角膜緣干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種角膜緣干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，其中，該角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括步驟如下：獲取可增殖角膜緣組織；將所述可增殖角膜緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；其中，所述Ca2+在所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。本發(fā)明角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以抑制角膜緣干細(xì)胞的分化，避免角膜緣干細(xì)胞因分化而產(chǎn)生其他細(xì)胞，保證培養(yǎng)得到的角膜緣干細(xì)胞的純度，降低分化程度，從而提高了移植角膜緣干細(xì)胞治療相應(yīng)眼部疾病的療效。
【專利說明】
角膜緣干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種角膜緣干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜由外而內(nèi)依次包括：上皮層、前彈力層（Bowman膜）、基質(zhì)層、后彈力層 (Decemet膜)和內(nèi)皮層。角膜上皮層具有多層細(xì)胞，包括與前彈力層連接的基底層細(xì)胞。角 膜上皮層具有保護(hù)眼球，穩(wěn)定淚膜，維持角膜透明性等功能，是一種不斷自我更新的組織， 而且，角膜上皮層的完整性的維持依賴于表淺細(xì)胞不斷脫落和基底層細(xì)胞不斷增殖以取代 脫落細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，而上皮細(xì)胞持續(xù)不斷的水平向心運(yùn)動和垂直向上運(yùn)動就源于角膜緣基底 層干細(xì)胞的增殖和分化。
[0003] 角膜緣是角膜和結(jié)膜的移行區(qū)，角膜緣上皮層多于10層，干細(xì)胞存在于角膜緣上 皮層的基底層，在保持角膜的生理生化和角膜的營養(yǎng)及完整性的維持、免疫反應(yīng)中占有重 要地位。角膜緣干細(xì)胞不僅可以分化、增殖為角膜上皮細(xì)胞，更重要的是干細(xì)胞像一道屏 障，阻止結(jié)膜上皮細(xì)胞移行至角膜表面，這對于保持角膜的透明性與正常生理功能有著重 要的意義。角膜病是我國第二位致盲眼部疾病。隨著現(xiàn)代眼科學(xué)的發(fā)展，角膜緣干細(xì)胞缺乏 或功能障礙的疾病，如眼表淚液病、無虹膜、化學(xué)和熱燒傷、福射損害、Stevens-Johnson綜 合征、眼瘢痕性天皰瘡等，可以通過角膜緣干細(xì)胞移植進(jìn)行治療。因此，角膜緣干細(xì)胞對于 上述眼部疾病的治療起著至關(guān)重要的作用。
[0004] 然而，現(xiàn)有方法培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞的純度低，分化程度高，進(jìn)而導(dǎo)致使用該角膜 緣干細(xì)胞進(jìn)行移植時，對上述眼部疾病的治療效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，旨在提高培養(yǎng)的角膜 緣干細(xì)胞的純度，降低分化程度。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述角膜緣干細(xì)胞 的培養(yǎng)方法包括步驟如下：
[0007] 獲取可增殖角膜緣組織；
[0008] 將所述可增殖角膜緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0009] 其中，所述Ca2+在所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為0.01~0.09mmol/L。
[0010]優(yōu)選地，所述將所述可增殖角膜緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的步驟之 后，還包括步驟如下：
[0011] 向所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子，使所述堿性成 纖維細(xì)胞生長因子的濃度為1~l〇〇ng/ml。
[0012] 優(yōu)選地，所述獲取可增殖角膜緣組織的步驟，包括：
[0013] 獲取角膜緣組織；
[0014] 將所述角膜緣組織置于無鈣MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)所述角膜緣組織的上皮層的基 底層細(xì)胞和與所述基底層細(xì)胞相連的上層細(xì)胞出現(xiàn)間隙時，除去所述上層細(xì)胞，而獲得可 增殖角膜緣組織。
[0015] 優(yōu)選地，所述Ca2+在所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為0.06mmol/L。
[0016] 優(yōu)選地，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為10~60ng/ml。
[0017] 優(yōu)選地，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為15ng/ml。
[0018] 優(yōu)選地，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
[0019] 優(yōu)選地，所述FBS在所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~14%。
[0020] 本發(fā)明還提供一種上述角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法獲得的角膜緣干細(xì)胞。
[0021 ]本發(fā)明還提供一種上述角膜緣干細(xì)胞在制備治療角膜病藥劑中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明技術(shù)方案，通過采用低鈣的MEM培養(yǎng)基對角膜緣組織進(jìn)行培養(yǎng)而得到角膜 緣干細(xì)胞，同時可以抑制角膜緣干細(xì)胞的分化，避免角膜緣干細(xì)胞因分化而產(chǎn)生其他細(xì)胞， 保證培養(yǎng)得到的角膜緣干細(xì)胞的純度，降低分化程度，從而提高了移植角膜緣干細(xì)胞治療 相應(yīng)眼部疾病的療效;進(jìn)一步地，向MEM培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子，該堿性成 纖維細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的增殖，增加干細(xì)胞的數(shù)量，且可以保證角膜緣 干細(xì)胞的活性。
【附圖說明】
[0023] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖示出的內(nèi)容獲得其他的附圖。
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞染色后的掃描電鏡示意 圖，圖中箭頭標(biāo)示了染色的細(xì)胞膜；
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞染色后的掃描電鏡示意 圖；
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞染色后的掃描電鏡示意 圖，圖中箭頭標(biāo)示了染色的細(xì)胞膜。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 本發(fā)明提供一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括步驟 如下：
[0029] S1、獲取可增殖角膜緣組織；
[0030] S2、將該可增殖角膜緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng);其中，Ca2+在該 含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為0.01~0.09mmo 1/L。
[0031]本發(fā)明培養(yǎng)方法通過采用低鈣的MEM培養(yǎng)基對角膜緣組織進(jìn)行培養(yǎng)而得到角膜緣 干細(xì)胞，可以抑制角膜緣干細(xì)胞的分化，避免角膜緣干細(xì)胞因分化而產(chǎn)生其他細(xì)胞，保證培 養(yǎng)得到的角膜緣干細(xì)胞的純度，降低了分化程度，從而提高了移植角膜緣干細(xì)胞治療相應(yīng) 眼部疾病的療效。
[0032]進(jìn)一步地，在步驟S2之后，該角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法還包括步驟如下：
[0033] S3、向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子，使堿性成纖維 細(xì)胞生長因子的濃度為1~l〇〇ng/ml。
[0034] 該堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的增殖，增加干細(xì)胞的數(shù)量， 且可以保證角膜緣干細(xì)胞的活性。需要說明的是，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識，該堿性成纖 維細(xì)胞生長因子的濃度僅為向MEM培養(yǎng)基中剛剛加入完時混合均勻的濃度，由于角膜緣組 織具有活性，因此，不能理解為培養(yǎng)一段時間后的濃度。
[0035] 進(jìn)一步地，該步驟S1具體包括如下步驟：
[0036] S10、獲取角膜緣組織；
[0037] S11、將該角膜緣組織置于無鈣MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)該角膜緣組織的上皮層的基 底層細(xì)胞和與基底層細(xì)胞相連的上層細(xì)胞出現(xiàn)間隙時，除去上層細(xì)胞，而獲得可增殖角膜 緣組織。
[0038]該可增殖角膜緣組織的獲取方法簡單，只需將角膜緣組織培養(yǎng)一段時間，上層細(xì) 胞和基底層細(xì)胞即可自行脫離。需要說明的是，本發(fā)明角膜緣組織的上皮層具有多層細(xì)胞， 其中，角膜緣干細(xì)胞產(chǎn)生于角膜緣組織的上皮層的基底層細(xì)胞，而基底層細(xì)胞以上的上層 細(xì)胞會隨著基底層細(xì)胞的生長而脫落。
[0039] 進(jìn)一步地，該堿性成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為10~60ng/ml。
[0040]當(dāng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子濃度保持在10~60ng/ml可以保持對干細(xì)胞較高的增 殖促進(jìn)作用，且保持干細(xì)胞較高的活性。
[0041 ] 進(jìn)一步地，F(xiàn)BS(胎牛血清)在含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~14 %。
[0042]該胎牛血清可以為角膜緣組織提供細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份，同時起酸堿度緩沖 液作用。
[0043]本發(fā)明還提供一種上述角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法獲得的角膜緣干細(xì)胞。
[0044] 該角膜緣干細(xì)胞可以通過施行角膜緣干細(xì)胞移植，改善或重建眼表結(jié)構(gòu)，有效地 治療因角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙的疾病，同時提高療效。
[0045] 本發(fā)明還提供一種上述角膜緣干細(xì)胞在制備治療角膜病藥劑中的應(yīng)用。
[0046] 將該角膜緣干細(xì)胞應(yīng)用于制備治療角膜病藥劑中，如角膜片或干細(xì)胞制劑等等， 方便角膜緣干細(xì)胞的存儲和活性保持，同時不影響療效。
[0047] 現(xiàn)通過實(shí)施例對本發(fā)明角膜緣干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用做進(jìn)一步解釋，以詳細(xì) 說明其技術(shù)方案及帶來的技術(shù)效果。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] -、獲取角膜緣組織：
[0050] 取因各種原因死亡的嬰幼兒及兒童的眼球，均無眼部疾患，于死后24h內(nèi)取材；
[0051] 將人眼球置于潔凈工作臺上，嚴(yán)格無菌下操作，沿角鞏膜緣灰白交界后1mm處剪 切，取下包括角膜緣在內(nèi)的眼前段組織，將眼前段組織小心移至另一盛有培養(yǎng)液的平皿中， 解剖顯微鏡下去除虹膜、晶狀體等附屬組織，再撕去角膜內(nèi)皮層及后彈力層；
[0052]然后，沿透明角膜內(nèi)1mm環(huán)狀剪取約2.0~2.5mm寬的角膜緣組織，并將其分成2mm X2_X2mm的組織塊。整個操作中注意盡量避免鉗夾培養(yǎng)組織塊。
[0053]二、獲取可增殖角膜緣組織：
[0054]用無鈣MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣組織14h，可見角膜緣組織的上皮層的基底層細(xì)胞與 其上方的上層細(xì)胞出現(xiàn)間隙，除去上層細(xì)胞，獲得可增殖角膜緣組織；
[0055] 三、細(xì)胞培養(yǎng)：
[0056]將可增殖角膜緣組織置于20ml含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中，其中，胎牛血清2g，鈣 離子的濃度為〇. 01mm〇l/ml;
[0057] 向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入300ng的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(珠 海東大生物制藥有限公司），培養(yǎng)至第15天。
[0058] 實(shí)施例2
[0059] 本實(shí)施例2的獲取角膜緣組織、獲取可增殖角膜緣組織的步驟與實(shí)施例1相同，不 同之處在于：
[0060] 三、細(xì)胞培養(yǎng)：
[00611將可增殖角膜緣組織置于20ml含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中，其中，胎牛血清2g，鈣 離子的濃度為0.06mmol/ml;
[0062] 向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入300ng的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(珠 海東大生物制藥有限公司），培養(yǎng)至第15天。
[0063] 實(shí)施例3
[0064] 本實(shí)施例3的獲取角膜緣組織、獲取可增殖角膜緣組織的步驟與實(shí)施例1相同，不 同之處在于：
[0065] 三、細(xì)胞培養(yǎng)：
[0066]將可增殖角膜緣組織置于20ml含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中，其中，胎牛血清2g，鈣 離子的濃度為〇. 〇9mmol/ml;
[0067] 向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入300ng的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(珠 海東大生物制藥有限公司），培養(yǎng)至第15天。
[0068] 實(shí)施例4
[0069] 本實(shí)施例4的獲取角膜緣組織、獲取可增殖角膜緣組織的步驟與實(shí)施例1相同，不 同之處在于：
[0070] 三、細(xì)胞培養(yǎng)：
[0071] 將可增殖角膜緣組織置于20ml含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中，其中，胎牛血清2g，鈣 離子的濃度為0.06mmol/ml;
[0072] 向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入200ng的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(珠 海東大生物制藥有限公司），培養(yǎng)至第15天。
[0073] 實(shí)施例5
[0074]本實(shí)施例5的獲取角膜緣組織、獲取可增殖角膜緣組織的步驟與實(shí)施例1相同，不 同之處在于：
[0075] 三、細(xì)胞培養(yǎng)：
[0076]將可增殖角膜緣組織置于20ml含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中，其中，胎牛血清2g，鈣 離子的濃度為0.06mmol/ml;
[0077]向該含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入1200ng的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (珠海東大生物制藥有限公司），培養(yǎng)至第15天。
[0078] 驗證例1
[0079] 上皮性鈣粘附蛋白（E-cadherin)在人角膜上皮層的分化與增殖過程中發(fā)揮著重 要的作用，是角膜緣干細(xì)胞及短暫擴(kuò)充細(xì)胞不斷分化、迀移，并最終成為終末分化細(xì)胞過程 的一個關(guān)鍵角色，它的大量表達(dá)起著促進(jìn)干細(xì)胞分化的作用。
[0080] 針對實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞，分別采用小鼠抗人單克隆 抗體E-cadherin(北京中山）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，染色后，通過掃描電鏡進(jìn)行觀察，分別 得到對應(yīng)的圖1、圖2、圖3;由圖1、圖3可知，只有極其少量細(xì)胞的細(xì)胞膜著色，即只有少量表 達(dá)了的E-cadherin被染色，大部分細(xì)胞未見著色；由圖2可知，沒有細(xì)胞的細(xì)胞膜著色，即沒 有 E-cadherin 表達(dá)。
[0081 ]根據(jù)細(xì)胞免疫學(xué)可知，實(shí)施例1和實(shí)施例3培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行免疫染色時， 只有少量的E-cadherin表達(dá)，而實(shí)施例2沒有E-cadherin表達(dá)，進(jìn)而證明了本發(fā)明培養(yǎng)方法 采用低鈣MEM培養(yǎng)基對角膜緣組織進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的角膜緣干細(xì)胞較純，分化程度低， 因此，低鈣MEM培養(yǎng)基可以有效地抑制角膜緣干細(xì)胞的分化，提高角膜緣干細(xì)胞的純度。顯 然，實(shí)施例2采用鈣離子濃度為0.06mmol/ml的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣組織，培養(yǎng)得到的角膜 緣干細(xì)胞未分化，純度最高，即該濃度的低鈣培養(yǎng)基的抑制分化效果最好。
[0082] 驗證例2
[0083]采用數(shù)碼照相機(jī)拍攝，存儲圖像數(shù)字信息，應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖 文分析系統(tǒng)，進(jìn)行計算機(jī)圖像分析，根據(jù)軟件設(shè)計，測量實(shí)施例2、實(shí)施例4和實(shí)施例5中可增 殖角膜緣組織塊的面積/細(xì)胞增殖面積。其中，每個實(shí)施例重復(fù)測量3次，取其均值，且分別 測量培養(yǎng)15天、20天和25天的細(xì)胞增殖面積，進(jìn)而得到如下表1，表1為不同堿性成纖維細(xì)胞 生長因子下可增殖角膜緣組織塊的面積/細(xì)胞增殖面積的比值。
[0084]表 1
[0086]由表1可知，該堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以有效地促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的增殖，極 大地增加干細(xì)胞的數(shù)量，且可以保證角膜緣干細(xì)胞的活性。顯然，實(shí)施例2采用濃度為15ng/ ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子對可增殖角膜緣組織進(jìn)行培養(yǎng)，其促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的增殖 效果非常顯著，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于實(shí)施例4和實(shí)施例5,該可增殖角膜緣組織塊的面積/細(xì)胞增殖面 積的比值可以低于0.2000。
[0087] 驗證例3
[0088] 首先，選取健康SD大鼠5只，分為五組進(jìn)行驗證，即組1、組2、組3、組4和對照組A，然 后對五組SD大鼠均采用陸眠寧5mg/kg、氯胺酮50mg/kg混合液肌肉注射麻醉。消毒結(jié)膜囊， 吸取5ul mol/L氫氧化鈉溶液滴于已消毒的濾紙片上，待濾紙片中氫氧化鈉達(dá)飽和狀態(tài)時， 將濾紙片置于SD大鼠單側(cè)角膜中央30s，棄去濾紙，立即用30ml的生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié) 膜囊；
[0089]其次，組1至組4的SD大鼠分別給予結(jié)膜下注射實(shí)施例2培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞的PBS 溶液0. lml;對照組A的SD大鼠給予結(jié)膜下注射常規(guī)藥物的PBS溶液0. lml;
[0090]最后，對五組SD大鼠用裂隙燈顯微鏡觀察角膜透明度，并進(jìn)行分級評價，其中，該 分級評價標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0091 ] 0級:全角膜透明，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)清楚可見；
[0092] I級:角膜輕度混濁，虹膜紋理不清，但能看清瞳孔緣，房水狀態(tài)尚可看清；
[0093] Π 級:瞳孔緣模糊不清，房水狀態(tài)無法看清，虹膜紋理不清；
[0094] m級:隱約看出虹膜顏色，余窺不清；
[0095] IV級:看不到任何前房結(jié)構(gòu)。
[0096]請參見如下表2,表2為五組SD大鼠的角膜透明度隨時間的變化關(guān)系。
[0097]表 2
[0099] 由上表2可知，實(shí)施例2培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞可以有效地恢復(fù)SD大鼠因堿燒傷的角 膜，且角膜透明度可以達(dá)到I級，因此，證明了本發(fā)明實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞為角膜緣干細(xì)胞， 且本發(fā)明實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞可以有效地治療各種因角膜緣干細(xì)胞缺失或功能障礙引起的 角膜疾病。
[0100] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效變換，或直接/間接運(yùn)用在其 他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括步驟如下： 獲取可增殖角膜緣組織； 將所述可增殖角膜緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 其中，所述Ca2+在所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為O.Ol~0.09mmol/L。2. 如權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述將所述可增殖角膜 緣組織加入含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的步驟之后，還包括步驟如下： 向所述含F(xiàn)BS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子，使所述堿性成纖維 細(xì)胞生長因子的濃度為1~l〇〇ng/ml。3. 如權(quán)利要求1或2所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述獲取可增殖角 膜緣組織的步驟，包括： 獲取角膜緣組織； 將所述角膜緣組織置于無鈣MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)所述角膜緣組織的上皮層的基底層 細(xì)胞和與所述基底層細(xì)胞相連的上層細(xì)胞出現(xiàn)間隙時，除去所述上層細(xì)胞，而獲得可增殖 角膜緣組織。4. 如權(quán)利要求1或2所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述Ca2+在所述含 FBS和Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的濃度為0.06mmol/L。5. 如權(quán)利要求2所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述堿性成纖維細(xì)胞生 長因子的濃度為10~60ng/ml。6. 如權(quán)利要求5所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述堿性成纖維細(xì)胞生 長因子的濃度為15ng/ml。7. 如權(quán)利要求6所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述堿性成纖維細(xì)胞生 長因子為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子。8. 如權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述FBS在所述含F(xiàn)BS和 Ca2+的MEM培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~14 %。9. 一種如權(quán)利要求1至8任意一項所述的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法獲得的角膜緣干細(xì) 胞。10. -種如權(quán)利要求9所述的角膜緣干細(xì)胞在制備治療角膜病藥劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/074GK105950545SQ201610356834
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司