專利名稱：溶菌酶活力的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種測定溶菌酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測定溶菌酶活力的方法尤其涉及測定過程中關(guān)鍵參數(shù)的選擇。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)主要來源于人、動物、植物、微生物以及蛋清中，是一種專門作 用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱細(xì)胞壁溶解酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶，全 稱為1，4-β-Ν-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它是一種有效的抗菌劑，它能 切斷肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β -1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞 肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解。目前國內(nèi)外報道檢測溶菌 酶的方法有多種，如瓊脂板擴(kuò)散法，比濁法，比色法，高效液相色譜法、瓊脂糖火箭電泳法、 共振散射光譜法等，其中比濁法是最常用的方法。比濁法以溶壁微球菌為底物，通過酶作用 前后吸光度的變化來體現(xiàn)酶活力的大小。該方法繁瑣，使用的溶壁微球菌懸液體系是由菌 體顆粒和緩沖液組成的固_液相分布的不均勻的不穩(wěn)定體系，在自然條件下該菌懸液也會 發(fā)生自身解體。菌懸液在反應(yīng)前預(yù)熱時間長短，終止反應(yīng)時間的控制等都會對結(jié)果產(chǎn)生影 響。在比濁法中，細(xì)胞壁中的肽聚糖被溶菌酶水解成可溶性的碎片，雖然可以使溶液對光的 吸收度減少，但仍有大量菌體懸浮在溶液中，由于菌體本身多方面的差異，故懸浮在溶液中 的持續(xù)時間不同，導(dǎo)致溶液對光的吸收度變化較大，給測定結(jié)果帶來一定的誤差，從而限制 了它的使用。也有采用DNS法、鐵青化鉀法，以高脫乙酰度的殼聚糖為底物進(jìn)行溶菌酶的酶 活力測定，但是，這些方法靈敏度均不夠高，很難測到初速度，從而限制了其應(yīng)用。本發(fā)明選用化學(xué)結(jié)構(gòu)與肽聚糖結(jié)構(gòu)非常近似的半脫乙酰殼聚糖(脫乙酰度在 45% -55% )為溶菌酶的水解底物，以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)為顯色劑來測定溶 菌酶的活力。該法不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，對于不同聚合度的同類還 原糖，其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同。

發(fā)明內(nèi)容
針對已有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種溶菌酶活力的測定方法，該方法采用3-甲 基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來測定溶菌酶的活力。以下詳細(xì)介紹本發(fā)明一種溶菌酶活力的測定方法，Α，制作用MBTH法測得的N-乙 酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測待測溶菌酶 水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作 的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線確定待測溶菌 酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此 來推算溶菌酶的活力。優(yōu)化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度 值與其相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-20 μ g/mL)的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于 75-85°C水浴加熱15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長620-680nm 處測定N乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個濃度做三個平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄 糖濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；優(yōu)化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測溶菌酶的活力；將半脫乙酰殼 聚糖溶液其濃度為4-10mg/mL，加入到錐形瓶中于25-40°C的水浴搖床中預(yù)熱8-12min，加 入預(yù)熱至相應(yīng)溫度的溶菌酶溶液進(jìn)行水解反應(yīng)，水解時間為60min以內(nèi)， 取水解液2mL (可 在反應(yīng)過程中分時間段取樣檢測)，迅速與2mL 0.5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止反 應(yīng)，取1. 2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴加熱 15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值， 根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖的濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān) 系曲線確定待測溶菌酶的活力；溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng) 體系，每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。其中 MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液 等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。優(yōu)化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4 (S04) 2) · 12H20,0. 5%氨基磺
酸，0.5當(dāng)量鹽酸。優(yōu)化地；上述殼聚糖的脫乙酰度為50%。優(yōu)化地；上述半脫乙酰殼聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。優(yōu)化地；上述測定吸光度值的最佳波長為655nm。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明用MBTH法對溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后所產(chǎn)生的N-乙 酰氨基葡萄糖端基的數(shù)量進(jìn)行檢測以此來確定溶菌酶的活力；N-乙酰氨基葡萄糖以及低 聚半脫乙酰殼聚糖是溶菌酶水解的最終產(chǎn)物，因此對N-乙酰氨基葡萄糖端基含量檢測的 靈敏度直接決定著對溶菌酶活力檢測的靈敏度。該方法比比濁法簡便、快速、準(zhǔn)確、價廉。檢 測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS 法和鐵氰化鉀法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 主要儀器水浴恒溫振蕩器，SHZ-82型，國華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋， HH-4型，國華電器有限公司；數(shù)字酸度計，上海大普儀器有限公司；721可見光分光光度計 或，上海菁華科技儀器有限公司；溶菌酶，來源于蛋清，sigma;半脫乙酰殼聚糖，實(shí)驗(yàn)室自 制；移液器，F(xiàn)innpipette。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。N乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的N-乙酰氨基葡 萄糖0. 2000g,用50mM pH4. 0的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中取ImL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。步驟Α，制作用MBTH法測得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；分別加入8組不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng) 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于80°C水浴加熱15-20min后趁熱加入硫酸 鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長655nm處測定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個濃 度做三個平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖溶液濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān) 系繪制標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；B,用MBTH法檢測溶菌酶的活力；將9. 9mL半脫乙酰殼聚糖溶液其濃度為4mg/mL，pH值為4. 0，加入到錐形瓶中 于40°C的水浴搖床中預(yù)熱lOmin，加入待測的溶菌酶溶液0. ImL進(jìn)行水解反應(yīng)，為確定合 適的待測溶菌酶濃度可以將待測的溶菌酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，水解時間為 60min以內(nèi)，取水解液2mL(可在反應(yīng)過程中分時間段取樣檢測)，迅速加入2mL 0. 5當(dāng)量的 NaOH溶液中(做三個平行樣)，混勻，取1. 2mL加入到試管中，再加入MBTH試劑0. 6mL于 75-85°C水浴加熱20-25min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長655nm處測 定吸光度值，根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的 標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線確定待測的溶菌酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的 還原糖的量。溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生 Inmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活力單位，從而根據(jù)酶活力定義來推算木 溶菌酶的活力。實(shí)施例2 主要儀器電熱恒溫水浴鍋，HH-4型，國華電器有限公司；數(shù)字酸度計，上海大普 儀器有限公司；UV2100紫外-可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；溶菌酶，來 源于蛋清，sigma ；半脫乙酰殼聚糖，實(shí)驗(yàn)室自制；移液器，F(xiàn)innpipette0溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的N-乙酰氨基 葡萄糖0. 2000g,用50mM pH4. O的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中取ImL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至 IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。步驟Α，制作用MBTH法測得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對 應(yīng)關(guān)系曲線；分別加入8組不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng) 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于80°C水浴加熱15-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長655nm處測定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個濃 度做三個平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖溶液濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān) 系繪制標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；B,用MBTH法檢測溶菌酶的活力；將ImL半脫乙酰殼聚糖溶液其濃度為8mg/mL，pH值為4. 0，加入試管中于40°C的 水浴搖床中預(yù)熱lOmin，加入待測的已預(yù)熱至40°C的溶菌酶溶液ImL進(jìn)行水解反應(yīng)，為確定 合適的待測溶菌酶濃度可以將待測的溶菌酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，水解時間 為60min以內(nèi)，迅速加入2mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止反應(yīng)，從中取1. 2mL加 入到已有0. 6mL MBTH試劑的另一試管中，充分混勻，于75-85 °C水浴加熱20-25min后趁熱 加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長655nm處測定吸光度值，如法做三個平行樣， 根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系 曲線確定待測的溶菌酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的量。 溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于 N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位，從而根據(jù)酶活力定義來推算木溶菌酶的 活力。當(dāng)然，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述操作，所有在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種溶菌酶活力的測定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測待測溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)的吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線確定待測溶菌酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算溶菌酶的活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述步驟A的具體步驟 是；分別取6-15組具有不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,濃度范圍在0_20微 克/毫升之間，加入0. 6mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C 水浴加熱15-25min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定 吸光度值；每個濃度做三個平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的吸光度值之 間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述步驟B的具體 步驟是；將殼聚糖_脫乙酰度在45% -55%的溶液其濃度為4-10mg/mL，加入到錐形瓶中于 40-500C的水浴搖床中預(yù)熱8-12min，加入預(yù)熱至相應(yīng)溫度的溶菌酶溶液開始水解反應(yīng)，水 解時間為60min以內(nèi)，取水解液2mL，可在反應(yīng)過程中分階段取樣，與2mL 0. 5當(dāng)量的NaOH 溶液迅速混合以終止反應(yīng)，從中取1. 2mL加入到試管中，做三個平行樣，再加入MBTH試劑 0. 6mL于75-85°C水浴加熱20-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長 620-680nm處測定吸光度值，根據(jù)步驟A制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)吸光 度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線確定酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原 糖濃度，以此來推算溶菌酶的活力；溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反 應(yīng)體系每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；其中 MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液 等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述硫酸鐵銨試劑的制 法是 0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5 當(dāng)量鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述殼聚糖的脫乙酰度 為 50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述殼聚糖溶液以50mM 的丁二酸或醋酸溶液為溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測定方法，其特征是；上述測定吸光度值的最 佳波長為655nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種溶菌酶活力的測定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測待測溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)關(guān)系曲線確定待測溶菌酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算溶菌酶的活力。該方法測定N-乙酰氨基葡萄糖的檢測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。
文檔編號C12Q1/34GK101839850SQ201010144058
公開日2010年9月22日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者張永勤, 武強(qiáng), 王哲平 申請人:青島科技大學(xué)