專利名稱：一種faslg基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應
用
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應用
背景技術(shù)：
2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個年度報告， “認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗”，也就是說癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn) 失敗的幾個因素是1、腫瘤細胞異質(zhì)性；2、腫瘤細胞耐藥性；3、抗癌藥物設計思路不完善 等。同時，該報告中亦提出應重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導致 癌癥死亡率不降的另二個重要原因是1、不能做到真正的早期診斷；2、轉(zhuǎn)移的病理機制不 清楚。依照傳統(tǒng)的醫(yī)學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指標來診斷癌癥，認為占位性 癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時無癥狀體征)，這一臨床概念值得認 真討論。影像醫(yī)學的2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹?shù)?，從細胞學角度， 1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止2億個腫 瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可 能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在這個過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和 單獨的病灶。臨床上已證實一旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通過不同途徑遷移到其他 部位克隆生長；一旦切除原發(fā)灶后，其他器官復發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成或轉(zhuǎn)移。因此， 在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶 時，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，這時已經(jīng)是晚期了，這是導致癌癥死亡率 不降的真正原因。Fas/FasL系統(tǒng)可使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)測。FasL在惡性腫瘤中表達，F(xiàn)as則下調(diào) 以逃避宿主免疫攻擊，促使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。肝細胞癌患者的正常肝組織細胞Fas表達上調(diào)， 肝癌細胞則下調(diào)，而患者血清中游離Fas與FasL水平明顯升高，提示肝癌細胞可能通過消 除自身Fas的表達，而讓肝細胞和侵入的單核細胞產(chǎn)生游離Fas來逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控并 發(fā)生轉(zhuǎn)移。低分化肝細胞癌中Fas的表達明顯下降，并出現(xiàn)FasL的表達，F(xiàn)as/FasL危險積 分是監(jiān)測肝細胞癌預后的新指標。結(jié)直腸癌中測到FasL表達者淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移率均高， 生存率較低。宮頸腺癌FasL的表達與淋巴道侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，高表達者生存率 明顯低。FASLG 基因，NM_000639，1909bp，mRNA. Iq23〃，cds :158…1003bp。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到早期預測診斷。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術(shù)結(jié)合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種FASLG基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種FASLG基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復發(fā)疾病藥物 中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。
所述的癌癥是肝癌、宮頸腺癌或直腸癌。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種FASLG基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及影像醫(yī)學檢查有 顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測FASLG基因異常表達，在影像醫(yī)學檢查未發(fā)現(xiàn)占 位性癌病灶復發(fā)之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上 基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的早期診斷以及治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)及早 預測。這樣才有可能實施癌癥的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治 癌癥惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中肝癌轉(zhuǎn)移病人FASLG基因表達圖片。圖2是本發(fā)明實施例中宮頸腺癌轉(zhuǎn)移病人FASLG基因表達圖片。圖3是本發(fā)明實施例中直腸癌轉(zhuǎn)移病人FASLG基因表達圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人FASLG基因表達圖片。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和
標本組成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預雜交液1300 μ 1/ 管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體Ιμ /管1管/盒無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/盒黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明:(所有試劑購自SIGMA)
1、消化液20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC_H205ml ；2、保護液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0.5M MgCl2 101. 65g MgCl 2· 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種FASLG基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1. 5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中的 FASLG基因表達量，用來確定癌癥是否發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，F(xiàn)ASLG基因具有廣譜性，因為FASLG基因在正常人中表達低或零表 達。如果FASLG基因高表達，說明癌癥已經(jīng)復發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴散，從而獲得癌癥的診斷信息。當 檢測到FASLG基因的表達高于正常對照時，則可預測受試者為癌癥早期轉(zhuǎn)移或癌癥轉(zhuǎn)移易 感者，這些癌癥包括肝癌、宮頸腺癌或直腸癌。本發(fā)明實施例采樣為肝癌轉(zhuǎn)移病人5名，宮頸腺癌轉(zhuǎn)移病人5名，直腸癌轉(zhuǎn)移病 人5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結(jié) 果表示，所有癌癥轉(zhuǎn)移病人FASLG基因有過度表達，細胞染色；正常對照組FASLG基因不表 達，細胞無染色。具體結(jié)果請見圖1，圖2，圖3和圖4。實施例3用FASLG基因試劑盒檢測肝癌轉(zhuǎn)移疾病與用CA125基因試劑盒檢測肝癌轉(zhuǎn)移疾 病之間平行實驗。為了科學評價上述基因各自在肝癌轉(zhuǎn)移疾病的特異性、敏感性、準確性。 我們用平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用 同一例肝癌轉(zhuǎn)移疾病患者的外周血，同時檢測FASLG基因和CA125(CA125(腫瘤標記物)， NM-024690)基因的mRNA(進行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報告等均采用 實施例1和實施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā)現(xiàn)FASLG基因在肝癌 轉(zhuǎn)移疾病病人中表達量比CA125基因在同一疾病病人的表達量要高。結(jié)果表明，F(xiàn)ASLG基 因?qū)Ω伟┺D(zhuǎn)移疾病診斷的特異性、敏感性、準確性比CA125基因更好，原位雜交基因表達圖 顯示，F(xiàn)ASLG基因的表達量是70%，CAl25基因的表達量是50%。本發(fā)明的試劑盒作于肝癌 轉(zhuǎn)移疾病診斷的指標有非常重要的臨床意義。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>1
<170>PatentIn version 3.3<210>1〈211>1909<212>DNA〈213〉智人(Homo sapiens)<400>1gaggtgtttcccttagctat ggaaactcta taagagagatccagcttgcc tcctcttgag60cagtcagcaacagggtcccg tccttgacac ctcagcctctacaggactga gaagaagtaa120aaccgtttgctggggctggc ctgactcacc agctgccatgcagcagccct tcaattaccc180atatccccagatctactggg tggacagcag tgccagctctccctgggccc ctccaggcac240agttcttccctgtccaacct ctgtgcccag aaggcctggtcaaaggaggc caccaccacc300accgccaccgccaccactac cacctccgcc gccgccgcca ccactgcctc cactaccgct360gccacccctgaagaagagag ggaaccacag cacaggcctg tgtctccttg tgatgttttt420catggttctggttgccttgg taggattggg cctggggatg tttcagctct tccacctaca480gaaggagctggcagaactcc gagagtctac cagccagatg cacacagcat catctttgga540gaagcaaataggccacccca gtccaccccc tgaaaaaaag gagctgagga aagtggccca600tttaacaggcaagtccaact caaggtccat gcctctggaa tgggaagaca cctatggaat660tgtcctgctttctggagtga agtataagaa gggtggccttgtgatcaatg aaactgggct720gtactttgtatattccaaag tatacttccg gggtcaatcttgcaacaacc tgcccctgag780ccacaaggtctacatgagga actctaagta tccccaggatctggtgatga tggaggggaa840gatgatgagctactgcacta ctgggcagatgtgggcccgcagcagctacctgggggcagt900
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1909
權(quán)利要求
一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復發(fā)疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述的癌癥是肝癌、宮頸腺癌或直腸癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或 非放射性標記物。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述 的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
9.一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
10.一種FASLG基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求9所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件 為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本 或組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種FASLG基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種FASLG基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復發(fā)疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101993933SQ200910056170
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日 公開號200910056170.0
發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司