專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Oshox24P的鑒定和利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種植物逆境特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離 鑒定和應(yīng)用。通過(guò)分離和鑒定一個(gè)水稻干旱誘導(dǎo)型基因的啟動(dòng)子，可以將其應(yīng)用于植物的 基因工程中，以達(dá)到植物遺傳改良特別是提高植物抗旱性的目的。
背景技術(shù)：
干旱一直是造成作物減產(chǎn)的重要原因之一，并且隨著全球環(huán)境惡化、氣候異常將 日益危害著糧食生產(chǎn)安全。對(duì)于中國(guó)這樣一個(gè)淡水資源短缺的國(guó)家，這一點(diǎn)更為明顯。提 高植物抗旱性一直以來(lái)都是一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。一方面轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為研究功能基 因組學(xué)的有效手段，另一方面，通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑改良植物抗逆性近年來(lái)正逐步得到可行性 論證和普遍接受。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)在植物中超量表達(dá)逆境應(yīng)答相關(guān)基因能夠在 一定程度上提高植物的抗逆性(Saijo 等，Over-expression ofa single Ca2+_d印endent proteinkinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23 :319-327,2000 ；Zhang 等，Twocysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Mol Biol 68 :131-143, 2008 ;Hou 等，A homo log of human ski-interactingprotein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance. Proc Natl Acad Sci 106 :6410_6415,2009 ;Ma 等，Enhanced tolerance to chilling stress in 0sMYB3R_2transgenic rice is mediated by alteration in cell cycleand ectopic expression of stress genes.PlantPhysiol 150:244-56,2009)。 但是報(bào)道中的這些超量表達(dá)通常用的都是組成型啟動(dòng)子，盡管組成型啟動(dòng)子超量表達(dá)效 應(yīng)高，但是通常會(huì)伴隨著負(fù)面效應(yīng)，如對(duì)植物產(chǎn)生毒害或負(fù)擔(dān)或者使轉(zhuǎn)基因植株致死等 (Shavindra 等,Transgenic approaches to increase dehydration-stresstolerance in plmts.Mol Breed 5:493_503，1999)。盡管已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道從植物中分離出受逆 境應(yīng)答的啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozaki 等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29gene ofArabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet 23 :331_340，1993；Kasuga 等，A combination ofthe Arabidopsis DREBlA gene and stress-indueibIe rd29A promoter improved drought—and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol 45 :346_350，2004 ;Xiao 等，Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor Appl Genetll5 :35_46，2007)，但是在重要糧食作物水稻中尚且少有很強(qiáng)的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 應(yīng)用于植物基因工程。HD-Zip (homeodomain-leucine zipper)基因是一類(lèi)植物中特有 的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，在植株的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答中發(fā)揮著多種功能(Scarpella等， A role for the rice homeobox gene Oshoxl in provascular cell fatecommitment. Development 127 :3655_3669，2000 ；Agalou 等，A genome-wide survey ofHD-Zip genesin rice andanalysis of drought-responsive family members. Plant Mol Biol 66: 87-103,2007 ；Dai Functional analysis ofrice H0ME0B0X4(0shox4) gene reveals a negative function in gibberellin responses. Plant Mol Biol66 :289_301，2007 ;Itoh 等，Developmental role and auxin responsiveness of Class III homeοdomain leucine zippergene family members in rice. Plant Physiol,147 (4) : 1960-1975，2008)。本發(fā)明是鑒定一個(gè)受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)的水稻HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子，通過(guò) 啟動(dòng)子活性定量分析表明，可以將該啟動(dòng)子用于抗逆性相關(guān)基因在水稻等作物中的表達(dá)， 從而有效地提高植株的抗逆境性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆、鑒定一個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的植物內(nèi)源啟動(dòng)子，并利用 該啟動(dòng)子構(gòu)建抗旱相關(guān)基因表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到控制目標(biāo)基因特異地受逆境 表達(dá)的目的。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施首先是分離受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的候選基因的啟動(dòng)子。所選擇的候選基因是水 稻內(nèi)源基因HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，命名為0shox24 (Adamantia等，A genome-wide survey ofHD-Zip genes in rice andanalysis of drought-responsive family members, Plant Mol Biol 66 :87_103，2008) (Κ0ΜΕ 注釋號(hào) AK063685)。該基因在水稻品種“中 旱5號(hào)”、“中花11”和“珍汕97”的苗期干旱脅迫中均受到強(qiáng)烈的上升誘導(dǎo)表達(dá)(如圖 2)。所分離的該基因的啟動(dòng)子來(lái)源于水稻品種“中旱5號(hào)”，命名為0shox24P。0shox24P 啟動(dòng)子是具有附圖1中堿基第1-1918位的序列；在88-92、684-688、895-899、957-961、 1480-1484、1550-1554、1681-1685、1820-1824堿基位點(diǎn)含有與逆境相關(guān)的ABA應(yīng)答元 件 ABRELATERD1(Simpson 等，Two different novelcis-acting elements of erd 1, a cIpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress anddark-induced senescence.Plant J 33 259~270,2003 ；Nakashima 等， Transcriptional regulation of ABI3-andABA_responsive genes including RD29B and RD29A in seeds, germinating embryos, and seedlings of rabidopsis. Plant Mol Biol. 60 :51_68，2006)，在448-455堿基位點(diǎn)含有逆境相關(guān)的ABA應(yīng)答元件 ABRE0SRAB21(Marcotte Abscisic acid-responsive sequences from the Em gene of wheat. Plant Cell 1 :969_976,1989 ;Busk 等，Regulation ofabscisic acid-induced transcription, Plant Mol Biol 37 :425_435,1998 ；Skriver 等，Geneexpression in response to abscisic acid and osmotic stress, Plant Cell 2 :503_512,1990),在 415-421、956-962、1233-1239、1680-1686、1789-1795、1819-1825 堿基位點(diǎn)含有逆境相
ΑΒΑABRERATCAL (Kaplan φ, Rapid Transcriptome Changes Induced by
Cytosolic Ca2+Transients Reveal ABRE-RelatedSequences as Ca2+-Responsive cis Elements in Arabidopsis. Plant Cell 18 :2733_2748，2006)。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子0shoX24P區(qū)域含有多個(gè)與逆境相關(guān)的順式作用元件(如 附圖1所示)，能特異性地對(duì)逆境和脫落酸(ABA)起應(yīng)答反應(yīng)。申請(qǐng)人利用0shox24P啟動(dòng) 子構(gòu)建的GUS表達(dá)載體(如附圖3所示)轉(zhuǎn)化水稻受體品種中花11，可以在轉(zhuǎn)基因植株受到逆境脅迫時(shí)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)報(bào)告基因GUS的表達(dá)(如附圖4所示)。本發(fā)明的效果詳見(jiàn)具體 實(shí)施方式。詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述一種分離出的水稻DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1和附圖1所示，其中啟 動(dòng)子0shox24P包含附圖1所示的序列中的1-1918位堿基的核酸序列。所述的一種分離的DNA分子，其特征在于區(qū)域內(nèi)除基本啟動(dòng)子元件外 (TATA-box)，還包含多個(gè)逆境應(yīng)答順式作用元件(ABRELATERDUABRE0SRAB2UABRERATCAL) 的組合。所述的0shoX24P啟動(dòng)子全部或部分序列構(gòu)建的水稻表達(dá)載體。
所述的0shoX24P啟動(dòng)子全部或部分序列構(gòu)建水稻表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育 改良植物的方法。所述的0shoX24P啟動(dòng)子全部或部分序列構(gòu)建水稻表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育 的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、種子或細(xì)胞無(wú)性系。按照以上的技術(shù)方案，很顯然，申請(qǐng)人或申請(qǐng)人以外的其他人可以利用本發(fā)明所 提供的0shox24P啟動(dòng)子構(gòu)建抗逆相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物的抗逆性。受 體植物可以是包括水稻、小麥、玉米等在內(nèi)的禾谷類(lèi)作物，當(dāng)然也可以是包括其他一些重要 的經(jīng)濟(jì)作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的水稻啟動(dòng)子0shox24P的核苷酸序列。圖1 是本發(fā)明克隆的0shox24P啟動(dòng)子序列。下劃線序列為擴(kuò)增0shox24P啟動(dòng) 子所用的引物序列。陰影顯示的是基本啟動(dòng)子元件序列。逆境應(yīng)答ABRE元件核心序列用 紅色并加波浪線表示。圖2 顯示的是0shox24基因在苗期水稻品種“中旱5號(hào)”、“中花11”、“珍汕97” 中，當(dāng)植株受到干旱脅迫時(shí)能夠被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)。圖3 顯示的是本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-0shoX24P表達(dá)載體。該載 體含潮霉素抗性篩選基因(HRG)，啟動(dòng)子0shoX24P被融合到⑶S基因5’端非翻譯區(qū)。圖4 顯示的是0shox24P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在干旱脅迫處理下的⑶S活性。 CK是P1391Z空載體轉(zhuǎn)化的中花11，作為對(duì)照家系，TG1、TG2和TG3是pl391Z_0shox24P轉(zhuǎn) 化中花11得到的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次是d0、干旱脅迫前；dl、葉 片微卷；d2、葉片半卷；d3葉片全卷。圖5 顯示的是0shox24P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在200mM NaCl脅迫處理 下的⑶S活性。CK是P1391Z空載體轉(zhuǎn)化的中花11，作為對(duì)照家系，TGU TG2和TG3是 pl391Z-0shoX24P轉(zhuǎn)化中花11得到的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是脅迫 0h、3h、6h、24h。圖6 顯示的是0shox24P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在IOOmM ABA脅迫處理下 的⑶S活性。CK是P139IZ空載體轉(zhuǎn)化的中花11，作為對(duì)照家系，TGl、TG2和TG3是 pl391Z-0shoX24P轉(zhuǎn)化中花11得到的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是脅迫 0h、0. 5h、3h、24h。
圖7 顯示的是0shox24P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在4°C冷脅迫處理下的⑶S活 性。CK是P1391Z空載體轉(zhuǎn)化的中花11，作為對(duì)照家系，TG1、TG2和TG3是pl391Z_0shox24P 轉(zhuǎn)化中花11得到的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是脅迫0h、6h、12h、24h。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、0shox24P啟動(dòng)子分離和鑒定通過(guò)水稻品種“中旱5號(hào)”(由中國(guó)上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的商業(yè)品種)的干旱誘 導(dǎo)基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達(dá)量提高30倍以上) 的基因，其 TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/) ID 為 L0C02g43330，被命名為 0shox24(Adamantia 等，Agenome-widesurvey of HD-Zip genes in rice and analysis ofdroug ht-responsive family members, Plant Mol Biol 66 :87_103，2008)，)(寸/S白勺 BAC 克隆號(hào)為 AP004868，在KOME數(shù)據(jù)庫(kù)(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)中對(duì)應(yīng)的全 長(zhǎng) cDNA 編號(hào)為 AK063685。下一步就是分離該基因的啟動(dòng)子。具體步驟如下在NCBI (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)找到該基因?qū)?yīng)的粳稻“日本晴”的基因組序列(AP004868)并選取該基因 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2. 5Kb的范圍作為候選啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物0shox2 4P-F(5，-ATAGGATCCAGACGAGAAAGGAGTGCC-3，)和 0shox24P_R(5，-ACAGGATCCCGAATGTAAGAC CAGAGCA-3’ )，并在引物5’端添加限制性酶切位點(diǎn)BamHI (用斜體加下劃線表示，酶切位點(diǎn) 前的三個(gè)堿基為保護(hù)堿基)。首先利用引物0shoX24P-F和0shoX24P-R以“中旱5號(hào)”基 13組 DNA (CTAB ^去才由■，Zhang 等，genetic diversity and differentiation of indicaan japonica rice detected by RFLP analysis, 1992,Theor Appl Genet,83,495-499)為模 板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20uL GC buffer I體系(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，即 TaKaRa 公司)，反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2mim, 32 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物連入pGEM-TEasy載體上，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序(ABI3730測(cè)序 儀，Applied Biosystem，測(cè)序在國(guó)家植物基因中心[武漢]完成)，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增序列 為預(yù)期的0shox24P啟動(dòng)子序列，其包含多個(gè)干旱、ABA逆境應(yīng)答順式作用元件(如圖1)。實(shí)施例2、檢測(cè)水稻內(nèi)源基因0shox24的誘導(dǎo)表達(dá)以水稻品種“中旱5號(hào)”、“中花11”、“珍汕97”為材料，種在大棚的沙土中，3葉 期時(shí)進(jìn)行斷水干旱脅迫。脅迫前取do時(shí)間點(diǎn)樣品，干旱至葉片微微卷起時(shí)取dl時(shí)間點(diǎn)樣 品，葉片半卷時(shí)取d2時(shí)間點(diǎn)樣品，葉片全卷時(shí)取d3時(shí)間點(diǎn)樣品。總RNA采用TRIZOL試劑 (購(gòu)自Invitrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū))，利用反轉(zhuǎn)錄酶 SS III (購(gòu)自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶 試劑說(shuō)明書(shū))。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(5’-ATCACCTAGACTACTTGGGCGG-3’ 禾口 5，-TTGGCCATATCTCCCACAGATC-3’ )對(duì)0shox24基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 78bp)。同時(shí)用引物(5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 5，-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3，) 對(duì)水稻Actinl基因做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)76bp)，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條 件為95°C 10sec,95°C 5sec,60°C 34seC，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分 析。結(jié)果表明該基因在水稻品種“中旱5號(hào)”、“中花11”、“珍汕97”的苗期干旱脅迫中均受 到強(qiáng)烈的上升誘導(dǎo)表達(dá)，相應(yīng)的上升倍數(shù)分別約為50倍、100倍、160倍(如圖2)。
實(shí)施例3、0shox24P啟動(dòng)子逆境誘導(dǎo)活性鑒定本發(fā)明的實(shí)施方案就是構(gòu)建0shox24P啟動(dòng)子的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻 品種“中花11”(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)品種)中，定量地檢測(cè)0shox24P啟 動(dòng)子的逆境包括干旱、高鹽、ABA、冷脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)活性。具體操作如下首先將實(shí)施例1中分離的0shox24P啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體 (購(gòu)自Promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購(gòu)自Promega公司)并獲得陽(yáng)性克隆。通 過(guò)BamHI單酶切從pGEM_T Easy陽(yáng)性克隆上回收0shox24P再將其連接到⑶S表達(dá)載體 P1391Z (來(lái)自CAMBIA公開(kāi)使用的載體，載體含有GUS報(bào)告基因)。酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并檢 測(cè)插入方向正確后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種“中花11中”，經(jīng) 過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植 株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見(jiàn) Efficienttransformation of rice, Oryza sativa L，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries oftheT-DNA,1994, Plant Journal 6 271-282) 并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改良優(yōu)化。同時(shí)將不連接外源片段的P1391Z空載體轉(zhuǎn)化水稻品種“中花 11中”作為對(duì)照。主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫(xiě)本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫(xiě)表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-節(jié)基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin,羧芐青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosringone, ZilitT#Sll ) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,S )； 服(辦81~011^(^1^，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量成分 溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制硝酸鉀(KNO3)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. Og硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63g硫酸鎂(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化鈣(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室溫下定容至IOOOml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸錳(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20)0. 15g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至IOOOml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinicacid)0. Ig維生素Bl (Thiamine HCl)0. Ig維生素B6(Pyridoxine HCl)0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg
加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制硝酸銨(NH4NO3)16. 5g硝酸鉀19. Og磷酸二氫鉀1. 7g硫酸鎂3. 7g氯化鈣4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制碘化鉀0. 083g硼酸0. 62g硫酸錳0. 86g鉬酸鈉(Na2MoO4· 2H20)0. 025g硫酸銅(CuSO4· 5H20)0. 0025g室溫下溶解并定容至1000ml。7) 2，4-D 貯存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全 后定容至100ml，于室溫下保存。8)6_BA 貯存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取NAA lOOmg，用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取IAA lOOmg，用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓谝粋€(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵 (FeSO4· 7H20) 2. 78g。在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水用。11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制
秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制秤取AS 0. 392g，DMSO 10ml，分裝至1. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 13) IN氫氧化鉀貯存液
秤取氫氧化鉀5. 6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4-DC存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12. 5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1. 75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入 培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入 培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μ 1 AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ 1 HN和400ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml6-BA 貯存液0.5ml
KT C存液0.5mlNAA C存液50 μ 1IAA C存液50 μ 1CH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ 1 HN和200ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X) IOml維生素貯存液(100X)IOml6-BA 貯存液2mlKT 貯存液2mlNAA C存液0.2mlIAA C存液0. 2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士 1°C。3. 2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫 度 25 士 1°C。3. 3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25 士 1°C。3. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來(lái)源于CAMBIA，商 用菌株)兩天，溫度28°C ；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。3. 5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度 19-20 "C。3. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為 400ppm，第二次以后為250ppm)3. 7 分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。3. 8 生根(1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保 持水分濕潤(rùn)。申請(qǐng)人:采用構(gòu)建的pl391Z-0shoX24P載體(如圖3)轉(zhuǎn)化水稻“中花11中”，得到 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株18株；不連接外源片段的pl391Z空載體轉(zhuǎn)化水稻“中花11中”得到轉(zhuǎn)基 因陽(yáng)性植株8株。選取3個(gè)轉(zhuǎn)啟動(dòng)子陽(yáng)性家系和1個(gè)轉(zhuǎn)空載體陽(yáng)性對(duì)照家系對(duì)Tl代種子 進(jìn)行潮霉素(HN)抗性篩選發(fā)芽，將發(fā)芽的苗子一部分種于小紅桶的沙土內(nèi)長(zhǎng)至4葉期做干 旱脅迫，一部分種于小方盒內(nèi)長(zhǎng)至3、4葉期做高鹽、ABA、4°C冷脅迫。其中干旱脅迫方法如 實(shí)施例2中所述，取脅迫前d0、葉片微卷dl、葉片半卷d2、葉片全卷d3四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品。 小方盒內(nèi)用的是實(shí)施例3中的生根培養(yǎng)基，高鹽脅迫是在小方盒內(nèi)加入100mL200mMNaCl， 取0h、3h、6h、24h時(shí)間點(diǎn)樣品；ABA脅迫是在每個(gè)小方盒內(nèi)加入70mL100mMABA，取0h、0. 5h、 3h、24h時(shí)間點(diǎn)樣品，冷脅迫是將小方盒放入4 °C冷庫(kù)中，取Oh、6h、12h、24h樣品。每份樣品取的是該家系的混合樣(不少于10株)。樣品用液氮磨樣，通過(guò)⑶S抽提液(50mM Na2HP04, pH7. 0, IOmM β-mercaptoethanol，IOmMNa2EDTA, 0· 1% Sarkosyl，0· 1% Triton-100)抽提總蛋白，從樣 品中取出一定量的蛋白著進(jìn)行GUS活性定量分析。通過(guò)分析熒光結(jié)果獲得原樣品的GUS 比酶活。具體步驟如下通過(guò)Bradford法(參見(jiàn)A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding. 1976，Anal Biochem,72 248-254)測(cè)得樣品的總蛋白濃度，再根據(jù)濃 度用移液器量取一定體積的相同質(zhì)量的總蛋白，用相同量的總蛋白質(zhì)提取物+0. 4mlGUS提 取緩沖液+10μ 1 40mM 底物 MUG(4-methylumbelifferyl-0-D-glucuronide)在 37°C 水浴 一定時(shí)間(Ih以內(nèi))后，加入1. 6ml反應(yīng)終止液(0. 2MNa2C03)；每個(gè)反應(yīng)設(shè)置三個(gè)技術(shù)重復(fù)。 用Tecan光柵型酶標(biāo)儀infinite M200測(cè)量各個(gè)樣品在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm處的熒 光值，同時(shí)以50nM MU的熒光值作為參比。進(jìn)而通過(guò)以上數(shù)據(jù)計(jì)算出各個(gè)樣品中⑶S蛋白 的比酶活，即Iug總蛋白每分鐘反應(yīng)底物MU的量(單位pmol MU/min/ug protein)。通過(guò)⑶S蛋白活性定量測(cè)量發(fā)現(xiàn)，0shox24P啟動(dòng)子控制下的⑶S蛋白活性受到干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因家系中⑶S蛋白在葉片全卷時(shí)的活性是脅迫前的約 3至18倍(如圖4)；同時(shí)在ABA脅迫時(shí)該啟動(dòng)子控制下的GUS蛋白活性也呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨 勢(shì)，變化幅度約2至3倍(如圖6)；在高鹽脅迫和冷脅迫時(shí)GUS蛋白的活性變化不大或者 變化規(guī)律不明顯(如圖5和圖7)。
權(quán)利要求
一種被干旱、高鹽或低溫特異誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子Oshox24P，它的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子0shox24P在控制基因在植物中表達(dá)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種植物逆境特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離鑒定和應(yīng)用。通過(guò)分離和鑒定獲得一種水稻干旱誘導(dǎo)型基因的啟動(dòng)子Oshox24P，它具有如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以應(yīng)用于植物的基因工程中，以達(dá)到植物遺傳改良特別是提高植物抗旱性的目的。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101831430SQ201010162848
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者楊梅, 熊立仲 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)