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      抗壞血酸在誘導多能干細胞制備和胚胎干細胞培養(yǎng)的應用的制作方法

      文檔序號:572398閱讀:1501來源:國知局

      專利名稱::抗壞血酸在誘導多能干細胞制備和胚胎干細胞培養(yǎng)的應用的制作方法
      技術領域
      :本法明涉及再生醫(yī)學研究領域,特別涉及改進誘導多能干細胞的制備方法以及改善胚胎干細胞的培養(yǎng)方法及其應用。二,
      背景技術
      :胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESCs)來自晡乳動物早期胚胎的內(nèi)細胞團,在體外培養(yǎng)中能夠在t]我更新(self-renewal)的同時保持多能性(pluripotency〉和向不同組織細胞分化。1981年隨著小鼠胚胎干細胞的首次分離成功(EvansandKaufman,1981;Martin,1981),胚胎干細胞研究拉開序幕。直到1998年,人的胚胎千細胞得到分離和建立(JamesA.Thomson1998),標志著再生醫(yī)學研究的真正開始。隨后多年的研究集中在兩大方面,一是研究胚胎干細胞在自我更新的同時保持多能行的分子機理,同時不斷完善不同物種的胚胎干細胞的培養(yǎng)以及建立新的哺乳動物胚胎千細胞;二是建立胚胎干細胞向特定組織細胞的分化方法并研究分化的分子機理。前一方面的標志性事件包括,以Nanog-0ct4-Sox2轉錄因子為核心的調(diào)控網(wǎng)絡的闡明(Jongh畫Kim2008;XiChen2008);LIF(HitoshiNiwa1998)/BMP4(QiLongYing2003)/FGF4(TiloKunath2007)信號傳導通路的闡明,并因此發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞的基態(tài)(groundstate)培養(yǎng)方法(QilongYingetal,2008)。后一方面,利用小鼠和人胚胎干細胞進行的分化研究已經(jīng)在包括神經(jīng)細胞,心肌細胞,胰島細胞,血細胞等多種體外分化過程中得到成功結果,與此同時,也建立了這些分化過程的成熟方法和分子檢測標準,同時大大推動了胚胎干細胞或成體千細胞分化的分子機理研究。以上兩個方面的研究相對獨立但又相輔相成。在以小鼠胚胎千細胞為核心材料的機理和應用研究快速進展的同時,如何獲得作為再生醫(yī)學研究的關鍵材料一人胚胎干細胞,尤其是來自病人自身的胚胎干細胞一直以來都面臨著巨大的技術困難和倫理爭議。直到2006年,日本京都大學Ya腿naka研究小組在小鼠中初步實現(xiàn)了誘導重編程過程。他們采用體外基閃轉染技術,從24個因子中篩選出0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子,通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄岡子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞,在小鼠ES細胞的培養(yǎng)條件下獲得了Fbxl5+的多潛能干細胞系,該細胞系在細胞形態(tài)、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小KES細胞非常相似,而在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞,故將其命名為誘導的多能性干細胞(inducedpluripotentstemceil,iPScell)(TakahashiK2006)。次年,同一個實驗室進一步用Nanog代替Fbxi5進行篩選,得到了Nanog+的iPS細胞系,該iPS細胞不僅在細胞形態(tài)、生長特性、標志物表達、移植到小鼠皮下可形成包含3個胚層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似,而且在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面也與小鼠ES細胞幾乎完全相似。此外,研究還發(fā)現(xiàn)重新激活原癌基因c-Myc是嵌合體動物出現(xiàn)腫瘤形成的原因;而轉染的上述4個基因在iPS細胞中并沒有表達,表明這些基因只在誘導過程中起作用,iPS細胞保持多潛能性狀態(tài)的原因是內(nèi)源性轉錄因子,如Nanog等基因的表達(0kitaK2007)。同時,來自美國科學家的研究工作同樣證實了上述4個轉錄因子足以使小鼠成纖維細胞在體外誘導重編程為類似小鼠ES細胞的iPS細胞(WernigM2007)?;谕瑯踊蝾愃频乃悸?,同年(2007年)晚些時候,人的iPS細胞建立獲得成功(TakahashiK2007;YuJ2007)。隨后的研究進一步利用人類皮膚活檢組織中提取的體細胞成功誘導為iPS細胞(ParkIH2008),這充分證明了利用這種方法制備患者特異性的干細胞是可行的,因而有望克服細胞異體移植治療中存在的免疫排斥反應以及避免傳統(tǒng)方法帶來的倫理爭議。在最近一年的研究工作中,圍繞iPS的兩大根本問題,即效率低下和安全問題,已經(jīng)在不斷取得突破。雖然有利用非整合型質(zhì)?;虻鞍踪|(zhì)進行重編程的報道(YuJ2009;ZhouH2009),然而歸根結底,iPS的效率低下始終對于其發(fā)展和應用都將是巨大的障礙。與此類似,胚胎千細胞的體外長期穩(wěn)定的培養(yǎng),不僅是一個關鍵技術問題,同時又是一個重要的基礎研究領域。如何建立一個成分明確并盡量簡單,易于操作的胚胎干細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法,一直以來都備受關注。因此,本發(fā)明提供了利用抗壞血酸或其衍生物進行體細胞誘導重編程以及胚胎干細胞培養(yǎng)的方法。三,
      發(fā)明內(nèi)容共兩部分內(nèi)容,第一部分,為了提高產(chǎn)生小鼠和人iPS細胞的效率,本發(fā)明提供了利用抗壞血酸或其衍生物作為主要添加成分用于產(chǎn)生iPS細胞的具體方法以及應用。具體方法包括以下步驟(1)將一個或多個干細胞多能性W子導入體細胞;(2)用本發(fā)明提到的添加抗壞血酸或其衍生物的胚胎干細胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)(1)中經(jīng)導入的體細胞,將體細胞誘導重編程為iPS細胞;(3)利用內(nèi)源報告基因激活表達或形態(tài)觀察初步確定(2)中形成克隆的狀態(tài);(4)挑出符合(3)條件的單克隆,即內(nèi)源報告基因激活或克隆呈現(xiàn)胚胎干細胞在相同培養(yǎng)基中生長的形態(tài);(5)利用含有抗壞血酸的胚胎干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(4)中的單克隆細胞;(6)利用多種檢測手段,鑒定(5)中單克隆細胞的狀態(tài)是否達到類似胚胎下細胞的狀態(tài),主要包括定量PCR分析干細胞特異基因表達,分析體內(nèi)自發(fā)分化形成畸胎瘤的能力,對于非人iPS細胞,檢測嵌合能力,是否有生殖細胞轉移(germlinetransmission^涉及利用抗壞血酸或其衍生物為主要添加劑高效產(chǎn)生iPS的應用有兩個方面,一,研究iPS形成的分子機理;二,篩選新的能夠顯著改變iPS進程的化合物或因子。第二部分,為了改善小鼠和人胚胎干細胞的體外連續(xù)培養(yǎng),本發(fā)明提供了利用抗壞血酸或其衍生物作為主要添加成分用于小鼠,猴和人胚胎干細胞的培養(yǎng)方法以及應用。當前標準的胚胎干細胞培養(yǎng)方法,主要有兩大類。對于使用血清的胚胎干細胞培養(yǎng)基,如小鼠和猴胚胎干細胞的培養(yǎng)基,簡單地額外添加抗壞血酸可以顯著改善胚胎干細胞的自我更新狀態(tài);對r無血清胚胎干細胞培養(yǎng)基,目前國際較公認的培養(yǎng)基有使ffl血清替代物(KSR)或其他多種添加成分(如TeSR)的胚胎干細胞培養(yǎng)基,這些培養(yǎng)基已經(jīng)含有抗壞血酸,無須額外添加;但對于其他類型即將開發(fā)的無血清干細胞培養(yǎng)基,添加抗壞血酸有利于胚胎干細胞的自我更新狀態(tài)和多能性維持。因此本發(fā)明第二部分內(nèi)容針對范疇是以血清為主要成分的胚胎干細胞培養(yǎng)基以及不含KSR或TeSR的其他新型無血清培養(yǎng)基。涉及利用抗壞血酸或其衍生物為主要添加劑改善胚胎干細胞的自我更新狀態(tài)的應用有兩個方面,一,研究胚胎干細胞維持自我更新和多能性的分子機理;二,篩選新的能夠顯著影響胚胎干細胞自我更新禾I多能性的化合物或因子。四,圖1,VC顯著提高0G2小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的誘導重編程效率。在以血清為基礎的小鼠iPS實驗中,與其他抗氧化劑(維生素Bl,VB1;N-乙酰半胱S:酸,NAC;還原型谷胱甘肽,Gmee;亞硒酸鈉,Sel)相比,VC顯著提高經(jīng)典四因子SKOM(Sox2,0ct4,Klf4和cMyc)和三因子SK0(Sox2,0ct4和Klf4)的iPS效率(iPS效率以流式細胞儀分別檢測四因子第9天以及三因子第16天轉基因0ct4啟動子驅動的GFP基H表達效率)。圖2,用添加有VC的血清胚胎干細胞培養(yǎng)基制備的iPS克隆具有與胚胎干細胞相似的多能性。(A)用mES+乂(:培養(yǎng)基制備的不同小鼠13克隆細胞內(nèi)源胚胎干細胞標記基因的表達用實時定量?0檢測結果與小鼠胚胎干細胞系Rl基本一致;(B)不同小鼠iPS克隆細胞胚胎干細胞標記基因Nanog啟動子甲基化水平檢測結果丄jRl—致,顯著低于iPS初始細胞MEF(黑色實心圈代表該位點甲基化,空心圈代表去甲基化);(C)這些iPS克隆細胞具有多能性,分別體現(xiàn)在在裸鼠畸胎瘤實驗中能夠形成內(nèi)(腺體),中(骨骼),外胚層(皮膚)細胞,以及形成嵌合小鼠(藍色胚胎來自0G2小鼠的lacZ轉基因染色)。圖3,其他抗壞血酸衍生物對小鼠iPS的影響。與對照相比,抗壞血酸(LM),穩(wěn)定型衍生物抗壞血酸磷酸酯(ASCP)均能顯著提高四因子和三因子iPS效率,但是氧化型抗壞血酸(DHA)則對iPS無顯著影響。圖4,VC促進iPS前體細胞(pre-iPScells)向完全iPS細胞(full-iPScells)的轉變。(A)MEFiPS前體細胞C2,C4和C5用含有VC的培養(yǎng)基處理9代后GFP陽性率顯著提高,而對照組不加VC的GFP陽性率持續(xù)很低;(B)C2和C4加VC處理后的克隆形態(tài)和GFP熒光情況比較相同代數(shù)的未處理對照細胞更加接近mES細胞。圖5,VC有利TiPS細胞維持自我更新狀態(tài)。。(A)iPS細胞在含VC培養(yǎng)基中能更好的維持0ct4-GFP的表達;(B)iPS細胞在含VC培養(yǎng)基中能更好維持胚胎干細胞形態(tài)和GFP克隆比例。圖6,WJ添加有VC的培養(yǎng)基制備的人iPS細胞形態(tài)人ESC沒有明顯區(qū)別。(A)人成體細胞形態(tài)(B,C)以VC為主耍添加劑制備的人iPS克隆AP染色及形態(tài)圖;(D)人iPS克隆在無滋養(yǎng)層培養(yǎng)的形態(tài)圖。圖7,用添加有VC的培養(yǎng)基制備的iPS的效率比較其他經(jīng)典或己報道的培養(yǎng)基顯著提高。在圖示中的二次獨立實驗中,以AP染色陽性克隆數(shù)為指標(縱坐標)衡量不同培養(yǎng)基,包括單純血清(DFBS),血清加以VC為主的抗氧化劑(DFBS+A),單純血清替代物(KSR),以及血清加丙戊酸(VPA),結果顯示,DFBS+A得到的AP陽性iPS效率顯著高于其他培養(yǎng)基,值得注意的是,該組合甚至高于目前國際己報道的顯著提高人iPS效率的VPA。圖8,含有VC的培養(yǎng)基用于細胞因子對小鼠iPS效率影響的篩選。相比經(jīng)典的mES培養(yǎng)基,添加以VC為主的抗氧化劑(A)培養(yǎng)基更有利于細胞因子對iPS影響的篩選。具體體現(xiàn)在在mES中沒有顯著差異的bFGF在mES+A中顯著提高iPS效率。五,具體實施方案定義和技術除非另外指明,本發(fā)明的實踐將使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、免疫學和重組DNA的傳統(tǒng)技術,其屬于本領域技術范圍。參見例如,Sambrook,F(xiàn)ritsch和Maniatis,分子克隆實驗指南,第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人編著(1987));叢書METHODSINENZYM0L0GY(AcademicPress,Inc.):■PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D,Hames和G.R.Taylor編著,(1995)),Harlow和Lane編著,(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUALandANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney編著,(1987));W.FrenchAnderson等人,HANDBOOKOFSTEMCELLS,巻2。除非另外說明,本文中所用的術語均具有本領域技術人員常規(guī)理解的含義,為了便于理解本發(fā)明,將本文中使用的一些術語進行了下述定義。在說明書和權利要求書中使用的,單數(shù)型"一個",和"這個"包括復數(shù)參考,除非上下文另有清楚的表述。例如,術語"(一個)細胞"包括復數(shù)的細胞,包括其混合物。所有的數(shù)字標識,例如pH、溫度、時間、濃度和分子量,包括范圍,都是近似值。要了解,雖然不總是明確的敘述所有的數(shù)字標識之前都加上術語"約"。也要了解,雖然不總是明確的敘述,本文中描述的試劑僅僅是示例,其等價物是本領域已知的。本文所述的抗壞血酸添加到培養(yǎng)基中的濃度在lug/ml—200ug/ml范圍內(nèi)。本文所述的"抗壞血酸衍生物"是指結構類似抗壞血酸,具有抗氧化活性的類似化合物。這些化合物在保持抗壞血酸生物活性的同時,具有更加穩(wěn)定或更加易于被細胞吸收的特征。本文所述的"誘導的多能性干細胞(iPS細胞)"是這樣的細胞,其來源是體細胞通過誘導體細胞重編程的干細胞多能性因于體外誘導變化而成,其在ES細胞培養(yǎng)條件下,與ES細胞在細胞形態(tài)、生長特性、衷面標志物表達、移植到皮下可形成包含3個胚層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似,而且在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面也與小鼠ES細胞兒乎完全相似。本文中所用的術語"體細胞"是相對于"生殖細胞"以及"胚胎干細胞"而言的概念,其是由"胚胎干細胞"分化產(chǎn)生的不再具有多能性,而是具有某一具體功能的細胞,其是由"胚胎干細胞"分化或內(nèi)細胞團繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生的不再具備多能性,一般具有具體功能的細胞,其一般從發(fā)育階段位于囊胚期(在小鼠中具體為受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材,取材時一般避免取到可能具有多能性的生殖細胞及其來源(如精原干細胞、生殖嵴干細胞等)。本文中所用的體細胞優(yōu)選來源于哺乳動物,更優(yōu)選來源于人、猴、狗、貓、大鼠或小鼠,最優(yōu)選地,來源于小鼠。本文中的體細胞可以是機體內(nèi)任何類型的體細胞,優(yōu)選為成纖維細胞或腦膜細胞。本文所述的"誘導體細胞重編程的干細胞多能性岡子"為對于干細胞多能性維持關鍵的W子,通過向體細胞中導入所述因子可以在一定條件下誘導體細胞重編程為胚胎干細胞。迄今為止眾多文獻已經(jīng)報道了多個可以用于重編程的這樣的因子,參見例如Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D.DirectgenerationofES-likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.CeW_researc/z17,959-962(2007)、Okita,K.,Ichisaka,T.&Yamanaka,S.Generationofgermline-co即etentinducedpluripotentstemcells.船tore448,313-317(2007)、Wernig,M.等人InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate.jVature448,318-324(2007)、Y咖anaka,S.Strategiesandnewdevelopmentsinthegenerationofpatient-specificpluripotentstemcells.OW^柳CWi1,39-49(2007)等等。本領域技術人員已知多種可以用于這樣的干細胞多能性因子。優(yōu)選地,所述的多能性因子包括0ct4、Sox2(任選地,Soxl)、C-myc(任選地L-Myc或N-Myc),以及K丄f4(任選地,Klf5或Klf2)、Esrrb、Nanog、以及Lin28。上述多能性因子可以根據(jù)所要導入的細胞而是任何來源的,優(yōu)選為小鼠的多能性因子以及其變體,如Sox2,NCBI登錄號為NM一011443.3(小鼠包含SRY-框的基因2);0ct4,NCBI登錄號為NM—013633.2(小鼠POU結構域,5類,轉錄因子1(Pou5f1));Klf4,NCB1登錄號為NM_010637.2(小鼠Kruppel-樣因子4));c-Myc,NCBI登錄號為NM—010849.4(小鼠髓細胞瘤病癌基因(myelocytomatosisoncogene)(c-Myc));Soxl,NCBI登錄號為NM—009233.3,(小鼠包含基因1的SRY-框);Klf2,NCBI登錄號為NM—008452.2,(小鼠Kruppel-樣因子2(肺));Klf5,NCBI登錄號為NM_009769.4,(小鼠Kruppel-樣因子5);Nanog,NCBI登錄號為NM—028016;或者Lin28,NCBI登錄號為,—145833。C-Myc還可以被換為其突變體L-myc(登錄號為NM_008506.2,小鼠viyc髓細胞瘤病病毒愛基因同源物lv,肺癌來源的(禽類)((Mycll)));或者N-Myc(登錄號為NMJ)08709.3,小鼠v-myc髓細胞瘤病病毒相關癌基因,祌經(jīng)母細胞瘤衍生的(禽類)(Mycn)。本文所述的術語"誘導重編程"(有時也僅被簡化為"誘導")是指將體細胞去分化為多能性干細胞的過程。優(yōu)選地,通過將維持干細胞多能性所需的多能性因子cDNA導入體細胞可以誘導體細胞去分化成為多能性T細胞(TakahashiK,YamanakaS.Cell.2006:126:663-676;WernigM,MeissnerA,ForemanR,等人,Nature.2007;448:318-324;YuJ,VodyanikMA,Smuga-OttoK等人Science.2007;318:1917-1920)。其中,優(yōu)選地,所述的多能性因子包括0ct4、Sox2(任選地,Soxl)、C-myc(任選地L-Myc或N-Myc)、Klf4(任選地,Klf5或Klf2)、Nanog、以及Lin28中的一個或多個。將所述干細胞多能性因子cDNA導入體細胞的方法可以是本領域技術人員熟知的多種技術,包括病毒感染、脂質(zhì)體轉染、轉座子介導的插入表達、穿膜蛋白、藥物誘導、電穿孔、粒子轟擊等各種將DNA轉入細胞的方法。優(yōu)選地,使用包含cDNA的病毒載體進行轉染,所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體等多種病毒載體。優(yōu)選地逆轉錄病毒載體(例如pMX載體),如實施例中所述的。木文所述的"適宜細胞生長的條件"是木領域的常規(guī)干細胞培養(yǎng)條件,并且包括一些適宜各個具體細胞系,但是不影響細胞基本性質(zhì)的修飾,培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件參見W.FrenchAnderson等人,HANDBOOKOFSTEMCELLS,巻2。本文所述的報告基因是指能夠指示細胞通過外加誘導巳經(jīng)轉變?yōu)轭愃婆咛ジ杉毎碾A段,包括利用轉基因或同源重組手段加入一段表達熒光蛋白基因或者特種針對普通哺乳動物細胞的抗生素抗性基因序列,這段序列處在胚胎干細胞特異表達的一些基因的啟動子的控制下,故而可以在細胞到達類似胚胎干細胞狀態(tài)時激活這段熒光蛋白或抗性基因的表達,從而使這個細胞具有某些可以被檢測的性狀特征(如發(fā)出綠色熒光或在含有特殊抗生素培養(yǎng)基中能夠生長)而區(qū)別于其他未重編程至該狀態(tài)的細胞。本領域技術常用的報告基因包括綠色熒光蛋白,抗性基因例如P-geo抗性基因等。本領域的技術人員可以根據(jù)細胞的培養(yǎng)條件和用途選擇適合于各種實施方案的報告基因。參考例如YoungIIYeoni等人,GermlineregulatoryelementofOct-4specificforthetotipotentcycleofembryonalcells,Development122,000-000(l艦),PrintedinGreatBritain,ThecompanyofBiologistsLimitedl線881-894頁;Shin-yaHatano等人,PluripotentialcompetenceofcellsassociatedwithNanogactivation,MechanismsofDevelopment122(2005),67-79。本文所述的檢測細胞多能性的方法是本領域技術人員熟知的,參見例如Yamanaka,S.Strategiesandnewdevelopmentsinthegenerationofpatient-specificpluripotentstemcells.CellStemCell1,39-49(2007)等。所述方法包括鑒定多能性分子標記的表達、細胞的甲基化狀態(tài)檢測、胚胎小體EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用經(jīng)誘導的多能性干細胞形成嵌合鼠等等。本文所述的"嵌合鼠"是通過本領域普通技術人員熟知的"嵌合鼠"技術實施的。是指將胚胎干細胞或通過本文技術獲得的iPS細胞注射入小鼠囊胚中,使得其與所注射入小鼠的囊胚中的胚胎細胞混合,共同在代孕母鼠中的子宮內(nèi)生長發(fā)育,小鼠出生后全身上下的各個組織即由兩種胚胎細胞共同混合組成,如馬賽克拼圖樣,這樣的小鼠被稱為嵌合鼠(EvansMJ,等人;TheabilityofEKcelltoformchimerasafterselectionofclonesinG418andsomeobservationontheintegrationofretroviralvectorproviralDNAintoEKcells[M];ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology;1985年;XianMW,WuBY,HuXL,ShangKG,WuHL,1996.ConstructionofchimericmiceofEScellsbymicroinjectionmethod.Hereditas(北京)18(1):7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是檢驗iPS是否與胚胎干細胞具有類似性質(zhì)的最直接和最關鍵的證據(jù)。本文所述的"篩選化合物或因于"是指通過對報告基因表達或者細胞本身特性改變?nèi)缧螒B(tài)接近ESC作為檢測指標,篩選1,對iPS效率有顯著影響的化合物或因子;2.能夠取代誘導iPS過程所需的某個或全部因子的化合物或因子。"因子"指不同類型的生物人分子,如細胞激動素(cytokine),基因,siRNA,microRNA等。本領域技術人員已經(jīng)開發(fā)了利用iPS過程來篩選化合物的方法,參見例如1,YanShi等人,2008年,InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicFibroblastsby0ct4andKlf4withSmall—MoleculeCompounds,CellStemCell3,568-574;2'CALyssiotis等人,2009年,RcprogrammingofmurinefibroblaststoinducedpluripotentstemcellswithchemicalcomplementationofKlf4.PNAS106(22),8912—7。實施例下列實施例舉例了發(fā)明人的標準實驗室實踐,用于示例本發(fā)明的模式,而不應將本發(fā)明理解為限定于這些實施例的范圍。這些實施例。根據(jù)本文公開和本領域技術人員的普遍水平,技術人員將理解下列僅用于示例,可以在不超過本發(fā)明的范圍內(nèi)進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術,除非特別說明,均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個領域的常規(guī)技術。本發(fā)明中所用技術概述除了特別說明,本文中提及的各種物質(zhì)均來自英杰生命科學公司(Invitrogen)包裝反轉錄病毒以及誘導iPS細胞從Addgene公司購置包含小鼠0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反轉錄病毒載體(pMXs)。按照現(xiàn)有技術進行病毒的產(chǎn)生和感染(Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D.DirectgenerationofES-likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.Cellresearch17,959-962(2007);Qin,D.等人MousemeningiocytesexpressSox2andyieldhighefficiencyofchimerasafternuclearr印rogrammingwithexogenousfactors.JBiolChem283,33730-33735(2008).)簡言之,利用常規(guī)方法將這些質(zhì)粒轉染到PlatE細胞中。48小時后收集病毒上清液并且過濾,以感染MEF,其中補充有1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物。在第二天重復相同的歩驟。添加病毒上清液的當天被定義為第0天(D0)。將病毒感染后(即己經(jīng)轉染了Sox2、Klf4、0ct4和/或c-Myc,下文中,如無特殊說明,3因子感染代表用Sox2、Klf4和0ct4感染,4因子感染代表用Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc感染)的成纖維細胞培養(yǎng)在mES培養(yǎng)基中,在感染后13-15天(4因子感染實驗)或23-25(3因子感染實驗)挑取iPS集落,這是基于0ct-GFP(即在熒光顯微鏡下發(fā)射熒光的集落)和典型的ES形態(tài)來挑取的。隨后如ES細胞樣延展和保持挑取的集落(如上所述Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D,2007;以及Q丄n,D.等人,2008)。重編程效率的定量用于定量重編程效率的主要方法有1,直接利用流式細胞儀對D9-10天的四因子SK0M或D15-16天的三因子iPS測定0ct3/4-GFP陽性細胞比例;2,在感染原盤或孔中(未分到滋養(yǎng)層細胞上)計數(shù)0ct3/4-GFP陽性克隆數(shù);3,將感染后的細胞以確定細胞數(shù)分到滋養(yǎng)層細胞上,培養(yǎng)一定時間后,AP染色,計數(shù)AP陽性克隆和0ct3/4"GFP陽性克隆。iPS細胞的表征進行堿性磷酸酶和免疫熒光染色(如上所述Qin,D.,Li,W.'Zhang,J.&Pei,D,2007;以及Qin,D.等人,2008)。使用下列一抗小鼠抗-0ct4(SantaCruz公司)、小鼠抗-SSEA1(Abeam公司),小鼠抗-Nanog(Abeam公司)。實施例1:利用VC提高小鼠iPS效率。a,將四因子(SKOM)或三因子(SKO)的病毒以等體積混合(每種病毒lml)后感染到12孔板的一孔中共計2.0萬個OG2小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中,在37度5%C02培養(yǎng)在mES培養(yǎng)基中。從兩次感染結束后D2天起,添加VC或其他化合物(VC,50ug/ml;Vbl,9ug/ml;NAC,線GMEE,1.5ug/ml;Selenite,20nM;抗氧化劑混合物Antiox,即VC+Vbl+GMEE+Selenite);對四因子,D9-10天消化,對三因子,D15-16天消化,流式檢測GFP陽性細胞比例。如圖1所示,與對照組相比,添加VC或含有VC的多種抗氧化劑均顯著提髙SKOM和SKO的iPS效率。b,如上所述,將三因子SKO—iPS細胞分到滋養(yǎng)層細胞上,繼續(xù)用含VC或含VC的抗氧化劑的mES培養(yǎng)基(Vc,50ug/ml)培養(yǎng),10-14天后挑出GFP陽性的mESC形態(tài)的克隆,這些細胞經(jīng)過去除滋養(yǎng)層細胞,使用Trizol(Takara公司)試劑,按照制造商說明提取總RNA。用M-MLV(Takara公司)試劑盒進行逆轉錄,并使用SYBRSPremixExTaq試劑盒(Takara公司),ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)進行Real-TimePCR。所有上述PCR條件均使用常規(guī)PCR條件,按照制造商說明進行。其中鑒定iPS各標志物使用引物列表如表l所示。表l,RT-PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如閣2-A所示,使用本申請的方法獲得的iPS表達較高水平與mESC細胞Rl—致的多能性因子Nanog和Rexl,而這些因子在原始MEF細胞中均沒有可檢測到的表達。c,根據(jù)制造商的說明,使用CpGenome修飾試劑盒(Cheraicon公司)進行亞硫酸氫鹽處理。處理過程中使W的Nanog啟動子的PCR引物見下表2。將上述PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T(Takara公司)載體中,隨機選擇克隆用于對每個基因測序,所述測序用M13正向和M13反向引物。表2:PCR所用引物SEQIDNO:引物名稱F:正向;R反向引物序列SEQIDNO:19mffenogUMTGTTTATGGTGGATTTTGTAGGTSEQIDNO:20mNanogLCCCACACTCATATCAATATMTMC圖2-B中顯示iPS克隆與R1中內(nèi)源性Nanog啟動子區(qū)域沒有甲基化,而MEF細胞中,上述基因組區(qū)域均呈現(xiàn)相對高度甲基化。也就是說,經(jīng)過誘導重編程的iPS細胞中,內(nèi)源性多能性干細胞因子Nanog的啟動子區(qū)去甲基化,從而其表達得以被激活。d,將消化重懸在PBS中的2百萬iPS克隆細胞注射到裸鼠腋下,經(jīng)過2-3周,解剖裸鼠取出腫瘤,同定,包埋,切片,HE染色觀察畸胎瘤分化情況。如閣2-C所示,iPS細胞成功分化為三個胚層的不同組織細胞,如外胚層的皮膚,中胚層的骨骼,以及內(nèi)胚層的腺體。e,將消化重懸在培養(yǎng)基中的iPS細胞注射到ICR小鼠囊胚中的內(nèi)細胞團中進行嵌合實驗,在E12-16天解剖母鼠,對胚胎進行beta-半乳糖酐酶染色,結果如圖2-C顯示,iPS細胞成功嵌合到皮膚組織中。實施例2:利用VC促進小鼠iPS前體細胞向完全iPS細胞的轉化。ffl經(jīng)典的mES培養(yǎng)基誘導產(chǎn)生的多數(shù)四因子SK0M—iPS克隆沒有GFP表達,初步顯示這些細胞沒有最終達到完全iPS細胞的狀態(tài)。我們將這些克隆挑出并連續(xù)傳代,如圖4所示,經(jīng)過5-9代VC處理,約3/4的克隆出現(xiàn)明顯的GFP表達。這些克隆的形態(tài)也明顯接近mESC細胞,而這些克隆在經(jīng)典mES培養(yǎng)基中連續(xù)傳代導致其喪失mESC形態(tài)。因此,VC對iPS的促進作用至少一部分體現(xiàn)在將多數(shù)前體iPS細胞轉化為完全iPS細胞。實施例3:利用VC維持小鼠iPS細胞穩(wěn)定傳代。與實施例2類似,我們挑取GFP陽性的iPS克隆,體外以經(jīng)典mES培養(yǎng)基以及加VC的培養(yǎng)基分別連續(xù)傳代,經(jīng)過約5代,如圖5所示,在經(jīng)典mES培養(yǎng)基中,iPS克隆熒光顯著喪失,同時克隆也喪失mESC形態(tài);而加冇VC的培養(yǎng)基可以相對穩(wěn)定的維持iPS的GFP熒光表達以及細胞的mESC形態(tài)。這說明VC能夠維持小鼠iPS細胞的mESC狀態(tài)。實施例4,VC提高人iPS效率。a,細胞的制備和培養(yǎng)由外科手術廢棄物中分離人體組織,培養(yǎng)得到原代細胞,用高葡萄糖DMEM(Dulbcco'sModifedEagleMedium)培養(yǎng)基(4.5g/L的葡萄糖,HyClone公司)培養(yǎng)所得到的細胞,培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清(HyClone公司)、非必需氨基酸(NEM,1%)、2mML-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100ug/ml)。在多能干細胞誘導過程中使用DFBS(defined-FBS)培養(yǎng)基和DFBS+A(以VC為主的抗氧化劑組合混合物,詳情如下所述)培養(yǎng)基。所述的DFBS+A培養(yǎng)基包含高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基,20。/。特級胎牛血清(DefinedFBS,Hyclone),4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、青霉素/鏈霉素、1%L-谷氨酰胺、0.1mM0-巰基乙醇和1%非必需氨基酸(NEM);所述的DFBS+A培養(yǎng)基為在DFBS基礎上添加如下三種組ih50ug/mlVC,9ug/ml維生素(VB1),10uM還原型谷胱甘肽。將人胚胎干細胞(hES)和用于擴增的誘導的多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,iPS細胞)培養(yǎng)在用絲裂霉素(10ug/ml)處理的MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)上,并且培養(yǎng)在KSR培養(yǎng)基中DMEM/F12(HyClone公司),20%血清替代物(KSR,Invitrogen公司),4ng/mlbFGF、青霉素/鏈霉素、1%L-谷氨酰胺、0.1raM0-巰基乙醇和1%非必需氨基酸。b,病毒感染人體細胞根據(jù)實施例1所述的方法,在p6孔培養(yǎng)板中按每孔約6X1()4個細胞接種人的人體細胞,在37°C、5免C02的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜,用收集的病毒上清液感染培養(yǎng)的人體細胞。所述病毒上清液是通過用包含人0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反轉錄病毒pMX載體(Addgene)按常規(guī)方法轉染293T細胞(Lipofectamine2000,Invitrogen)獲得的(參見Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆實驗指南,第3版(2002))。c,感染細胞的繼續(xù)培養(yǎng)和克隆篩選在感染后第2天,將感染后的人體細胞的培養(yǎng)基,替換為實施例1中所述的DFBS+A培養(yǎng)基,在37°C、5%C02的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天,每天更換一次培養(yǎng)基,用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)于37'C消化為單細胞懸液,將消化后的細胞按每培養(yǎng)皿約10000個細胞的密度接種到100mm培養(yǎng)皿中,所述培養(yǎng)皿按a中描述的方法,預先用滋養(yǎng)層細胞包被。接種后的細胞在37°C、5%C02的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天,顯微鏡檢可見hESC樣克隆(如圖6所示),其中A為人體細胞感染SKOM前的形態(tài),B為人體細胞在感染SKOM后26天在滋養(yǎng)層上形成典型的hES樣克隆形態(tài);C為人體細胞hiPS克隆挑取至新的滋養(yǎng)層上傳代擴增仍保持很好的hESC樣形態(tài),該圖為傳代2代后的形態(tài),使用KSR培養(yǎng)基;D是人體細胞hES樣克隆在Matrigel預包被的6孔平板上生長形態(tài),此處所用培養(yǎng)基為mTeSRTMl。使用玻璃針分割邊緣光滑,細胞核清晰,人胚胎干細胞樣的單個克隆(見圖6-C),然后用玻璃管吸取這些分割開的克隆接種到12孔板的單個孔中,每個孔接種一個ES樣克隆,一共挑取12個。所述12孔板按a中描述的方法,預先用滋養(yǎng)層細胞包被。接種后的細胞在KSR培養(yǎng)基中,37'C、5免C02的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。這些挑取出的克隆具有典型的hES致密形態(tài),在12孔板培養(yǎng)一周后,每孔選擇部分克隆進行AP染色,結果為100%AP染色陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。挑取部分hES樣克隆后將剩余100mm培養(yǎng)皿AP染色,計數(shù)AP陽性克隆數(shù)目,第7天時向IOO咖培養(yǎng)皿共種下10000個SKOM感染的人體細胞,計算誘導iPS細胞效率如圖7所示;AP染色后,依據(jù)克隆形態(tài)及AP結果對hES樣的克隆計數(shù),我們這種加VC的方法的總體效率為大約2.2%,與傳統(tǒng)用KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)的0.O廣O.02%的效率相比超過100倍,與本實驗中設置的DFBS和KSR對照相比效率提高超過70倍。實施例5:利用含有VC的培養(yǎng)基篩選能夠顯著影響iPS的化合物或細胞因子。由于小鼠三因子iPSGFP效率在D15-16天大大高于四因子D9-10天效率,我們將感染S、K、O三因子的iPS細胞分別加入要篩選的不同細胞因子,包括表皮生長因子(EGF,20ng/ml),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,10ng/tnl),肝細胞生長因子(HGF,10ng/ml),胰島素(insulin,10ug/ml),D16天流式檢測GFP陽性細胞比例,結果如圖8所示,不含VC的培養(yǎng)基中,HGF和insulin經(jīng)過統(tǒng)計顯示比對照效率有所提高;而在含有VC的培養(yǎng)基中,除了HGF和insulin外,bFGF顯示了顯著提高的iPS效率。因此,含有VC的培養(yǎng)基更有利于細胞因子或化合物的篩選。最后應當說明的是,以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制,盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。權利要求1、用于誘導體細胞形成多能性干細胞以及胚胎干細胞的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基、血清、白血病抑制因子LIF,以及抗壞血酸或其衍生物。2、權利要求1的培養(yǎng)基,所述抗壞血酸的衍生物為抗壞血酸磷酸酯,抗壞血酸有機酸酯,如棕櫚酸酯?!?、權利要求1或2的培養(yǎng)基,所述抗壞血酸或其衍生物的濃度為l-200ug/ml。4、權利要求l的培養(yǎng)基,其中基礎培養(yǎng)基包括但不限于Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM),MinimalEssentialMedium(MEM),BasalMediumEagle(BME),F(xiàn)—10,F—12,RPMI1640,Glasgow'sMinimalEssentialMedium(GMEM),a—MinimalEssentialMedium(a—MEM),Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium禾口M199。5、誘導體細胞成為多能性干細胞的方法,所述方法包括a.將一種或多種干細胞多能性因子導入體細胞;b.在添加了抗壞血酸或其衍生物的胚胎干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述導入干細胞多能性因子的體細胞,進行誘導重編程;c.挑選符合條件的單克隆,即內(nèi)源報告基因激活或克隆呈現(xiàn)胚胎干細胞在相同培養(yǎng)基中生長的形態(tài);d.利用含有抗壞血酸的胚胎干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(c)中的單克隆細胞;e.鑒定(d)中單克隆細胞,挑選具有胚胎干細胞性狀的克隆。6、權利要求5所述的方法,其中步驟b中使用的培養(yǎng)基選自權利要求1-4中任一項所述的培養(yǎng)基。7、權利要求6所述的方法,其中步驟a中所述的干細胞多能性因子包括0ct4、Sox2(或Soxl)、c-Myc(或L-或N-Myc)、Klf4(或Klf2或5)、Nanog、Lin28以及Esrrb。8、權利要求5所述的方法,其中確定克隆狀態(tài)的方法包括內(nèi)源報告基因激活和克隆形態(tài)觀察。9、權利要求5-9任一項所述的方法,其中所述體細胞來自哺乳動物的成體細胞。10、權利要求9所述的方法,所述哺乳動物選自小鼠,大鼠,兔,豬,牛,羊,猴或人。全文摘要本發(fā)明公開了利用抗壞血酸(VC)或其衍生物高效產(chǎn)生誘導多能干細胞(iPSC)的方法,同時公開了利用抗壞血酸產(chǎn)生iPSC的培養(yǎng)基用于胚胎干細胞(ESC)的培養(yǎng)的方法。在本發(fā)明中,利用含有VC或其衍生物的培養(yǎng)基可以將小鼠或人的iPSC產(chǎn)生效率提高10-100倍;同時利用VC的ESC培養(yǎng)基顯著改善了iPS細胞以及ESC的生長狀態(tài)。本發(fā)明為VC或其衍生物在iPSC以及ESC在再生醫(yī)學研究中的應用提供了一種簡便易行的新方法。文檔編號C12N5/0735GK101684455SQ20091004133公開日2010年3月31日申請日期2009年7月22日優(yōu)先權日2009年7月22日發(fā)明者楊佳銀,濤王,秦寶明,米蓋爾·埃斯特班,裴端卿申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
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