脫氨再生幾丁質(zhì)凝膠。全文摘要兼具幾丁質(zhì)酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業(yè)制備方法，先將原料洗凈，切碎，在低溫下誘導產(chǎn)酶，用勻漿液攪拌勻漿，通過離心，過濾，超濾等步驟獲得蘿卜雙功能酶濃縮液，濃縮液分別加入保護劑、穩(wěn)定劑，制得液體蘿卜雙功能酶或干粉蘿卜雙功能酶。本發(fā)明的有益效果為1.采用低溫光照誘導技術，使原料酶含量提高2～3倍；2.研制了特定的蘿卜雙功能酶活性穩(wěn)定劑和保護劑，在室溫下，蘿卜雙功能酶在2年內(nèi)活力基本不變，為原有酶活力的97％以上；3.原料來源廣、價格便宜，不受季節(jié)、氣候等因素影響，一年四季均可種植；4.工藝簡單，價格低廉。文檔編號C12N9/00GK101434936SQ20081021986公開日2009年5月20日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權日2008年12月10日發(fā)明者宋秋蘭申請人:宋秋蘭