專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鵝干擾素-α多肽基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鵝干擾素基因。
背景技術(shù)：
干擾素(interferon.IFN)最早是由英國(guó)科學(xué)家Isaacs和Lindemann于1957年 發(fā)現(xiàn)。1980年國(guó)際干擾素命名委員會(huì)正式將其定名為interferon,簡(jiǎn)寫(xiě)為IFN。 由于天然的鵝干擾素-a基因?qū)儆谡婧嘶?，所以在原核表達(dá)體系內(nèi)存在低表達(dá) 和構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯活性低的問(wèn)題。
大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，其遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡(jiǎn)單、培 養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可大規(guī)模發(fā)酵；因此倍受遺傳工程專(zhuān)家的重視和青睞。目前大腸 桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常作為高效表達(dá)的首選體系；但是天 然的鵝干擾素-a基因卻不能在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，嚴(yán)重的限制了鵝干擾素-a在 實(shí)際禽類(lèi)生產(chǎn)中的應(yīng)用、推廣和科學(xué)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前天然的鵝干擾素-a基因在大腸桿菌內(nèi)不能 表達(dá)的問(wèn)題，而提供的一種鵝干擾素-a多肽基因。
本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因序列如SEQIDNO: 1所示。
本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因全長(zhǎng)505bp， 10bp處有起始密碼子ATG， 496bp 處有終止密碼子TAA，擁有489bp完整的開(kāi)放閱讀框。
本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因所編碼的氨基酸序列與天然的鵝干擾素-ot多 肽相同(鵝干擾素-a多肽18.83ku)，但本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因序列中4bp 6bp處的堿基為"TGT"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"TGC")， 16bp 27bp處的堿基為"CGTCTGCATGAT"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為 "CGCCTCCACGAC")， 31bp 33bp處的堿基為"GCA"(此處天然鵝干擾素 -a多肽基因堿基為"GCC")， 37bp 39bp處的堿基為"CCG"(此處天然鵝干 擾素-a多肽基因堿基為"CCC")， 49bp 51bp處的堿基為"CTG"(此處天然 鵝干擾素-cx多肽基因堿基為"CTC")， 55bp 66bp處的堿基為"CTGCTGTGTAAT "(此處天然鵝干擾素-(x多肽基因堿基為
"CTCCTCTGCAAC")， 70bp 75bp處的堿基為"GCACCG"(此處天然鵝干 擾素-a多肽基因堿基為"GCTCCC")， 82bp 84bp處的堿遙為"ACC"(此處 天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"ACA")， 88bp 卯bp處的堿基為"CCG"
(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CCC")， 103bp 105bp處的堿基為
"CAC"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CAT"), 109bp mbp處的 堿基為"CCG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CCT")， 115bp 117bp 處的堿基為"AGC"(此處天然鵝干擾素-(x多肽基因堿基為"TCC")， 127bp 132bp處的堿基為"ACGCTG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為
"ACCCTC")， 136bp 138bp處的堿基為"GAT"(此處天然鵝干擾素-a多肽 基因堿基為"GAC")， 148bp 150bp處的堿基為"ACC"(此處天然鵝干擾素 -a多肽基因堿基為"ACA")， 160bp 162bp處的堿基為"AGC"(此處天然鵝 干擾素-a多肽基因堿基為"TCA")， 166bp 174bp處的堿基為"GCGACGCTG"
(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"GCCACCCTC")， 178bp 186bp處 的堿基為"CTGCTGCAG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為
"CTCCTCCAA")， 190bp 192bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素"(x 多肽基因堿基為"CTC")， 196bp 198bp處的堿基為"GAT"(此處天然鵝干 擾素-a多肽基因堿基為"GAC")， 202bp 204bp處的堿基為"CTG"(此處天 然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CTC")， 211bp 213bp處的堿基為"CCG"(此 處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CCC")， 217bp 222bp處的堿基為
"ACGCCG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"ACCCCC")， 232bp 234bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CTC")， 253bp 255bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為
"CTC")， 256bp 258bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因 堿基為"CTC")， 265bp 267bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素-a多 肽基因堿基為"CTC"), 271bp 276bp處的堿基為"CATCAT"(此處天然鵝 干擾素-a多肽基因堿基為"CACCAC")， 283bp 294bp處的堿基為
"CATCTGGAACGT "(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為
"CACCTCGAGCGC")， 301bp 306bp處的堿基為"CCGGCA"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CCAGCC"), 313bp 315bp處的堿基為"ACC" (此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"ACG"), 322bp 333bp處的堿基為 "CATCGTCGCGGC "(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為 "CACAGGCGAGGG")， 337bp 339bp處的堿基為"CGT"(此處天然鵝干 擾素-a多肽基因堿基為"CGC")， 343bp 345bp處的堿基為"CTG"(此處天 然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CTT")， 349bp 354bp處的堿基為"CTGGGT" (此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CTCGGC")， 361bp 366bp處的堿 基為"AAATAT"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"AAGTAC")， 370bp 372bp處的堿基為"GGT"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"GGC")， 379bp 381bp處的堿基為"CAG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為 "CAA")， 388bp 390bp處的堿基為"CTQ"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因 堿基為"CTC")， 397bp 399bp處的堿基為"CAT"(此處天然鵝干擾素-a多 肽基因堿基為"CAC")， 409bp 414bp處的堿基為"CCGTGT"(此處天然鵝 干擾素-a多肽基因堿基為"CCCTGC"), 427bp 447bp處的堿基為 "GTTCGTCTGGAAGCGCATGCA"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為 "GTCCGCCTCGAGGCTCACGCC")， 451bp 453bp處的堿基為"TTT"(此 處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"TTC")， 457bp 459bp處的堿基為"CGT" (此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CGC")， 460bp 465bp處的堿基為 "ATTCAT"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"ATCCAC")， 469bp 471bp處的堿基為"CTG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為"CTC"), 475bp 480bp處的堿基為"CGTACG"(此處天然鵝干擾素-a多肽基因堿基為 "CGCACC")， 484bp 486bp處的堿基為"CGT"(此處天然鵝干擾素-a多肽 基因堿基為"CGC")。
本發(fā)明利用大腸桿菌優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因(偏愛(ài)密碼子)對(duì)鵝干擾素-a多肽基因 進(jìn)行基因改造；由于密碼子的改變本發(fā)明的鵝干擾素-a多肽基因的密碼子及密 碼子對(duì)均為優(yōu)勢(shì)密碼子和密碼子對(duì)，所以本發(fā)明的鵝干擾素-a多肽基因在大腸 桿菌中的蛋白表達(dá)量明顯提高，密碼子分析結(jié)果如圖2所示，明顯強(qiáng)于天然鵝 干擾素-a多肽基因(如圖l所示)，因此本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因可以在大 腸桿菌中高效表達(dá)鵝干擾素-a成熟多肽。本發(fā)明的鵝干擾素-a多肽基因的5'端自由能圖如圖3所示，天然鵝干擾 素-a多肽基因的5'端自由能圖如圖4所示，本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因的3' 端自由能圖如圖5所示，天然鵝干擾素-a多肽基因的3'端自由能圖如圖6所 示；經(jīng)RNAstructure(Version4.3)軟件分析本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因的5，端 自由能高于天然鵝干擾素-a多肽基因，而且在本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因翻 譯起始區(qū)周?chē)男蛄胁恍纬擅黠@的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使翻譯起始調(diào)控元件易被核糖體 識(shí)別和結(jié)合，所以本發(fā)明的鵝千擾素-a多肽基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)明 顯優(yōu)于天然鵝干擾素-a多肽基因，提高了鵝干擾素-a在大腸桿菌系統(tǒng)中的表 達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。


圖1是天然鵝干擾素-a多肽基因在大腸桿菌中密碼子分析結(jié)果圖；圖2 是本發(fā)明鵝干擾素-a多肽基因在大腸桿菌中密碼子分析結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明 鵝干擾素-a多肽基因的5'端自由能圖，圖4是天然鵝干擾素xx多肽基因的5， 端自由能圖；圖5是本發(fā)明鵝千擾素-a多肽基因的3，端自由能圖；圖6是天 然鵝干擾素-a多肽基因的3'端自由能圖；圖7是鵝干擾素-a多肽基因在大腸 桿菌BL21中非融合表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖，圖7中"1"泳道標(biāo)樣為 Marker (蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量)，"2"泳道標(biāo)樣為載有天然鵝干擾素-a多肽基因的 pWL載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，"3"泳道標(biāo)樣為空載體，"4"泳 道標(biāo)樣為載有具體實(shí)施方式
一鵝干擾素-(x多肽基因的pWL載體在大腸桿菌中 lh的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，"5"泳道標(biāo)樣為載有具體實(shí)施方式
一鵝干擾素-a多肽基 因的pWL載體在大腸桿菌中2h的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，"6"泳道標(biāo)樣為載有具體 實(shí)施方式一鵝干擾素-a多肽基因的pWL載體在大腸桿菌中3h的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn) 物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一:本實(shí)施方式本實(shí)施方式鵝干擾素-ct多肽基因序列如下所
示
GAATTCAATATGTGTAGCCCGCTGCGTCTGCATGATAGCGCATTTCCGTGGGACAGCCTGCAGCTGCTGTGTAATATGGCACCGAGCCCGACCCAGC
CGTGCCCGCAGCAACACGCACCGTGCAGCTTCCCGGACACGCTGCTGGA
TACCAACGACACCCAGCAAGCCAGCCACGCGACGCTGCACCTGCTGCA
GCACCTGTTCGATACCCTGAGCAGCCCGAGCACGCCGGCGCACTGGCTG
CACACCGCACGCCACGACCTGCTGAACCAGCTGCAGCATCATATCCACC
ATCTGGAACGTTGCTTCCCGGCAGACGCGACCCGCTTCCATCGTCGCGG
CCCGCGTAACCTGCACCTGGGTATCAACAAATATTTCGGTTGCATCCAGC
ACTTCCTGCAGAACCATACCTACAGCCCGTGTGCCTGGGACCACGTTCG
TCTGGAAGCGCATGCATGCTTTCAGCGTATTCATCGCCTGACCCGTACGA
TGCGTTAATGTCGAC 。
本實(shí)施方式鵝干擾素-a多肽基因序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 合成。
本實(shí)施方式中借助DNAstar軟件推導(dǎo)基因的氨基酸序列，并根據(jù)氨基酸序 列借助http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html在線(xiàn)密碼子分析工具推導(dǎo)大腸 桿菌優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因序列。
本實(shí)施方式用RNAstructure(Version4.3)軟件設(shè)計(jì)基因5'末端及3'末端 自由能值，提高鵝干擾素-cx多肽基因的mRNA的5'端自由能值，使得核糖 體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；并降低3'端結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高，延長(zhǎng)mRNA 在體內(nèi)的半衰期。
將本實(shí)施方式鵝干擾素-a多肽基因轉(zhuǎn)入原核無(wú)毒編碼物種特異性抗性表 達(dá)載體(pWL載體)，然后在大腸桿菌BL21中進(jìn)行非融合表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE 鑒定產(chǎn)物表達(dá)量。
SDS-PAGE電泳采用15% (體積)的分離膠和5% (體積)的濃縮膠進(jìn)行； 所需溶液按以下步驟配制(1) 5xTris-甘氨酸電泳緩沖液15.1gTris, 94g甘 氨酸，2.5gSDS溶于900mL去離子水中，定容至1L;
(2) 10% (g/mL)過(guò)硫酸銨O.lg過(guò)硫酸銨溶于lmL重蒸水中，在-20 。C冰箱中保存；
(3) 10% (g/mL) SDS:稱(chēng)10g SDS用重蒸水溶解，定容到100mL，室 溫存放；(4) 30% (g/mL)丙烯酰胺將29g丙烯酰胺和lgN-N-甲叉丙烯酞胺加 去離子水定容至100mL， pH《7.0，過(guò)濾，于棕色玻璃瓶中4(TC貯存；
(5) 1.5MTris-HCl (pH8.8): Tris-堿18.17g溶于80mL去離子水中，加入 約3mL的濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至100mL;
(6) 1.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8):稱(chēng)Tris 109g，取lmol/LHCl 144mL, 用重蒸水定容至300mL， 4'C保存。
檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，檢測(cè)結(jié)果顯示本實(shí)施方式鵝干擾素-a多肽基因在大 腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的35%以上(而天然的鵝 干擾素-a多肽基因連接到pWL載體中在大腸桿菌中則檢測(cè)不出表達(dá))，說(shuō)明 本實(shí)施方式鵝干擾素-cx多肽基因可以在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)高效表達(dá)。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是鵝干擾素-a 多肽基因序列10bp處有起始密碼子ATG， 496bp處有終止密碼子TAA,擁有 489bp完整的開(kāi)放閱讀框。其它與實(shí)施方式一相同。序列表
<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種鵝干擾素-a多肽基因
<勝2
〈210〉 1 〈211〉 505 〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
<220> <221> CDS
<222> (IO)... ( 489) <220〉
〈223>鵝干擾素-a多肽基因 〈400> 1
gaattcaat atg tgt age ccg ctg cgt ctg cat gat age gca ttt ccg 48 Met Cys Ser Pro Leu Arg Leu His Asp Ser Ala Phe Pro 1 5 10
tgg gac age ctg cag ctg ctg tgt aat atg gca ccg age ccg acc cag 96 Trp Asp Ser Leu Gin Leu Leu Cys Asn Met Ala Pro Ser Pro Thr Gin
15 20 25
ccg tgc ccg cag caa cac gca ccg tgc age ttc ccg gac acg ctg ctg 144 Pro Cys Pro Gin Gin His Ala Pro Cys Ser Phe Pro Ser Thr Leu Uu 30 35 40 45
gat acc aac gac acc cag caa gcc age cac gcg acg ctg cac ctg ctg 192 Asp Thr Asn Asp Thr Gin Gin Ala Ser His Arg Thr Leu His Leu Leu ,
50 55 60
cag cac ctg ttc gat acc ctg age age ccg age acg ccg gcg cac tgg 240 Gin His Gin Phe Asp Thr Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp
65 70 75
ctg cac acc gca cgc cac gac ctg ctg aac cag ctg cag cat cat ate 288 Leu His Thr Ala Arg His Asp Leu Leu Asn Gin Leu Gin His His lie
80 85 90
cac cat ctg gaa cgt tgc ttc ccg gca gac gcg acc cgc ttc cat cgt 336 His His Leu Glu Arg Cys Phe Pro Ala Asp Ala Thr Arg Phe His Arg
95 100 105
cgc ggc ccg cgt aac ctg cac ctg ggt ate aac aaa tat ttc ggt tgc 384 Arg Gly Pro Arg Asn Leu His Leu Gly Met Asn Lys Tyr Phe Gly Cys 110 115 120 125
ate cag cac ttc ctg cag aac cat acc tac age ccg tgt gcc tgg gac 432lie GinHisPheLeuGin AsnHisThrTyr Ser Pro Cys Thr Trp Ser
130135140
cac gttcgtctggcgcatgcatgctttcag cgtattcatcgcctg
His ValArgLeuGluAla HisAlaCysPheGin Arg lie His Arg Leu
145150155
acc cgtacgatgCgttgtcgac505
Thr ArgThrMetArg
160
<210> 2
<211〉 162
〈212〉 PRT
〈213〉天鵝屬(O^/ws)
〈400> 2
Met CysSerProLeuArgLeuHisAspSerAlaPheProTrpAspSer
151015
Leu GinLeuLeuCysAsnMetProSerProThrGinProCysPro
202530
Gin GinHisAlaProCysSerPheProSerThrLeuLeuAspThrAsn
354045
Asp ThrGinGinAlaSerHisArgThrLeuHisLeuLeuGinHisGin
505560
Phe AspThrLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpLeuHisThr
65707580
Ala ArgHisAspLeuLeuAsnGinLeuGinHisHislieHisHisLeu
859095
Glu ArgCysPheProAlaAspAlaThrArgPheHisArgArgGlyPro
100105110
Arg AsnLeuHisLeuGlyMetAsnLysTyrPheGlyCyslieGinHis
115120125
Phe LeuGinAsnHisThrTyrSerProCysThrTrpSerHisValArg
130135140
Leu GluAlaHisAlaCysPheGinlieHisArgLeuThrArgThr
145150155160
Met Arg
權(quán)利要求
1、一種鵝干擾素-α多肽基因，其特征在于鵝干擾素-α多肽基因序列如下所示GAATTCAATATGTGTAGCCCGCTGCGTCTGCATGATAGCGCATTTCCGTGGGACAGCCTGCAGCTGCTGTGTAATATGGCACCGAGCCCGACCCAGCCGTGCCCGCAGCAACACGCACCGTGCAGCTTCCCGGACACGCTGCTGGATACCAACGACACCCAGCAAGCCAGCCACGCGACGCTGCACCTGCTGCAGCACCTGTTCGATACCCTGAGCAGCCCGAGCACGCCGGCGCACTGGCTGCACACCGCACGCCACGACCTGCTGAACCAGCTGCAGCATCATATCCACCATCTGGAACGTTGCTTCCCGGCAGACGCGACCCGCTTCCATCGTCGCGGCCCGCGTAACCTGCACCTGGGTATCAACAAATATTTCGGTTGCATCCAGCACTTCCTGCAGAACCATACCTACAGCCCGTGTGCCTGGGACCACGTTCGTCTGGAAGCGCATGCATGCTTTCAGCGTATTCATCGCCTGACCCGTACGATGCGTTAATGTCGAC。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種鵝干擾素-a多肽基因，其特征在于鵝干擾 素-a多肽基因序列l(wèi)Obp處有起始密碼子ATG, 496bp處有終止密碼子TAA， 擁有489bp完整的開(kāi)放閱讀框。
全文摘要
一種鵝干擾素-α多肽基因，它涉及一種鵝干擾素-α基因。它解決了目前天然的鵝干擾素-α基因在大腸桿菌內(nèi)不能表達(dá)的問(wèn)題。本發(fā)明鵝干擾素-α多肽基因序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明木糖還原酶基因序全長(zhǎng)505bp，10bp處有起始密碼子ATG，496bp處有終止密碼子TAA，有489bp完整的開(kāi)放閱讀框。本發(fā)明鵝干擾素-α多肽基因能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)鵝干擾素-α成熟多肽。本發(fā)明的鵝干擾素-α多肽基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于天然鵝干擾素-α多肽基因，提高了鵝干擾素-α在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/19GK101603043SQ20091007233
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者巍 王, 王君偉, 波 馬, 高明春 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)