專利名稱:溶菌酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，尤其涉及溶菌酶的制備方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶的研究和應(yīng)用目前在我國尚處于起步階段，它存在于機(jī)體組織、體液及分泌物中，能與細(xì)菌結(jié)合并使細(xì)菌的細(xì)胞壁崩解而死亡，從而達(dá)到抑菌、殺菌目的；溶菌酶對(duì)人體安全、無毒、無害，還具有一定的保健作用。在食品行業(yè)，人們已開始將其用于面食類、水產(chǎn)熟食品、冰淇淋、色拉和魚子醬等食品的防腐保鮮。并且基于溶菌酶的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理功效，日本等國家已將其用于出血、血尿、血痰和鼻炎等疾病的輔助治療。又由于溶菌酶具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的功能，溶菌酶又是基因工程、細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶?？梢灶A(yù)見，溶菌酶在21世紀(jì)將對(duì)人類發(fā)揮越來越大的作用。
目前實(shí)際應(yīng)用的、業(yè)已商品化的大多是雞蛋清溶菌酶。雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4％～3.5％左右，作為溶菌酶類的典型代表，是目前重點(diǎn)研究的對(duì)象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。
在目前已公開的文獻(xiàn)中，如公開號(hào)為CN1475567A的專利文獻(xiàn)，一般是采用將蛋清用樹脂吸附，然后再用鹽溶液洗脫，接著進(jìn)行透析、鹽析、干燥的方法來制備溶菌酶，并且其干燥的方法大多是采用真空干燥或冷凍干燥，不僅干燥時(shí)間長，且干燥品的活性受影響較大，一般均在6000個(gè)單位/mg左右，且干燥后所得到的溶菌酶產(chǎn)品非均勻粉末狀，不利于做成制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的溶菌酶的制備方法，它采用封閉循環(huán)的生產(chǎn)工藝，具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收成率高，得到的溶菌酶成品活性高等特點(diǎn)，且溶菌酶生產(chǎn)線已通過了GMP認(rèn)證。
本發(fā)明的目的是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的(1)用酸調(diào)節(jié)蛋清的PH值至7.5～8.5；(2)用溶菌酶專用樹脂在樹脂缸中與該蛋清充分接觸至少1小時(shí)；(3)用濃度為3～8％，溫度為18℃～25℃，PH值為5～8的NaCl溶液浸泡至少20分鐘；(4)將混合液攪拌、冷卻，并將PH值調(diào)至8.5～10.5，在結(jié)晶缸中結(jié)晶至少10小時(shí)；(5)在壓濾機(jī)中壓濾出固體溶菌酶粗品；(6)將該粗品在溶解缸中溶解，加熱至35℃～45℃，用鹽酸將其PH值降至3.5～4.5；(7)加入適量助濾劑，攪拌后用壓濾機(jī)壓濾成溶菌酶濾液；(8)在超濾系統(tǒng)中，溫度控制在10℃～30℃，溶菌酶被超濾膜截留回到超濾缸中；(9)在超濾缸中加入適量助濾劑，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，獲得成品液；(10)調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為120℃～150℃，流量為5～30L/小時(shí)，噴霧干燥成品液，得到溶菌酶成品。
所用樹脂為生產(chǎn)溶菌酶專用樹脂，該樹脂能高效吸附雞蛋清中所含的溶菌酶(雞蛋清中溶菌酶的含量約為0.3％)，而且用鹽水洗脫容易。該樹脂由加拿大溶菌公司提供。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.采用超濾系統(tǒng)除去鹽和水，且采用聚乙砜材質(zhì)的中空纖維式超濾膜，能夠截留97％以上的溶菌酶，且可重復(fù)使用，使用周期長。
2.采用噴霧干燥的方法干燥溶菌酶，噴霧干燥塔易清洗，該噴霧干燥塔是按GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)要求設(shè)計(jì)的，生產(chǎn)出的溶菌酶符合藥用標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第六冊(cè)，生化藥品第一分冊(cè))。
3.該溶菌酶生產(chǎn)工藝具有很好的連貫性，盡可能的減少了與外界空氣的接觸，所用設(shè)備均易與清洗消毒，而且都已經(jīng)過的設(shè)備驗(yàn)證和工藝驗(yàn)證(驗(yàn)證的結(jié)果表明該套設(shè)備和工藝能夠生產(chǎn)出符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的溶菌酶)，而且也通過了GMP認(rèn)證(只有通過了GMP認(rèn)證才能允許上市銷售)。
4.同時(shí)，改進(jìn)后的工藝生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收成率高，所得到的溶菌酶活性高于20000個(gè)單位/mg。并且本發(fā)明采用封閉循環(huán)的制備工藝，對(duì)細(xì)菌的控制、滿足環(huán)保的要求均十分有利。



圖1為溶菌酶制備工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)施例步驟為1.調(diào)節(jié)蛋清的PH值將酸緩慢加入到攪拌中的蛋清中，使其PH值達(dá)到7.5～8.5。
2.樹脂吸附將蛋清泵入樹脂缸(缸中樹脂為加拿大溶菌酶公司提供的特殊樹脂吸附溶菌酶能力強(qiáng)，且溶液被鹽水洗脫)中，開啟攪拌，接觸時(shí)間為至少一小時(shí)。
3.鹽水浸泡將濃度為3～8％，溫度為18℃～25℃，PH值為5～8的NaCl溶液，泵入樹脂缸中，浸泡至少20分鐘，液體泵入結(jié)晶缸。
4.結(jié)晶將結(jié)晶缸攪拌開啟，將溶液冷卻，將液體PH值調(diào)至8.5～10.5。結(jié)晶10～20小時(shí)。
5.壓濾將上述結(jié)晶后溶液泵入壓濾機(jī)壓濾，濾出的固體物即為溶菌酶粗品。
6.溶解將粗制品投入溶解缸中，給液體加熱至35℃～45℃，用鹽酸將其PH值降至3.5～4.5，攪拌溶解。
7.壓濾在溶解缸中加入適量硅藻土(粉末狀)，攪拌后泵入壓濾機(jī)內(nèi)壓濾，濾液(為溶菌酶溶液)進(jìn)入超濾系統(tǒng)。
8.超濾接著循環(huán)超濾，溶菌酶是大分子物質(zhì)被超濾膜截留在超濾系統(tǒng)中，而NaCl是無機(jī)鹽為小分子物質(zhì)在超濾中被不斷排出。超濾時(shí)控制液體溫度在10℃～30℃。超濾至缸內(nèi)溶液的電導(dǎo)率達(dá)到10000us/cm以下(用電導(dǎo)率儀測定，電導(dǎo)率越低溶液中的含鹽量越少)，固形物濃度達(dá)到20％～30％(固形物指溶液中溶解的物質(zhì)的總質(zhì)量跟溶液總質(zhì)量的質(zhì)量比，固形物用折光儀測定)時(shí)停止超濾。
9.壓濾在超濾缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，液體進(jìn)入成品液缸。
10.噴霧干燥調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為120℃～150℃，流量為5～30L/小時(shí)。塔底收到的粉末即為溶菌酶成品。
本發(fā)明一較佳的實(shí)施例如下將鹽酸或者檸檬酸緩慢加入到攪拌中的蛋清中，使其PH值達(dá)到7.5，將蛋清泵入樹脂缸中，開啟攪拌，接觸時(shí)間為1小時(shí)。將濃度為3％，溫度為18℃，PH值為5的NaCl溶液，泵入樹脂缸中，浸泡20分鐘，液體泵入結(jié)晶缸，將結(jié)晶缸攪拌開啟，將溶液冷卻，用NaOH將液體PH值調(diào)至8.5，結(jié)晶10小時(shí)。將上述結(jié)晶后溶液泵入壓濾機(jī)壓濾，濾出的固體物即為溶菌酶粗品。將粗制品投入溶解缸中，加熱至35℃，用鹽酸將其PH值降至3.5，攪拌溶解。在溶解缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)內(nèi)壓濾，濾液進(jìn)入超濾系統(tǒng)。接著循環(huán)超濾，溶菌酶是大分子物質(zhì)被超濾膜截留在超濾系統(tǒng)中，而NaCl是無機(jī)鹽為小分子物質(zhì)在超濾中被不斷排出。超濾時(shí)控制液體溫度在10℃。超濾至缸內(nèi)溶液的電導(dǎo)率達(dá)到10000us/cm，固形物濃度達(dá)到20％時(shí)停止超濾。在超濾缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，液體進(jìn)入成品液缸。接著進(jìn)行噴霧干燥，調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為120℃，流量為5L/小時(shí)。塔底收到的粉末即為溶菌酶成品。經(jīng)檢驗(yàn)得到的溶菌酶效價(jià)為23000u/mg，PH值為3.5，干燥失重為2％(水份含量)，熾灼殘?jiān)?％(鹽份含量) (各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn))，收率為0.22％(按蛋清計(jì))。
本發(fā)明的一第二較佳實(shí)施例如下將鹽酸或者檸檬酸緩慢加入到攪拌中的蛋清中，使其PH值達(dá)到8.5。將蛋清泵入樹脂缸中，開啟攪拌，接觸時(shí)間為3小時(shí)。將濃度為8％，溫度為25℃，PH值為8的NaCl溶液，泵入樹脂缸中，浸泡30分鐘，液體泵入結(jié)晶缸。將結(jié)晶缸攪拌開啟，將溶液冷卻，用NaOH將液體PH值調(diào)至10.5，結(jié)晶20小時(shí)。將上述結(jié)晶后溶液泵入壓濾機(jī)壓濾，濾出的固體物即為溶菌酶粗品。將粗制品投入溶解缸中，給液體加熱至45℃，用鹽酸將其PH值降至4.5，攪拌溶解。在溶解缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)內(nèi)壓濾，濾液進(jìn)入超濾系統(tǒng)。接著循環(huán)超濾，溶菌酶是大分子物質(zhì)被超濾膜截留在超濾系統(tǒng)中，而NaCl是無機(jī)鹽為小分子物質(zhì)在超濾中被不斷排出。超濾時(shí)控制液體溫度在30℃。超濾至缸內(nèi)溶液的電導(dǎo)率達(dá)到7000us/cm，固形物濃度達(dá)到30％時(shí)停止超濾。在超濾缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，液體進(jìn)入成品液缸。接著噴霧干燥，調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為150℃，流量為30L/小時(shí)。塔底收到的粉末即為溶菌酶成品。經(jīng)檢驗(yàn)得到的溶菌酶效價(jià)為22500u/mg，PH值為4.3，干燥失重為2.5％(水份含量)，熾灼殘?jiān)?％(鹽份含量)(各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn))，收率為0.23％(按蛋清計(jì))。
本發(fā)明的一第三較佳實(shí)施例如下將鹽酸或者檸檬酸緩慢加入到攪拌中的蛋清中，使其PH值達(dá)到8.0。將蛋清泵入樹脂缸中，開啟攪拌，接觸時(shí)間為2小時(shí)。將濃度為6％，溫度為20℃，PH值為7的NaCl溶液，泵入樹脂缸中，浸泡25分鐘，液體泵入結(jié)晶缸。將結(jié)晶缸攪拌開啟，將溶液冷卻，用NaOH將液體PH值調(diào)至10，結(jié)晶15小時(shí)。將上述結(jié)晶后溶液泵入壓濾機(jī)壓濾，濾出的固體物即為溶菌酶粗品。將粗制品投入溶解缸中，給液體加熱至40℃，用鹽酸將其PH值降至4，攪拌溶解。在溶解缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)內(nèi)壓濾，濾液進(jìn)入超濾系統(tǒng)。接著循環(huán)超濾，溶菌酶是大分子物質(zhì)被超濾膜截留在超濾系統(tǒng)中，而NaCl是無機(jī)鹽為小分子物質(zhì)在超濾中被不斷排出。超濾時(shí)控制液體溫度在20℃。超濾至缸內(nèi)溶液的電導(dǎo)率達(dá)到8000us/cm，固形物濃度達(dá)到25％時(shí)停止超濾。在超濾缸中加入適量硅藻土，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，液體進(jìn)入成品液缸。接著噴霧干燥，調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為130℃，流量為20L/小時(shí)。塔底收到的粉末即為溶菌酶成品。經(jīng)檢驗(yàn)得到的溶菌酶效價(jià)為24000u/mg，PH值為3.8，干燥失重為3％(水份含量)，熾灼殘?jiān)?.4％(鹽份含量)(各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn))，收率為0.22％(按蛋清計(jì))。
權(quán)利要求
1.溶菌酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用酸調(diào)節(jié)蛋清的PH值至7.5～8.5；(2)用溶菌酶專用樹脂在樹脂缸中與該蛋清充分接觸至少1小時(shí)；(3)用濃度為3～8％，溫度為18℃～25℃，PH值為5～8的NaCl溶液浸泡至少20分鐘；(4)將混合液攪拌、冷卻，并將PH值調(diào)至8.5～10.5，在結(jié)晶缸中結(jié)晶至少10小時(shí)；(5)在壓濾機(jī)中壓濾出固體溶菌酶粗品；(6)將該粗品在溶解缸中溶解，加熱至35℃～45℃，用鹽酸將其PH值降至3.5～4.5；(7)加入適量助濾劑，攪拌后用壓濾機(jī)壓濾成溶菌酶濾液；(8)在超濾系統(tǒng)中，溫度控制在10℃～30℃，溶菌酶被超濾膜截留回到超濾缸中；(9)在超濾缸中加入適量助濾劑，攪拌后泵入壓濾機(jī)壓濾，獲得成品液；(10)調(diào)節(jié)噴霧干燥塔的進(jìn)風(fēng)溫度為120℃～150℃，流量為5～30L/小時(shí)，噴霧干燥成品液，得到溶菌酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的酸是檸檬酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的酸是鹽酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述助濾劑是硅藻土。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種溶菌酶的制備方法，具體步驟是(1)調(diào)節(jié)蛋白液的pH值至7.5～8.5；(2)用專用樹脂吸附；(3)鹽水浸泡；(4)結(jié)晶；(5)一次壓濾；(6)溶解；(7)二次壓濾；(8)超濾；(9)三次壓濾；(10)噴霧干燥。該工藝流程容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且能夠容易地控制質(zhì)量；同時(shí)具有工藝生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收成率高等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明采用封閉循環(huán)的制備工藝，對(duì)細(xì)菌的控制、滿足環(huán)保的要求均十分有利；本發(fā)明所得產(chǎn)品符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)C12N9/36GKCN1844379SQ200610025605
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月11日
發(fā)明者王蘇南, 張?zhí)K閩, 董佳麗, 王顯樑, 徐軍軍 申請(qǐng)人:上海實(shí)業(yè)聯(lián)合集團(tuán)長城藥業(yè)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan