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      啟動子afb4及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:583748閱讀:507來源:國知局

      專利名稱::啟動子afb4及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及啟動子AFB4及其應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      :啟動子按其作用方式和功能可以分為三類組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子在所有組織中都能啟動表達,有表達的持續(xù)性,沒有時空特異性,如CaMV35S啟動子等。該類啟動子得到了大量研究和應(yīng)用,在基因工程中發(fā)揮重要作用。但由于其表達不分時空,會導(dǎo)致外緣基因表達的過量積累,會影響植物正常的生長發(fā)育。因此,尋找誘導(dǎo)型或組織特異性的啟動子,對于基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種都具有重要作用。
      發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種具有特異表達啟動子功能的DNA片段。本發(fā)明所提供的DNA片段,為如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段;2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段;3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。擴增上述任一所述DNA片段全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對中,一條引物序列如序列表中序列2所示,另一條引物序列如序列表中序列3所示。含有上述任一所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述DNA片段在使目的基因在植物的側(cè)根產(chǎn)生處和/或植物的葉鋸齒邊緣處表達中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應(yīng)用中,所述側(cè)根產(chǎn)生處為主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處。上述應(yīng)用中,所述植物為雙子葉植物。上述應(yīng)用中,所述雙子葉植物為擬南芥。上述任一所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應(yīng)用中,所述植物為雙子葉植物;所述雙子葉植物為擬南芥。實驗證明,本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子,且該啟動子有很強的特異表達活性,特異的在植物的側(cè)根產(chǎn)生處(主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處)和葉的鋸齒邊緣處表達。本發(fā)明啟動子為特異表達的基因功能研究和植物的轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具,具有重要意義。圖1為PCR擴增得到AFB4的啟動子。圖2為表達載體的酶切鑒定。圖3為P-AFB4-1391-⑶S載體示意圖。圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定。圖5為AFB4啟動子的GUS活性。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、啟動子的制備及特異表達驗證一、啟動子的制備及確認(rèn)1、擬南芥基因組DNA的提取(1)取擬南芥葉片,加入液氮,充分研磨后,將粉末倒入1.5ml離心管中;(2)待離心管中液氮揮發(fā)完全后,立即加入500ulDNA提取緩沖液(0.Imol/LTris‘HCl(pH8.0),0.5mol/LNaCl,0.05mol/LEDTA,0.5%SDS),充分混勻后,65°C保溫30分鐘,期間不斷溫和上下顛倒離心管,使樣品與緩沖液充分混合;(3)以12,OOOrpm室溫離心15分鐘;(4)將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管;(5)加入等體積tris-酚,抽提一遍;(6)再用等體積的氯仿抽提一遍;(7)取上清,加入等體積異丙醇,輕柔晃動離心管,使異丙醇與上清液充分混勻,-20靜置10分鐘,以12,OOOrpm離心10分鐘;(8)用70%的乙醇洗劑,DNA沉淀在超凈工作臺吹干后,用滅菌雙蒸水溶解備用。2、PCR擴增以擬南芥基因組DNA為模板,用引物對Pl和P2進行PCR擴增。引物序列如下Pl:ACTGCAGCTGACTCACTAAGTCGTCCAT(序列2),P2TGGATCCCTCTGACTTTGATCTTATCCA(序列3),反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示(M=Marker;-:PCR空白對照;P:PCR擴增產(chǎn)物)?;厥漳康臈l帶。將目的產(chǎn)物與載體EZ-T連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,抗性篩選培養(yǎng),挑取單克??;將單克隆接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng),提取質(zhì)粒,將質(zhì)粒進行測序。測得的序列如SEQUENCEID:1所示,將得到的陽性重組質(zhì)粒記作P-AFB4-EZ-T,將SEQUENCEID:1所示的DNA片段記作AFB4。載體EZ-T購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司,產(chǎn)品目錄號為T168-10。二、啟動子的組織特異性驗證pCAMBIA1391Z購自CAMBIA(澳大利亞)。農(nóng)桿菌菌株AGLlATCCNo.BAA-101購自ATCC。(一)轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶消化P-AFB4-EZ-T,回收約2000bp的目的片斷,同時用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶消化表達載體pCAMBIA1391Z,回收載體片斷,然后將目的片斷和載體片斷進行連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,抗性篩選培養(yǎng),挑取單克隆;將單克隆接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng),提取質(zhì)粒,將質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證。酶切結(jié)果如圖2所示(M=Marker;1酶切產(chǎn)物),測得pCAMBIA1391Z的HindIII和BamHI酶切位點間插入的基因序列如SEQUENCEID1所示,表明構(gòu)建的載體正確,將得到的陽性重組表達載體記作P-AFB4-1391Z。該載體中⑶S只受AFB4—個DNA片段調(diào)控,不受任何其它啟動子調(diào)控(圖3)。用電轉(zhuǎn)化方法將重組表達載體P-AFB4-1391Z導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGLl中,抗性篩選,得到陽性重組農(nóng)桿菌,記作AGL1/P-AFB4-1391Z。通過農(nóng)桿菌侵染花序的方法進行擬南芥轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化得到的種子鋪在含有潮霉素抗性的培養(yǎng)基上篩選,得到的陽性苗子為TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥。同時將空載體pCAMBIA1391Z轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株AGLl,得到陽性重組農(nóng)桿菌,記作AGLl/pCAMBIA1391Z。用重組農(nóng)桿菌AGLl/pCAMBIA1391Z轉(zhuǎn)化擬南芥,得到TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。(二)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定PCR鑒定以TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板,用引物P1/P4進行PCR擴增;擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。以重組表達載體P-AFB4-1391Z為PCR陽性對照。Pl:ACTGCAGCTGACTCACTAAGTCGTCCAT(序列2),為AFB4的特異引物;P4GGGTCCTAACCAAGAAAATGA,為GUS的特異引物;結(jié)果如圖4所示。圖中,1、2、3表示轉(zhuǎn)基因擬南芥,+表示PCR陽性對照,-表示轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1391Z擬南芥。結(jié)果,獲得20株轉(zhuǎn)基因擬南芥苗子。(三)轉(zhuǎn)基因擬南芥中啟動子的特異表達取TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥生長15天的幼苗進行⑶S染色。結(jié)果⑶S活性主要存在兩個位置,一是側(cè)根產(chǎn)生處(進一步觀察是在主根與側(cè)根結(jié)合處的維管柱處),二是葉片的鋸齒邊緣。同時以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391Z擬南芥作為陰性對照。具體方法是將整個擬南芥幼苗加入染色液(50mM磷酸緩沖液;5mM鐵氰化鉀;5mM亞鐵氰化鉀;IOmMEDTA;ImMX-gluc)中,37°C保溫過夜,用70%乙醇脫色2-3次,至陰性對照材料呈白色,顯微鏡觀察,白色背景下的藍色即為GUS表達位點。20株陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥均進行⑶S染色。結(jié)果如圖5所示。白色箭頭所指為⑶S染色位置。結(jié)果顯示,陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中,GUS活性均集中在側(cè)根產(chǎn)生處(主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處)和葉的鋸齒邊緣;而轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1391Z擬南芥中均未見著色。該結(jié)果說明,本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子,啟動了GUS的表達,且該啟動子有很強的特異表達活性,特異在主根與側(cè)根結(jié)合的微管柱處和葉片鋸齒邊緣中高表達,對于將來的轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。權(quán)利要求一種DNA片段,為如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段;2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段;3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。2.擴增權(quán)利要求1所述DNA片段全長或其任意片段的引物對。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對,其特征在于所述引物對中,一條引物序列如序列表中序列2所示,另一條引物序列如序列表中序列3所示。4.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。5.權(quán)利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物的側(cè)根產(chǎn)生處和/或植物的葉鋸齒邊緣處表達中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用,其特征在于所述側(cè)根產(chǎn)生處為主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的應(yīng)用,其特征在于所述植物為雙子葉植物。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的應(yīng)用,其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。9.權(quán)利要求1中所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其特征在于所述植物為雙子葉植物;所述雙子葉植物為擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開了啟動子AFB4及其應(yīng)用。該啟動子是如下1)、2)、3)或4)所示DNA片段1)序列表中序列1所示的DNA片段;2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段;3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。實驗證明,本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子,且該啟動子有很強的特異表達活性,特異的在植物的主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處和葉的鋸齒邊緣處表達。本發(fā)明啟動子為特異表達的基因功能研究和植物的轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具,具有重要意義。文檔編號C12N15/11GK101831431SQ20101018322公開日2010年9月15日申請日期2010年5月19日優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日發(fā)明者儲成才,曹守云,王猛,王秀杰申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
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