專利名稱：Gap啟動(dòng)子文庫(kù)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及用于畢赤酵母的GAP啟動(dòng)子文庫(kù)。
背景技術(shù)：
通過基因操作優(yōu)化細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝工程(Metabolic Engineering)正在成為 生物化工領(lǐng)域一個(gè)非常重要的前沿研究方向。但是，面對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)由基因、蛋白、代謝 物、各種信號(hào)分子及它們之間相互作用組成的復(fù)雜動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，代謝過程的分析和調(diào)控非常 復(fù)雜和困難。只有通過對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精密的微調(diào)來研究其對(duì)細(xì)胞表型和代謝流的影響， 才能從中解析出關(guān)鍵的可供改造的代謝節(jié)點(diǎn)。因此，精確的“開量”式基因微調(diào)是開展代謝 工程研究非常重要的先進(jìn)手段，對(duì)其開展研究具有重要的科學(xué)意義廣泛的應(yīng)用空間。啟動(dòng)子(Promoter)是基因表達(dá)調(diào)控最常用的元件。但是，無(wú)論是組成型 (Constitutive)，還是誘導(dǎo)型(Inducible)啟動(dòng)子，都無(wú)法在一個(gè)較寬的范圍內(nèi)對(duì)基因表 達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)的調(diào)控。盡管誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可通過誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度在一定程度上調(diào) 控基因的表達(dá)，但這種調(diào)節(jié)的本質(zhì)還是“開關(guān)”控制，只能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開始和停止，即調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)錄時(shí)間的長(zhǎng)短而非轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的高低。而誘導(dǎo)物濃度效應(yīng)往往只是增加群體中基因表達(dá) 的細(xì)胞數(shù)而非各單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平，不具體表達(dá)的均一性。此外，從實(shí)際工業(yè)應(yīng)用的角度 考慮，由于誘導(dǎo)物的價(jià)格一般較貴，且細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)物具有高度敏感性，其可操作性不強(qiáng)。正 是由于這些缺陷，近些年來研究者開發(fā)了啟動(dòng)子文庫(kù)(Promoter Library)用以作為對(duì)基因 表達(dá)更為靈活和精確的調(diào)控工具。啟動(dòng)子文庫(kù)就是對(duì)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子堿基序列進(jìn)行突變，通過報(bào)告基因 (Reporter Gene，如綠色熒光蛋白GFP基因、半乳糖苷酶基因LacZ等)的表達(dá)水平，篩選得 到的一系列不同強(qiáng)度的人工啟動(dòng)子集合體。由于啟動(dòng)子的堿基序列直接影響其調(diào)控基因 轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度，故只要所構(gòu)建的文庫(kù)包含足夠豐富的突變序列，篩選量足夠大，就可以從中篩 選出一系列具有不同調(diào)控強(qiáng)度的突變啟動(dòng)子，構(gòu)成能對(duì)其下游基因?qū)嵤伴_量”式微調(diào)的文 庫(kù)。啟動(dòng)子文庫(kù)出現(xiàn)后即被應(yīng)用于代謝工程的研究，并已在多方面顯示了其強(qiáng)大的功 能。首先，啟動(dòng)子文庫(kù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因表達(dá)“開量”式微調(diào)，顯著優(yōu)于利用單一啟動(dòng)子的“開 關(guān)”式調(diào)控。Solem等人利用啟動(dòng)子文庫(kù)，在乳酸乳球菌(Lactococculs latis)中，不僅對(duì) 糖酵解途徑Pfk基因，還對(duì)位于同一操縱子內(nèi)的另外兩個(gè)基因(pyk和Idh)實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)度遞 增的表達(dá)調(diào)控。其次，啟動(dòng)子文庫(kù)可用于代謝分析，使人們能更準(zhǔn)確地定位代謝控制節(jié)點(diǎn)。 Keobmann等在大腸桿菌糖酵解途徑的研究中，利用啟動(dòng)子文庫(kù)調(diào)控F1-ATP合成酶表達(dá)，發(fā) 現(xiàn)逐漸提高ATP酶活水平和ATP的水解，可使糖酵解通量提高70%，表明糖酵解途徑的主 要調(diào)控因素是ATP水平，并非途徑本身各反應(yīng)的酶活。第三，啟動(dòng)子文庫(kù)也可用于尋找多基 因調(diào)控合成途徑的限制性因素。Alper等在研究蕃茄紅素的合成時(shí)，發(fā)現(xiàn)在野生菌中提高 dxs基因(deoxy-xylulose-p synthase，脫氧-磷酸木酮糖合成酶)的表達(dá)，只能在一定程度上提高蕃茄紅素的產(chǎn)量，而在過表達(dá)該合成途徑下游兩個(gè)酶的重組菌中，不斷增強(qiáng)dxs 基因表達(dá)能使蕃茄紅素產(chǎn)量不斷提高，說明脫氧_磷酸木酮糖合成酶活是重組菌合成途徑 的限制性因素。第四，啟動(dòng)子文庫(kù)還可用于確定代謝控制的最優(yōu)化基因調(diào)控水平。Nevoigt 等在分析3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)基因GPDl對(duì)釀酒酵母甘油產(chǎn)率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過突 變啟動(dòng)子控制GPDH的酶比活變化不超過其野生型的2倍時(shí)，菌體的生物量和甘油產(chǎn)率均與 GPDH活性正相關(guān)，但多拷貝基因的過表達(dá)，非但不能使甘油產(chǎn)率相應(yīng)增加，還對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn) 生抑制，因此在代謝改造中可通過突變啟動(dòng)子文庫(kù)來精確微調(diào)基因表達(dá)水平以達(dá)到最優(yōu)化 控制。可見，通過構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，將“開量”式微調(diào)基因表達(dá)成為可能，在代謝分析和 改造中，突破了原來只能通過基因敲除(Knock out)和過表達(dá)(Over expression)兩種非 “開”即“關(guān)”的手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞基因型的擾動(dòng)(Perturbation)，即可通過對(duì)目標(biāo)基因表 達(dá)進(jìn)行梯度式的精確微調(diào)來分析和控制其對(duì)表型和代謝流分布的影響。此外，對(duì)這一工具 的利用還可發(fā)展到使用文庫(kù)中的不同啟動(dòng)子，對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行調(diào)控。因此，啟動(dòng) 子文庫(kù)正在成為代謝工程研究向系統(tǒng)分析和整體優(yōu)化發(fā)展中的有效研究工具，將極大地提 升該領(lǐng)域的研究水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于畢赤酵母的GAP啟動(dòng)子文庫(kù)及其用途。本發(fā)明的另一目的在于提供篩選突變型GAP啟動(dòng)子的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種突變型GAP啟動(dòng)子文庫(kù)，所述的啟動(dòng)子文庫(kù)包括 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6 或 SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的啟動(dòng)子具有依次減弱的啟動(dòng) 目的基因表達(dá)的強(qiáng)度。在另一優(yōu)選例中，所述的SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的啟動(dòng)子相對(duì)于野生型 GAP 啟動(dòng)子是增強(qiáng)型 GAP 啟動(dòng)子；所述的 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的啟動(dòng)子相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子是 弱化型GAP啟動(dòng)子。在本發(fā)明的第二方面，提供一種載體，所述的載體含有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :7 所示的核苷酸 序列，作為啟動(dòng)子元件。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的啟動(dòng)子元件可操作地連接的目的基 因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)結(jié)構(gòu)基因、編碼具有特定功 能的蛋白的基因、報(bào)告基因(如綠色熒光蛋白、熒光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于啟動(dòng)子元件的下游，且與所述啟動(dòng)子的間 隔小于2000bp ；較佳的小于IOOObp ；更佳地小于500bp,如小于200bp,小于IOObp，小于 50bp。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體；或其基因組中整合有SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO -J所示的核苷酸序列的核酸。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫(kù)的用途，用于提供突變 型GAP啟動(dòng)子，將所述突變型GAP啟動(dòng)子可操作性地與目的基因連接，調(diào)節(jié)目的基因的表 達(dá)。在本發(fā)明的第五方面，提供一種篩選突變型GAP啟動(dòng)子的方法，所述的突變型GAP 啟動(dòng)子相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子、啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度發(fā)生變化(包括增強(qiáng)表達(dá)或弱 化表達(dá))，所述方法包括(1)提供重組表達(dá)載體1，所述重組表達(dá)載體1含有GAP啟動(dòng)子突變體序列，以及 與所述GAP啟動(dòng)子突變體序列操作性相連的報(bào)告基因序列；將該重組表達(dá)載體1轉(zhuǎn)化宿主 細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞1，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞1 ；(2)提供重組表達(dá)載體2，所述重組表達(dá)載體2含有野生型GAP啟動(dòng)子序列，以及 與所述野生型GAP啟動(dòng)子序列操作性相連的報(bào)告基因序列；將該重組表達(dá)載體2轉(zhuǎn)化宿主 細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞2，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞2 ；(3)觀察所述的重組宿主細(xì)胞1表達(dá)報(bào)告基因的情況，若相對(duì)于重組宿主細(xì)胞2， 重組宿主細(xì)胞1報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生變化(優(yōu)選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化)，則該重組宿主 細(xì)胞1中重組表達(dá)載體1攜帶的GAP啟動(dòng)子突變體為所需的突變型GAP啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因選自但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、增效的綠 色熒光蛋白(EGFP)或半乳糖苷酶基因LacZ。在另一優(yōu)選例中，所述的重組宿主細(xì)胞1和重組宿主細(xì)胞2的培養(yǎng)條件是 30 士 2°C，200 士 lOOrpm。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述的重組宿主細(xì)胞1與步驟(2)所述的重組宿主細(xì) 胞2培養(yǎng)條件相同。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，若相對(duì)于重組宿主細(xì)胞2，重組宿主細(xì)胞1報(bào)告基 因的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生顯著增強(qiáng)(如增強(qiáng)10%以上，較佳的增強(qiáng)20%以上，更佳的增強(qiáng)30%以 上)，則該重組宿主細(xì)胞1中重組表達(dá)載體1攜帶的GAP啟動(dòng)子突變體相對(duì)于野生型GAP啟 動(dòng)子是增強(qiáng)型GAP啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，若相對(duì)于重組宿主細(xì)胞2，重組宿主細(xì)胞1報(bào)告基 因的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生顯著弱化(如弱化10%以上，較佳的弱化20%以上，更佳的弱化30%以 上)，則該重組宿主細(xì)胞1中重組表達(dá)載體1攜帶的GAP啟動(dòng)子突變體相對(duì)于野生型GAP啟 動(dòng)子是弱化型GAP啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)或(2)中，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞(重組宿主 細(xì)胞1或重組宿主細(xì)胞2)的方法包括(a)用BMD培養(yǎng)基A預(yù)培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞30_50小時(shí)(更優(yōu)選36_48小時(shí))；其 中，所述的BMD培養(yǎng)基A中葡萄糖濃度0. 2 士 0. 05% ；
(b)將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BMD培養(yǎng)基B，培養(yǎng)30_65小時(shí)(較佳地 36-48小時(shí))；其中，所述的BMD培養(yǎng)基B中葡萄糖濃度1 士0.2%。在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白(GFP)，且步驟(2)中，觀察所 述的重組宿主細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因的情況的方法包括測(cè)定含有所述的重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng) 基的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1、重組質(zhì)粒pGHg構(gòu)建示意圖。圖2、重組質(zhì)粒鑒定。A、重組質(zhì)粒pGAPZAgfp酶切和PCR驗(yàn)證。泳道1 :Not I和SalI雙酶切驗(yàn)證；泳道 2 用引物 GFP F 和 GFP R PCR 驗(yàn)證；M :DNA marker B、重組質(zhì)粒pGAPg酶切驗(yàn)證。M =DNA Marker ；泳道1 :SpeI和Not I雙酶切驗(yàn)證。C、重組質(zhì)粒pGHg酶切和PCR驗(yàn)證。M =DNA Marker ；泳道1 =SpeI和Not I雙酶切驗(yàn)證；泳道2 用引物GAP primer和 GFP R PCR 驗(yàn)證。圖3、質(zhì)粒pGH圖譜及構(gòu)建示意圖。圖4、重組質(zhì)粒pGH酶切和PCR驗(yàn)證。泳道1 :PCR驗(yàn)證；泳道2 重組質(zhì)粒pGH經(jīng) HindIII 酶切；M :DNA Marker。圖5、熒光酶標(biāo)儀和和重組菌G/GHg表達(dá)GFP熒光強(qiáng)度。A、熒光酶標(biāo)儀GFP熒光強(qiáng)度。B、流式細(xì)胞儀測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度。1 :G/GH ；2和3 G/GHg0圖6、48孔深孔板中不同培養(yǎng)基BMD、BSM、BMDY, YPD對(duì)重組菌生長(zhǎng)影響。A、重組菌G/PHg于30°C，200rpm,培養(yǎng)60h，測(cè)定細(xì)胞密度0D6(1。。B、重組菌G/GHg于30°C，200rpm,培養(yǎng)60h，測(cè)定細(xì)胞密度0D6(1。。圖7、不同培養(yǎng)基對(duì)重組菌GFP表達(dá)影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組菌G/PHg和對(duì)照菌 G/PH經(jīng)不同培養(yǎng)基對(duì)GFP表達(dá)影響。1. YPD培養(yǎng)對(duì)照菌G/PH ；2. YPD培養(yǎng)G/PHg ；3. BMD培 養(yǎng) G/PHg ；4. BSM 培養(yǎng) G/PHg.圖8、篩選模型示意圖。圖9、48深孔板預(yù)培養(yǎng)板中不同接種量對(duì)重組菌G/PHg、G/GHg和對(duì)照菌生長(zhǎng)影響。A、48深孔板預(yù)培養(yǎng)板中不同接種量重組菌G/GHg生長(zhǎng)情況比較。每孔裝 BMD (0. 2 % )900μ L,30°C,200rpm,培養(yǎng) 48h。GHgl 接種量 10 μ L ；GHg2 接種量 20μ L ； GHg3 接種量 30 μ L0B、48深孔板預(yù)培養(yǎng)板中不同接種量重組菌G/PHg生長(zhǎng)情況比較。每孔裝 BMD (0. 2 % )900μ L,30°C,200rpm,培養(yǎng) 48h。PHgl 接種量 10 μ L ； PHg2 接種量 20μ L ； PHg3 接種量 30 μ L。C、48深孔板預(yù)培養(yǎng)板中不同接種量對(duì)照菌生長(zhǎng)情況比較。每孔裝 BMD (0. 2% )900μ L，30°C，200rpm，培養(yǎng) 48h。Cl 接種量 10 μ L ；C2 接種量 20 μ L ；C3 接種量 30 μ Lo圖10、不同接種時(shí)間對(duì)重組菌G/PHg、G/GHg在篩選板48孔深孔板生長(zhǎng)影響篩選板 48深孔板每孔裝900 uL BMD(1% )培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h、36h、48h分別接種30 μ L 至篩選平板，300C，200rpm,培養(yǎng)60h測(cè)定細(xì)胞密度0D_。圖11、從預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板48孔深孔板不同接種量對(duì)重組菌生長(zhǎng)影響。圖12、重組菌 G/GlstHgfρ、G/G2ndHgfp、G/G3thHgfpPCR 驗(yàn)證。(A)泳道 1-10 :G/GlstHgfp ；泳道 11-17 :G/G2ndHgfp ；M :DNA Marker。(B)泳道 1-10 :G/G3thHgfp ；泳道 11-13 :G/G2ndHgfp ；M :DNA Marker。圖13、pGAP突變文庫(kù)調(diào)控綠色熒光蛋白在重組畢赤酵母中的表達(dá)，顯示了試管培 養(yǎng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。圖14、G1-G7測(cè)序結(jié)果比對(duì)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，構(gòu)建了一個(gè)基于GAP啟動(dòng)子的突變型GAP啟動(dòng) 子文庫(kù)，該文庫(kù)包括一組分離的啟動(dòng)子，各啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度呈現(xiàn)梯度分布。 本發(fā)明的啟動(dòng)子文庫(kù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的連續(xù)微調(diào)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序 列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子提供RNA聚合酶和正確 起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。如本文所用，所述的“GAP啟動(dòng)子文庫(kù)”是指含有本發(fā)明篩選得到的一系列突變型 GAP啟動(dòng)子的核酸集合體。如本文所用，所述的“GAP啟動(dòng)子”簡(jiǎn)稱為pGAP或Ρωρ。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性相連”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域 或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位 置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子被“可操作地連接”到該核酸序 列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本發(fā)明的啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)的基因。本發(fā)明對(duì)合 適的目的基因沒有特別的限制，例如包括但不限于結(jié)構(gòu)基因、編碼具有特定功能的蛋白的 基因、酶、報(bào)告基因(如綠色熒光蛋白、熒光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。如本文所用，所述的“增強(qiáng)型GAP啟動(dòng)子”是指相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子(其序列 如SEQ ID N0:8所示)其啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，例如增強(qiáng)10%以上，較佳的 增強(qiáng)20%以上，更佳的增強(qiáng)30%以上，如增強(qiáng)50%以上、增強(qiáng)80%以上或增強(qiáng)100%以上。 其啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度可通過檢測(cè)目的的基因表達(dá)量而得知，表達(dá)量的檢測(cè)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的技術(shù)。
如本文所用，所述的“弱化型GAP啟動(dòng)子”是指是指相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子其啟 動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度顯著弱化，例如弱化10 %以上，較佳的弱化20%以上，更佳的弱化 30%以上，如弱化50%以上、弱化80%以上或弱化100%以上。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì) 序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子 對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。啟動(dòng)子文庫(kù)為了實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的連續(xù)微調(diào)，本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，篩選到了一組突變 型 GAP 啟動(dòng)子，包括 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，構(gòu)成啟動(dòng)子文庫(kù)，各啟動(dòng)子啟動(dòng) 目的基因表達(dá)的強(qiáng)度呈現(xiàn)梯度分布，用于在不同強(qiáng)度下指導(dǎo)目的基因表達(dá)。啟動(dòng)子文庫(kù)的 獲得可保證對(duì)所調(diào)控的目的基因表達(dá)進(jìn)行梯度調(diào)節(jié)，實(shí)施可控基因擾動(dòng)和系統(tǒng)分析。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對(duì)于啟動(dòng)子而 言可以是外源(異源)的。所述的目的基因通?？梢允侨魏魏怂嵝蛄?如一種結(jié)構(gòu)性核酸 序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋 白。例如，當(dāng)用于表達(dá)強(qiáng)度的研究時(shí)，所述的目的基因包括但不限于綠色熒光蛋白、 增效的綠色熒光蛋白、熒光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ等。“綠色熒光蛋白”具有內(nèi)源 熒光基團(tuán)，在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射清晰可見的綠光，且見光不易淬滅。“增 效的綠色熒光蛋白”為對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行改進(jìn)后的蛋白。“熒光素酶”作為一種代表性的 指示基因表達(dá)狀況的工具，可良好地指示由啟動(dòng)子指導(dǎo)的基因表達(dá)情況。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可以從本發(fā)明的啟動(dòng)子文庫(kù)中選擇不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子， 分別將它們與待研究的目的基因可操作地連接，或?qū)⒛康幕蚺c所述的啟動(dòng)子可操作的連 接入合適的載體中，采取適當(dāng)?shù)姆绞綄?dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，從而獲得其中目的基因表達(dá)量不 同的一系列細(xì)胞?？赏ㄟ^分析這些細(xì)胞的代謝情況、表型變化、蛋白表達(dá)情況或相互作用情 況、各種信號(hào)分子的變化等，來得知該目的基因的功能或用途。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的目的基因可以是一種對(duì)于某一細(xì)胞而言缺失或表 達(dá)量不足的基因，可將該目的基因與本發(fā)明的增強(qiáng)性GAP啟動(dòng)子可操作地連接，或?qū)⒛康?基因與本發(fā)明的啟動(dòng)子可操作的連接入合適的載體中，采取適當(dāng)?shù)姆绞綄?dǎo)入到該細(xì)胞內(nèi)， 從而高水平地表達(dá)目的基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子還可以被可操作地連接到被改進(jìn)的目的基因序列上，該目的基因 相對(duì)于啟動(dòng)子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進(jìn)來產(chǎn)生各種期望的特性。例 如，目的基因可以被改進(jìn)來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的 修飾(如磷酸化位點(diǎn))，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信5寸。此外，啟動(dòng)子和目的基因可以設(shè)計(jì)成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動(dòng)子連接 到目的基因序列上來實(shí)現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反 義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。載體和宿主細(xì)胞
來自于本發(fā)明的啟動(dòng)子文庫(kù)的任何一種啟動(dòng)子和/或目的基因序列可被包含在 重組載體中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發(fā)明的啟動(dòng)子，在所述啟動(dòng)子的下游包含 多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)需要表達(dá)目的基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克 隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與啟動(dòng)子可操作地連接。作為一種方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向)引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟 動(dòng)子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化 信號(hào)，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指本領(lǐng) 域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠在 宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是酵母 細(xì)胞適用的表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的 基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動(dòng)子，還可含有一種或多種其它啟動(dòng)子。所述的 其它啟動(dòng)子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。包含上述適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和目的基因的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使 其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有酵母，大腸桿菌，動(dòng)物的組織細(xì)胞，植物細(xì)胞等。 本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所 述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，更優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。篩選方法本發(fā)明還提供了一種篩選突變型GAP啟動(dòng)子的方法，所述的突變型GAP啟動(dòng)子相 對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子、啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度發(fā)生變化(包括增強(qiáng)表達(dá)或弱化表達(dá))， 所述方法包括在相同培養(yǎng)條件下，分別培養(yǎng)由GAP啟動(dòng)子突變體啟動(dòng)目的基因表達(dá)的宿 主細(xì)胞以及由野生型GAP啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞，比較兩種細(xì)胞中目的基因 的表達(dá)強(qiáng)度(或表達(dá)量)，若GAP啟動(dòng)子突變體啟動(dòng)目的基因表達(dá)與野生型GAP啟動(dòng)子啟動(dòng) 目的基因表達(dá)相比表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，則該GAP啟動(dòng)子突變體為所需的突變型GAP啟 動(dòng)子。
上述篩選方法中，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，更優(yōu)選地是畢赤酵母細(xì)胞。培養(yǎng)酵 母細(xì)胞的條件是本領(lǐng)域人員所熟知的，本發(fā)明中沒有特別的限制；較佳地，培養(yǎng)酵母細(xì)胞的 條件是 30 士 2°C，200 士 lOOrpm。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，盡管多種培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明中宿主細(xì)胞(如酵母細(xì) 胞)的培養(yǎng)，但是利用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，對(duì)于后續(xù)篩選的靈敏性或準(zhǔn)確性有影 響。因此，本發(fā)明人針對(duì)多種培養(yǎng)基中進(jìn)行了對(duì)比和選擇，最終發(fā)現(xiàn)，BMD培養(yǎng)基最適合用 于本發(fā)明的篩選方法。BMD培養(yǎng)基是本領(lǐng)域人員已知的培養(yǎng)基，其配方如下YNB (酵母基礎(chǔ) 氮源)26. 8g/L，生物素0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 10g/L, IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH 6. 0)配 制。本發(fā)明的篩選方法中，在不同的篩選階段，本發(fā)明人還對(duì)其中葡萄糖的濃度進(jìn)行 了調(diào)節(jié)。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞的方法包括(a)用 BMD培養(yǎng)基A預(yù)培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞30-50小時(shí)(更優(yōu)選36-48小時(shí))；其中，所述的BMD培 養(yǎng)基A中葡萄糖濃度0. 2 士0. 05% ； (b)將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BMD培養(yǎng)基B，培 養(yǎng)30-65小時(shí)(較佳地36-48小時(shí))；其中，所述的BMD培養(yǎng)基B中葡萄糖濃度1 士0. 2%。測(cè)定培養(yǎng)體系中報(bào)告基因的表達(dá)情況的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，也可 根據(jù)報(bào)告基因的不同作出調(diào)整。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白 (GFP)，測(cè)定該報(bào)告基因的表達(dá)情況的方法包括測(cè)定培養(yǎng)體系中的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明通過大量篩選獲得了一系列啟動(dòng)子，它們啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度呈 現(xiàn)梯度分布，從而建立了 GAP啟動(dòng)子文庫(kù)；(2)本發(fā)明通過構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，將“開量”式微調(diào)基因表達(dá)成為可能，在代謝分析 和改造中，突破了原來只能通過基因敲除和過表達(dá)兩種非“開”即“關(guān)”的手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì) 胞基因型的擾動(dòng)，即可通過對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行梯度式的精確微調(diào)來分析和控制其對(duì)表型 和代謝流分布的影響。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、重組菌G/GHg的構(gòu)建利用綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因以描述調(diào)控其表達(dá)的GAP啟動(dòng)子強(qiáng)度。為 了構(gòu)建報(bào)告基因表達(dá)載體，便于突變啟動(dòng)子插入，首先利用原始的未經(jīng)突變的GAP啟動(dòng)子 調(diào)控報(bào)告基因gfp的表達(dá)，構(gòu)建GFP報(bào)告基因表達(dá)載體pGHg和相應(yīng)的重組菌G/GHg，并構(gòu)建 不含GFP基因的載體pGH和重組菌G/GH作為對(duì)照，考察GFP的表達(dá)。1、表達(dá)載體pGHg的構(gòu)建和鑒定(1)重組質(zhì)粒pGAPZAgfp的構(gòu)建和鑒定
參照?qǐng)D1，以化學(xué)全合成的gfp基因(SEQ ID NO 15)為模板，用引物 GFP F(AATGCGGCCGCAAACCCAAGCTTATGTCTAAAGGTGAAGAAT (SEQ ID NO 9))禾口 GFP R(GACGTCGACGCTCCCAAGCTTTTATTTG TACAATTCATCC(SEQ ID NO 10))擴(kuò)增目的基因 gfp， 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I和Sail雙酶切，質(zhì)粒pGAPZ A(含有野生型GAP啟動(dòng)子；購(gòu)自 Invitrogen公司)同樣方法酶切。經(jīng)雙酶切后gfp片段和載體質(zhì)粒pGAPZA連接獲得重組 質(zhì)粒pGAPZAgfp。重組質(zhì)粒pGAPZAgfp用引物GFP F和GFP R進(jìn)行PCR鑒定，目的片段gfp 約750bp ；Not I和SalI限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，切下目的片段gfp約750bp (如圖2A)。(2)重組質(zhì)粒pGAPg的構(gòu)建和鑒定質(zhì)粒pGAPZ A 為模板，正義鏈引物 GAP F BSpe (AGAAGATCTTCGACTAGTTTTTTGTAGAA ATGTCTTGGT (SEQ ID NO: 11))和反義鏈引物 GAP R Not (TTAGCGGCCGCAATAGTTGTTCAATTGAT TGAAA(SEQ ID NO :12))，擴(kuò)增得到的GAP啟動(dòng)子片段經(jīng)BglII和NotI酶切，連接經(jīng)同樣方 法酶切的載體pGAPZAgfp，獲得重組質(zhì)粒pGAPg。重組質(zhì)粒pGAPg用SpeI和Not I限制性 內(nèi)切酶酶切鑒定，切下GAP啟動(dòng)子和載體片段分別為500bp和3kb (如圖2B)。(3)重組質(zhì)粒PGHg的構(gòu)建和鑒定質(zhì)粒pGAPg經(jīng)BglII酶切，并去磷酸化。用限制性內(nèi)切酶BglII和BamH I酶切 的pA0815質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)片段(4. Okb的HIS4和3，AOX片段)，該片段與 經(jīng)BglII酶切并去磷酸后質(zhì)粒pGAPg連接，獲得質(zhì)粒pGHg，SpeI和Not I限制性內(nèi)切酶酶 切鑒定，切下目的片段約500bp ；用引物GAP primer(TTTCAATCAATTGMCAACTAT(SEQ ID NO: 13))禾口 GFP R (GCAAATGGCATTCTGACATCC (SEQ ID NO : 14)) PCR 鑒定，目的片段約 750bp (如 圖 2C)。2、重組質(zhì)粒pGH的構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pGHg經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII酶切，回由6. 8kb載體片段經(jīng)自連，獲得 質(zhì)粒pGH，質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖3。用GAP啟動(dòng)子正義鏈引物GAP F BSpeI和3’ AOX引物 PCR鑒定重組質(zhì)粒pGH，目的片段約750bp，限制性內(nèi)切酶HindIII酶切驗(yàn)證質(zhì)粒pGH，線性 化質(zhì)粒約為6. 8kb，如圖4。3、基因工程菌G/GHg和G/GH的構(gòu)建將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGHg和pGH用限制性酶BspeI酶切線性化后，用乙醇沉淀方 法沉淀DNA，回收后分別電轉(zhuǎn)畢赤酵母GSl 15 (購(gòu)自Invitrogen公司)，涂布MD平板，30°C 倒置培養(yǎng)3 5天，直到單克隆出現(xiàn)。采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。MD平板上挑選的10個(gè)基因工程菌G/GHg接種到3mL YPG培養(yǎng)基中，30°C，220rpm 培養(yǎng)16h，取ImL菌液保種，ImL菌液5000rpm，離心收集菌體，去離子水洗一次，用20%甘油 重懸菌體，-20°C保存以便樣品的后續(xù)分析。余下菌液用于測(cè)定菌體濃度(OD6tltl)。(1)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度菌液用PBS(pH7.0)稀釋至OD6tltl為1，稀釋后樣品取250 μ L至96孔板，使用熒光 酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm)，并檢測(cè)0D·。檢測(cè)GFP熒 光強(qiáng)度時(shí)，以不表達(dá)GFP的基因工程菌G/GH作為對(duì)照去除背景干擾。G/GH和G/GHg的GFP 比熒光強(qiáng)度值分別為2246. 5 (RFU)和2349. 3 (RFU)，如圖5A，比熒光強(qiáng)度F/0D6(1(1 (RFU/0D6 J 為熒光強(qiáng)度值比上對(duì)應(yīng)細(xì)胞密度0D_。(2)流式細(xì)胞儀測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度
將菌體用PBS (pH7. 0)稀釋至OD6tltl為0.2，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞GFP熒光強(qiáng) 度(同樣檢測(cè)條件下以基因工程菌G/GH作為空白對(duì)照)。如圖5B所示，利用流式細(xì)胞儀可 以檢測(cè)到GFP的特征熒光，構(gòu)建的重組菌G/GHg能利用GAP啟動(dòng)子調(diào)控報(bào)告基因gfp的表 達(dá)，而且表達(dá)的GFP具有活性?？梢?，通過檢測(cè)GFP的熒光強(qiáng)度能表征調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子強(qiáng)度。綜上，本發(fā)明人成功構(gòu)建了表達(dá)載體pGHg，利用組成型啟動(dòng)子GAP調(diào)控報(bào)告基因 gfp表達(dá)，并構(gòu)建不含GFP基因的載體PGH作為對(duì)照。將GFP表達(dá)載體pGHg轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GSl 15中獲得G/GHg，通過PCR、流式細(xì)胞儀和熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光，驗(yàn)證了 gfp基因已 被成功轉(zhuǎn)入重組菌并受啟動(dòng)子GAP調(diào)控表達(dá)出具有活性的綠色熒光蛋白。以GS115為宿主， 轉(zhuǎn)入不表達(dá)gfp的對(duì)照載體pGH，得到重組菌G/GH，通過PCR驗(yàn)證載體pGH的轉(zhuǎn)入，獲得對(duì) 照重組菌G/GH。實(shí)施例2、篩選模型的建立1、篩選培養(yǎng)基的確定(1)不同培養(yǎng)基對(duì)GFP熒光檢測(cè)影響以PBS為陰性對(duì)照，考察不同培養(yǎng)基對(duì)GFP熒光檢測(cè)的影響。無(wú)菌BMD、BMDY、YPD、BSM 培養(yǎng)基(參見 Invitrogen 公司的操作手冊(cè)A Manualof Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris)禾口 PBS 各取 250 μ L加至96孔板中經(jīng)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BSM培養(yǎng)基對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定干擾最小(BSM :537 (RFU) ；PBS 460 (RFU))，其次 是BMD:616(RFU)。無(wú)菌培養(yǎng)基BMDY和YPD經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，分別為 47581 (RFU)和 46499 (RFU)，高出 PBS 檢測(cè)熒光 100 多倍。BMD、BMDY, YPD、BSM培養(yǎng)基以及PBS配方如下BMD(1%葡萄糖)=YNB 26. 8g/L，生物素 0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 10g/L，IOOmM 磷酸鉀緩沖液配制，PH 6.0。BMD (0. 2 % 葡萄糖)=YNB 26. 8g/L，生物素 0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 2g/L，IOOmM 磷酸鉀緩沖液配制，PH 6.0。BMDY 蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L, YNB 26. 8g/L，生物素0. 04g/L,葡萄糖 (Dextrose) 10g/L, IOOmM 磷酸鉀緩沖液配制，pH 6. 0。YPD(1%葡萄糖)蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖10g/L。BSM (NH4)2SO4 7. 0g/L, CaSO4 0. 46g/L, K2SO4 9. lg/L, MgSO4 · 7H20 7. 5g/L，葡萄 糖(Dextrose) lOg/L, PTM1 12mL/L。用 0. 2M 的 K2HP04/KH2P04 緩沖液配制，pH5. 5。其中PTM1 =CuSO4 ·5Η20 6g/L，Kl 0. 08g/L, MnSO4 .H2O 3g/L，Na2MoO4 · 2Η200· 2g/L, H3BO3 0. 02g/L, ZnSO4 · 7H20 20g/L, FeSO4 · 7H20 65g/L, CoCl2 · 6H20 0. 5g/L,生物素 0. 04g/ L, H2SO4 5mL/L。PBS :pH7. 0 =NaCl 8g/L，KCl 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 42g/L, KH2PO4 0. 27g/L，鹽酸調(diào) pH 至 7· 0。(2)不同培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響本發(fā)明人分別考查了四種培養(yǎng)基BMD、BSM、BMDY、YPD (碳源均為葡萄糖)對(duì)重 組菌G/PHg和G/GHg生長(zhǎng)影響。48孔深孔板每孔裝900 μ 1培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基作三個(gè)平行復(fù)孔。48孔深孔板培養(yǎng)36小時(shí)，取30 μ L接種至含有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的另一 48孔深孔板， 30°C,200rpm,培養(yǎng)60h，測(cè)定細(xì)胞密度OD6tltl,結(jié)果如圖6。可見，無(wú)論是G/PHg和G/GHg重 組菌，四種培養(yǎng)基中YPD和BMDY對(duì)菌體生長(zhǎng)最有利，培養(yǎng)60h后0D_達(dá)到17左右；相對(duì)而 言，BSM和BMD培養(yǎng)60h后細(xì)胞密度OD600分別為12和9。(3)不同培養(yǎng)基對(duì)重組菌GFP表達(dá)影響鑒于BSM和BMD培養(yǎng)基對(duì)GFP熒光強(qiáng)度測(cè)定干擾極小(BSM 537 (RFU) ；BMD 616 (RFU))，本實(shí)驗(yàn)主要考查了 BSM和BMD培養(yǎng)基(葡萄糖含量均為1%)對(duì)GFP表達(dá)影響。 48孔深孔板每孔裝900 μ L培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基分別作三個(gè)平行復(fù)孔，G/PHg、G/PH、G/GHg 和G/GH經(jīng)48深孔板培養(yǎng)36h分別接種30 μ L至裝有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的另一 48深孔板，30°C， 200rpm,培養(yǎng)60h，測(cè)定細(xì)胞密度0D_，經(jīng)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射 波長(zhǎng)505nm)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度。比較重組菌G/GHg和對(duì)照菌G/GH分別經(jīng)BSM和BMD培養(yǎng)60h后GFP比熒光強(qiáng)度 (F/0D_)，可見當(dāng)用BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，G/GHg和對(duì)照菌G/GH的GFP比熒光強(qiáng)度幾乎一致， 無(wú)法區(qū)分；當(dāng)用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，G/GHg和對(duì)照菌G/GH的GFP比熒光強(qiáng)度相差約300 (RFU/ OD600)，基本能區(qū)分，G/GHg的GFP比熒光強(qiáng)度為2456 (RFU/0D_)，G/GH檢測(cè)到比熒光強(qiáng)度為 2155(RFU/0D_)。比較重組菌G/PHg和對(duì)照菌G/PH分別經(jīng)BSM和BMD培養(yǎng)60h后比熒光強(qiáng)度(F/ OD600)，可見無(wú)論是用BSM培養(yǎng)基還是BMD培養(yǎng)基，G/PHg和對(duì)照菌G/PH的GFP比熒光強(qiáng)度 均能顯著區(qū)分，在利用BMD培養(yǎng)基時(shí)，G/PHg (8029 (RFU/0D_))與對(duì)照菌G/PH檢測(cè)到的比熒 光強(qiáng)度(2246 (RFUA)D6J)差異更顯著接近4500 (RFU/0D6 J ；相對(duì)而言，使用BSM培養(yǎng)基時(shí) 兩者差異較小約1500(RFU/0D_)，G/PHg的GFP比熒光強(qiáng)度為3528 (RFU/0D6 J，G/GH檢測(cè) 到的比熒光強(qiáng)度為1982(RFU/0D_)。同樣的，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)BSM和BMD培養(yǎng)60h的 G/PHg和對(duì)照菌G/PH熒光強(qiáng)度，結(jié)果與用96孔板經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)的結(jié)果一致，且用BMD 培養(yǎng)基與使用YPD培養(yǎng)基表達(dá)GFP效果一樣，如圖7。2、篩選條件的確定(1)保種板接種到預(yù)培養(yǎng)(pre-culture)不同接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響預(yù)培養(yǎng)板48孔深孔板每孔裝900yL BMD (0. 2 %葡萄糖)，分別從保種板 (masterplate)取 10 μ L、20 μ L、30 μ L 菌液至預(yù)培養(yǎng)板，30 °C，200rpm，培養(yǎng) 48h,每間隔 12h (Oh、12h、24h、36h、48h)取樣測(cè)細(xì)胞密度 OD600，如圖 8。本實(shí)驗(yàn)主要考查從預(yù)培養(yǎng)接種至篩選板48孔深孔板不同接種量對(duì)重組菌G/PHg、 G/GHg和對(duì)照菌生長(zhǎng)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明即使初始接種量不同(IOyL 30yL)，但對(duì)重 組菌的生長(zhǎng)無(wú)影響。對(duì)重組菌G/PHg、G/GHg和對(duì)照菌，初始接種量為10 μ L、20 μ L或30 μ L 時(shí)生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)保持一致如圖9A-C。從圖9可知，無(wú)論接種是多少，不同的重組菌在培養(yǎng) 24h后，都從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過渡至平穩(wěn)期，48h細(xì)胞已經(jīng)停止生長(zhǎng)，到48h細(xì)胞密度雖稍微有下 降趨勢(shì)，細(xì)胞密度0D_最終維持在同一水平(0D_ = 3.5 4.0)。所以，初始接種量范圍 在10 μ L 30 μ L均可，考慮到實(shí)驗(yàn)操作方便性(排槍最小量程為30 μ L)，后繼實(shí)驗(yàn)采用接 種量為30 μ Lo(2)預(yù)培養(yǎng)接種至篩選板不同接種時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響篩選板48孔深孔板每孔裝900 μ L BMD (1 %葡萄糖)，分別將預(yù)培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h、36h、48h 菌液取 30 μ L菌液至篩選板，30°C，200rpm,培養(yǎng) 60h，每間隔 12h (Oh、12h、24h、36h、 48h、60h)取樣測(cè)細(xì)胞密度0D_。本實(shí)驗(yàn)主要考查從預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板48孔深孔板不同接種時(shí)間對(duì)重組菌G/ PHg, G/GHg生長(zhǎng)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)板培養(yǎng)24h、36h、48h分別接種30 μ L至篩選 板，即使接種時(shí)間不同，但對(duì)重組菌的生長(zhǎng)并無(wú)影響，經(jīng)過篩選板培養(yǎng)60h后各重組菌細(xì)胞 密度OD600最終達(dá)到同一水平(OD600 = 8 . 3 8. 5)?？梢姡臃N時(shí)間在24h 48h范圍對(duì)重 組菌生長(zhǎng)無(wú)影響，但考慮到預(yù)培養(yǎng)板培養(yǎng)48h剛達(dá)到平穩(wěn)期并且0D_最終維持在同一水平 (OD600 = 3 . 5 4. 0)(如圖10)，所以36h為從預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板48深孔板最佳時(shí)間 點(diǎn)，后繼實(shí)驗(yàn)采用接種時(shí)間均為36h。(3)預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板不同接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響篩選板48孔深孔板每孔裝900 μ L BMDl %，分別將預(yù)培養(yǎng)板培養(yǎng)36h菌液取 10μ L、20y L、30y L、50y L 菌液至篩選板，30°C，200rpm，培養(yǎng) 60h,每間隔 12h(0h、12h、 24h、36h、48h、60h)取樣測(cè)細(xì)胞密度 0D6。。。比較從預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板48孔深孔板不同接種量對(duì)重組菌G/PHg、G/GHg和 對(duì)照菌生長(zhǎng)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)板培養(yǎng)36h分別接種10 μ L、20 μ L、30 μ L至篩選 板，雖接種量不同但生長(zhǎng)曲線并無(wú)明顯差異，經(jīng)過篩選板培養(yǎng)24h均從對(duì)數(shù)長(zhǎng)期過渡到平 穩(wěn)期，36h到60h后各重組菌細(xì)胞密度0D_始終維持在8左右；當(dāng)接種量提高至50 μ L時(shí)， 12h內(nèi)就達(dá)到了平穩(wěn)期，此后OD6tltl維持在9(如圖11)。所以，從預(yù)培養(yǎng)板接種至篩選板48 深孔板接種量范圍在10 30 μ L，對(duì)重組菌的生長(zhǎng)并無(wú)影響，綜上因素及考慮到實(shí)驗(yàn)操作 方便性(使用排槍最小量程為30 μ L)，后繼實(shí)驗(yàn)采用接種量為30 μ L。3、結(jié)果和討論利用48孔深孔板篩選啟動(dòng)子文庫(kù)，首先考查了四種培養(yǎng)基BMD、BSM、BMDY、YPD對(duì) 重組菌生長(zhǎng)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四種培養(yǎng)基中YPD和BMDY對(duì)菌體生長(zhǎng)最有利，培養(yǎng)60h后 OD600達(dá)到17左右；相對(duì)而言，利用BSM和BMD培養(yǎng)基60h后，細(xì)胞密度0D_較小分別為12 和9。在經(jīng)過48孔深孔板篩選后，須將深孔板中樣品一一對(duì)應(yīng)稀釋(0D·為0. 2-1)并轉(zhuǎn)移 至96孔板，以便于報(bào)告蛋白熒光強(qiáng)度和細(xì)胞密度的測(cè)定，因此細(xì)胞密度太高并不利于后繼 實(shí)驗(yàn)操作(0D·和熒光強(qiáng)度檢測(cè))，利用BSM和BMD培養(yǎng)60h后，OD6tltl范圍均在10內(nèi)，只需 將樣品稀釋10倍OD6tltl = 0. 2-1，便于檢測(cè)，所以四種培養(yǎng)基中BMD和BSM較適用于48孔深 孔板篩選。在檢測(cè)四種培養(yǎng)基BMD、BSM、BMDY, YPD對(duì)GFP熒光強(qiáng)度檢測(cè)干擾時(shí)，發(fā)現(xiàn)BSM培 養(yǎng)基對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定干擾最小(BSM 537 (RFU) ；PBS 460 (RFU))，其次是BMD 616 (RFU)。無(wú) 菌培養(yǎng)基BMDY和YPD經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)是PBS (460/RFU)的100倍。因此培 養(yǎng)基BMD和BSM有利于報(bào)告蛋白GFP熒光強(qiáng)度測(cè)定，而BMDY和YPD對(duì)于檢測(cè)的干擾太大， 不適于48孔深孔板篩選培養(yǎng)基。鑒于BSM和BMD培養(yǎng)基對(duì)GFP熒光強(qiáng)度測(cè)定干擾極小且利用這兩種培養(yǎng)基細(xì)胞 密度不至于太高，隨后主要考查了這兩種培養(yǎng)基對(duì)重組菌GFP表達(dá)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用 BMD與YPD培養(yǎng)基重組菌表達(dá)GFP水平一致，而用BSM重組菌表達(dá)GFP的水平明顯弱于前 者。因此，利用48孔深孔板篩選啟動(dòng)子文庫(kù)，最適培養(yǎng)基為BMD。通過實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)GFP的重組菌，當(dāng)0D_在0.2-1范圍內(nèi)，其GFP熒光強(qiáng)度與細(xì)胞密度0D_成線性關(guān)系；不表達(dá)GFP對(duì)照菌檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞密度無(wú)關(guān)；可通過計(jì) 算比熒光強(qiáng)度，評(píng)估表達(dá)GFP的重組菌與對(duì)照菌的GFP熒光強(qiáng)度的差異，從而評(píng)估重組菌調(diào) 控GFP表達(dá)的啟動(dòng)子強(qiáng)度。利用48孔深孔板作為啟動(dòng)子文庫(kù)的篩選工具操作流程如下(1)首先將涂布于MD篩選平板上的突變菌的單菌落培養(yǎng)至直徑約3mm大小。(2)保種板48孔深孔板中每孔裝600 μ L YPD，挑取MD平板上直徑3mm單菌落至孔板中，一個(gè) 單菌落對(duì)應(yīng)一個(gè)孔，300C，200rpm,培養(yǎng)24h，然后每孔加入60%甘油300 μ L，30°C，200rpm, 培養(yǎng)30min，制備成甘油保藏的master plate，最后將master-plate置于-80保存以便后 繼實(shí)驗(yàn)使用。(3)預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)板48孔深孔板每孔裝900 μ L BMD (0. 2%葡萄糖)，取master-plate培養(yǎng) 24h的菌液30 μ L至對(duì)應(yīng)的預(yù)培養(yǎng)板的孔板中，300C，200rpm,培養(yǎng)36h，預(yù)培養(yǎng)板各深孔中 細(xì)胞密度基本一致(各孔間0D_均一性)。(4)蹄選篩選板48孔深孔板每孔裝900 μ L BMD (1 %葡萄糖)，從預(yù)培養(yǎng)板的孔中取30 μ L 菌液至篩選板，30°C，200rpm，培養(yǎng)36h，利用篩選板以篩選出具有不同啟動(dòng)子強(qiáng)度的重組細(xì) 胞。實(shí)施例3、GAP啟動(dòng)子突變文庫(kù)的構(gòu)建為了構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，獲得啟動(dòng)子強(qiáng)度范圍較寬且啟動(dòng)子強(qiáng)度成梯度變化的突變 啟動(dòng)子，必須得到具有豐富突變的啟動(dòng)子和快速有效篩選突變體的方法。易錯(cuò)PCR(EP-PCR) 是一種簡(jiǎn)便快速地在DNA序列中隨機(jī)制造突變的方法。其基本原理是通過改變傳統(tǒng)PCR反 應(yīng)體系中某些組分的濃度(如dNTP和Mg2+的濃度)，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)誤引入而 創(chuàng)造序列的多樣性。易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，一般有益突變的頻率很低， 絕大多數(shù)突變是有害的或中性的。當(dāng)突變頻率太高時(shí)，幾乎無(wú)法篩選到有益突變；當(dāng)突變頻 率太低，則未發(fā)生任何突變的野生型在突變?nèi)后w中將占優(yōu)勢(shì)，也很難篩選到理想的突變體。 一般Ikb目標(biāo)基因內(nèi)有1.5 5個(gè)堿基發(fā)生堿基替換時(shí)，誘變結(jié)果最理想。所以，本發(fā)明人 的首要任務(wù)是確定突變頻率在1 % 5 % (GAP是500bp，按1 % 5 %計(jì)算，堿基突變個(gè)數(shù)為 5 25)范圍的EP-PCR反應(yīng)條件。為了快速有效篩選到有效的突變體，用突變啟動(dòng)子調(diào)控 報(bào)告基因gfp的表達(dá)，構(gòu)建突變表達(dá)載體和相應(yīng)的重組菌，將重組菌置于48深孔板中培養(yǎng)， 利用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量快速篩選。1、GAP啟動(dòng)子的突變很多研究顯示，易錯(cuò)PCR的突變率受Taq酶保真性的影響。加入Mn2+后，Taq酶 保真性隨著反應(yīng)體系中Mg2+的濃度增加而降低。不同dNTP的配比濃度也影響Taq酶保真 性。其中，Mn2+濃度通常0. 5mM，而Mg2+的濃度隨著對(duì)突變率的要求不同，會(huì)有不同的濃度， 通常為2 10mM。為了優(yōu)化易錯(cuò)PCR的反應(yīng)條件，以達(dá)到需要的突變率(1% 5% )，本發(fā) 明人以不同的Mg2+濃度4mM、6mM、8mM和IOmM分別進(jìn)行了易錯(cuò)PCR反應(yīng)，每個(gè)Mg2+濃度各 挑選十個(gè)突變克隆測(cè)序并統(tǒng)計(jì)其突變率。Mg2+離子濃度為4mM時(shí)所產(chǎn)生的突變率較低只有 0.7%，而Mg2+離子濃度為IOmM時(shí)產(chǎn)生的突變率為1. 5%較適中能滿足實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)過三輪EP-PCR突變率達(dá)到4. 1 %。4mM、6mM、8mM和IOmM的Mg2+濃度易錯(cuò)PCR反應(yīng)突變率分別 為 0. 3%,0. 7%,0. 8%, 1. 5%。為了增加易錯(cuò)PCR的突變率，本發(fā)明人在第一輪易錯(cuò)PCR的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了第 二和第三輪的易錯(cuò)PCR?？紤]到實(shí)驗(yàn)希望達(dá)到的突變率，實(shí)驗(yàn)中，EP-PCR反應(yīng)體系的Mn2+、 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 濃度固定不變分別為 0. 5mM、0. 2mM、0. 2mM、ImM、ImM。每輪易錯(cuò) PCR 的Mg2+離子濃度都定為10mM。第二和第三輪EP-PCR的模板分別為第一輪EP-PCR和第二 輪EP-PCR的回收產(chǎn)物。經(jīng)過三輪EP-PCR，突變率可達(dá)到3 % -4. 1 %。2、GAP啟動(dòng)子突變文庫(kù)的構(gòu)建(1)重組畢赤酵母細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建突變的啟動(dòng)子GAP分別用限制性內(nèi)切酶SpeI和Not I雙酶切，將該片段與同樣經(jīng) SpeI和Not I雙酶切后載體pGHg分別連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，獲得混合克隆D/GlstHg、D/G2ndHg和 D/GMHg。最終獲得重組混合質(zhì)粒pGlstHg、pG2ndHg和pGMHg。重組混合質(zhì)粒分別用限制性酶 BspeI酶切線性化，電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115，獲得轉(zhuǎn)化子G/GlstHg、G/G2ndHg和G/GMHg。轉(zhuǎn)化后 涂布MD平板，30°C倒置培養(yǎng)3 5天，直到單克隆出現(xiàn)。采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，PCR所 用引物分別為GAP primer和gfp R0陽(yáng)性克隆PCR條帶理論大小約SOObp (如圖12)。所 有陽(yáng)性重組菌構(gòu)建成畢赤酵母GAP突變啟動(dòng)子細(xì)胞庫(kù)。(2)突變啟動(dòng)子文庫(kù)篩選利用48孔深孔板作為啟動(dòng)子文庫(kù)的篩選工具，按照?qǐng)D8的操作流程篩選出具有不 同啟動(dòng)子強(qiáng)度的重組細(xì)胞。利用7塊48深孔板篩選了 300個(gè)突變啟動(dòng)子重組細(xì)胞，獲得了 強(qiáng)度成梯度分布的PeAP突變文庫(kù)，表1為啟動(dòng)子文庫(kù)調(diào)控綠色熒光蛋白在重組畢赤酵母中 的表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。并將該突變啟動(dòng)子文庫(kù)中的7個(gè)突變啟動(dòng)子經(jīng)PCR克 隆至T載體測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖14突變啟動(dòng)子文庫(kù)中的7個(gè)突變啟動(dòng)子(Gl，G2，G3，G4， G5，G6，G7)多核苷酸序列均存在差異，可得出結(jié)論，文庫(kù)中突變啟動(dòng)子強(qiáng)度的差異確實(shí)是由 于pGAP序列的突變引起。表l、pGAP突變文庫(kù)調(diào)控綠色熒光蛋白在重組畢赤酵母中表達(dá) 將Gl，G2，G3，G4，G5，G6和G7細(xì)胞用試管培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度， 如圖13，其結(jié)果與熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果一致，可見能將48深孔板900 μ L放大至試管3mL， 再一次證明了文庫(kù)中突變啟動(dòng)子強(qiáng)度的差異確實(shí)是由于pGAP序列的突變引起。啟動(dòng)子文 庫(kù)的獲得可保證對(duì)所調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)行梯度調(diào)節(jié)，實(shí)施可控基因擾動(dòng)和系統(tǒng)分析。(3)突變啟動(dòng)子序列分析通過對(duì)突變啟動(dòng)子文庫(kù)中Gl (SEQ ID NO 1), G2 (SEQ ID NO 2), G3 (SEQ ID NO: 3)，G4(SEQ ID NO :4)，G5(SEQ ID NO :5)，G6(SEQ ID NO 6)和G7(SEQIDN0 7)的序列分析， 見圖14，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)突變啟動(dòng)子突變的堿基分布較平均，突變率分別為3. 35%,2.31%, 1.89%, 2. 73%,1.26%, 2. 10%和2. 52%。因此，所構(gòu)建的突變啟動(dòng)子文庫(kù)中啟動(dòng)子的突變
較豐富。
綜上，通過調(diào)整EP-PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度，獲得了適中的EP-PCR突變率，當(dāng)Mg2+ 濃度為IOmM時(shí)，EP-PCR突變率達(dá)到1. 3%。經(jīng)過三輪EP-PCR，堿基的突變率在1. 3% -4% 范圍。本實(shí)施例完成了 GAP啟動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建和篩選，通過對(duì)重組細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白熒 光的檢測(cè)，獲得了一系列強(qiáng)度梯度改變的啟動(dòng)子，還篩選到啟動(dòng)子強(qiáng)度比未突變啟動(dòng)子GAP 強(qiáng)度略高的突變子。根據(jù)篩選結(jié)果，將突變后啟動(dòng)子從重組細(xì)胞中經(jīng)PCR克隆進(jìn)行測(cè)序，分 析其突變率及位置，發(fā)現(xiàn)突變的堿基均不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變啟動(dòng)子文庫(kù)中的7個(gè)突變 啟動(dòng)子多核苷酸序列均存在差異，可得出結(jié)論，文庫(kù)中突變啟動(dòng)子強(qiáng)度的差異確實(shí)是由于 PGAP序列的突變引起；經(jīng)熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，pGAP突變文庫(kù)調(diào)控綠色熒光蛋白 在重組畢赤酵母中表達(dá)量呈梯度似變化。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
0183]序列表
0184]<110>華東理工大學(xué)
0185]<120>GAP啟動(dòng)子文庫(kù)及其用途
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0188]<170>PatentIn version 3.3
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0192]<213>人工序列
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0194]<223>突變型GAP啟動(dòng)子
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0197]ctccgttgca actccgaacg acctgcaggc aacgtaaaat tctctggggt aaaacctaaa 120
0198]tgtggagtaa tggaaccagg aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttact 180
0199]gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgtt 240
0200]cttcccagca ttacgttgcg ggtaatacgg aggtcgagta cccgacctag cagcccaggg 300
0201]atggaaaagt cccagccgtc gctggcaata atagcgggcg gacgcatgcc atgagtttat 360
0202]tggagaccac cagaatcgaa tataaaaggc gaacaccttt cccaatgttg gtttctcctg 420
0203]acccaaagac tttaaatcta atttatctgt ccctatttca atcaattgaa caactat477
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gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgt tttgcgagat acccagatcatatgaaacaa240
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attgaagatg gttctgttca attagctgac540
ggtccagtct tgttaccaga caaccattac600
ccaaacgaaa agagagacca catggtcttg660
catggtatgg atgaattgta caaataa71權(quán)利要求
一種突變型GAP啟動(dòng)子文庫(kù)，其特征在于，所述的啟動(dòng)子文庫(kù)包括SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子文庫(kù)，其特征在于，所述的SEQID N0:1、SEQ IDNO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 所示核苷酸序列 的啟動(dòng)子具有依次減弱的啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度。
3.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子文庫(kù)，其特征在于，所述的SEQID NO :1所示核苷酸序列 的啟動(dòng)子相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子是增強(qiáng)型GAP啟動(dòng)子；所述的SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 所示核苷酸序列的啟動(dòng)子相 對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子是弱化型GAP啟動(dòng)子。
4.一種載體，其特征在于，所述的載體含有SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQID NO :3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列，作為啟動(dòng)子 元件。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體；或其基因組中整合有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的核酸。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是畢赤酵母 (PichiaPastoris)細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫(kù)的用途，其特征在于，用于提供突變型GAP 啟動(dòng)子，將所述突變型GAP啟動(dòng)子可操作性地與目的基因連接，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。
8.一種篩選突變型GAP啟動(dòng)子的方法，所述的突變型GAP啟動(dòng)子相對(duì)于野生型GAP啟 動(dòng)子、啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度發(fā)生變化，其特征在于，所述方法包括(1)提供重組表達(dá)載體1，所述重組表達(dá)載體1含有GAP啟動(dòng)子突變體序列，以及與所 述GAP啟動(dòng)子突變體序列操作性相連的報(bào)告基因序列；將該重組表達(dá)載體1轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 獲得重組宿主細(xì)胞1，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞1 ；(2)提供重組表達(dá)載體2，所述重組表達(dá)載體2含有野生型GAP啟動(dòng)子序列，以及與所 述野生型GAP啟動(dòng)子序列操作性相連的報(bào)告基因序列；將該重組表達(dá)載體2轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 獲得重組宿主細(xì)胞2，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞2 ；(3)觀察所述的重組宿主細(xì)胞1表達(dá)報(bào)告基因的情況，若相對(duì)于重組宿主細(xì)胞2，重組 宿主細(xì)胞1報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生變化，則該重組宿主細(xì)胞1中重組表達(dá)載體1攜帶的 GAP啟動(dòng)子突變體為所需的突變型GAP啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟⑴或⑵中，用BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)重組 宿主細(xì)胞的方法包括(a)用BMD培養(yǎng)基A預(yù)培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞30-50小時(shí)；其中，所述的BMD培養(yǎng)基A中 葡萄糖濃度0. 2 士 0.05% ；(b)將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BMD培養(yǎng)基B，培養(yǎng)30-65小時(shí)；其中，所述的 BMD培養(yǎng)基B中葡萄糖濃度1 士0. 2%。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白，且步驟(2)中，觀察所述的重組宿主細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因的情況的方法包括測(cè)定含有所述的重組 宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明涉及GAP啟動(dòng)子文庫(kù)及其用途。本發(fā)明公開了GAP啟動(dòng)子文庫(kù)中各啟動(dòng)子的核酸序列，含有所述核酸序列的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開了篩選所需的突變型啟動(dòng)子的方法。本發(fā)明建立了有效的篩選模型，獲得了強(qiáng)度成梯度分布的突變型GAP啟動(dòng)子文庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的連續(xù)微調(diào)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101922047SQ200910053198
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者儲(chǔ)炬, 莊英萍, 張嗣良, 秦秀林, 肖慈英, 錢江潮 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)