專利名稱：：重組人干擾素a2b的基因優(yōu)化及高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及重組人干擾素a2b編碼基因的優(yōu)化、高效可溶性表達(dá)及高活性純化。
背景技術(shù)：
：重組人干擾素a2b具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用，是治療急慢性病毒性肝炎的首選治療藥物。但是，重組人干擾素a2b存在表達(dá)效率不高、且目的蛋白多為包涵體等工業(yè)化生產(chǎn)的制約因素。目前工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素a2b的表達(dá)量約為20%30%,表達(dá)形式為包涵體蛋白，必須經(jīng)過變性劑溶解包涵體，然后除去變性劑使包涵體蛋白復(fù)性等工藝步驟，獲得的蛋白活性低，比活僅為2.0x10sIU/mg。解決該問題的有效途徑之一就是通過基因序列修飾以提高表達(dá)水平并增加蛋白的可溶性表達(dá)，提高純化后蛋白的活性。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供重組人干擾素a2b編碼基因的優(yōu)化序列，本發(fā)明的又一目的是提供一株高效可溶性表達(dá)重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌。(二)技術(shù)方案本發(fā)明提供了一株高效表達(dá)可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/zeWc/n'aco/z〕CGMCCNo.2827。該菌株已于2008年12月25日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。本發(fā)明提供了兩條重組人干擾素a2b編碼基因的大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列IFN-a2b及hlFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo:l及SEQIDNo:2所示。本發(fā)明公開了兩條大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列IFN-a2b及MFN-a2b以及高效表達(dá)可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/^Wc/n'aco//)CGMCCNo.2827在工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素a2b中的應(yīng)用。(三)有益效果本發(fā)明提供的高效表達(dá)可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(&c/zm'c/^co/z〕CGMCCNo.2827，其重組人干擾素a2b基因序列是經(jīng)由大腸桿菌密碼子優(yōu)化的序列，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的50%以上，且90%以上以可溶性蛋白的形式存在。蛋白的純化，經(jīng)過常規(guī)離子交換、分子篩等純化步驟，無需變性復(fù)性，獲得的蛋白活性高，達(dá)到4.Oxl08lU/mg。本發(fā)明所述的菌株于2008年12月25曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。圖1是重組人干擾素a2b編碼基因的特異性擴(kuò)增片段凝膠電泳圖，泳道l為大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的IFN-a2b基因擴(kuò)增結(jié)果(520bp),泳道2為大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的WFN-a2b基因擴(kuò)增結(jié)果(520bp),M為DNA分子量標(biāo)記DL2000;圖2是重組質(zhì)粒A^M與五coRI雙酶切鑒定圖，泳道1為pET43.1a-IFNa2b(505bp+5612bp)，泳道2為pET43.1a-hlFNa2b(505bp+5612bp)，M為DNA分子量標(biāo)記DL15000;圖3是重組人干擾素a2b誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE檢測圖，泳道1表示重組質(zhì)粒pET43.1a-IFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中未進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果，泳道2和3表示重組質(zhì)粒pET43.1a-IFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，泳道4和5表示重組質(zhì)粒pET43.1a-hlFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，泳道6表示重組質(zhì)粒pET43.1a-hlFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中未進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果，Ml和M2為蛋白分子量標(biāo)記；4圖4是重組人干擾素a2b蛋白的可溶性表達(dá)分析圖，泳道1表示超聲破碎后離心的沉淀物，泳道2表示超聲破碎后離心的上清液，M為蛋白分子量標(biāo)記；圖5是重組人干擾素a2b蛋白純度檢測分析圖，泳道l、2表示離子交換層析后層析主組分電泳純度，泳道3、4表示分子篩層析純化后主組分電泳純度，M為蛋白分子量標(biāo)記；具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1重組人干擾素a2b編碼基因的優(yōu)化及克隆構(gòu)建根據(jù)人干擾素IFN-a2b公布的氨基酸序列進(jìn)行基因序列優(yōu)化設(shè)計(jì)。IFN-cc2b前體的天然氨基酸序列如下丄環(huán)丄Z^LSC腐C^GCDLPOTHSLGS。其中，斜體字部分的17個氨基酸表示信號肽，從第18個氨基酸序列開始為成熟的人干擾素IFN-a2b蛋白。根據(jù)《分子克隆(第三版)》的經(jīng)典操作對重組人干擾素a2b編碼基因按大腸桿菌密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化設(shè)計(jì)得到的兩條基因序列分別命名為IFN-a2b及MFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo:1及SEQIDNo:2所示。通過引物兩兩搭接的方式進(jìn)行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的合成，設(shè)計(jì)的引物序列如表l所示表1重組人干擾素a2b編碼基因優(yōu)化修飾引物設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>IFN-a2b-F055，-CCGGTGCTGCATGAGATGATCCAGCAGATTTTCAATCTGTTTAGCACGAA-3，IFN-a2b-F065，-AGATAGCAGCGCCGCCTGGGATGAAACCCTGCTGGATAAATTTTATACC-3'IFN-a2b-F075，-GAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGTGTGATTCAGGGTGT-3，IFN-a2b-F085'-TGGCGTGACGGAGACCCCGCTGATGAAAGAAGATAGCATCCTGGCGGTG-3'IFN-a2b-F095,-CGTAAATATTTCCAGCGCATTACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATATAG-3'IFN-a2b-F105，-CCCGTGTGCCTGGGAAGTTGTGCGTGCGGAGATTATGCGCAGCTTTAGC-3，IFN-a2b-Fll5，-CTGAGCACCAATCTGCAGGAAAGCCTGCGTAGCAAAGAATAATgaattcc-3'IFN-a2b-R015，-GGAATTCATTATTCTTTGCTACGCA-3'IFN-a2b-R025，-GGCTTTCCTGCAGATTGGTGCTCAGGCTAAAGCTGCGCATAATCTCCGC-3'IFN-a2b-R035，-ACGCACAACTTCCCAGGCACACGGGCTATATTTCTTTTCTTTCAGGTACA-3'IFN-a2b-R045，-GGGTAATGCGCTGGAAATATTTACGCACCGCCAGGATGCTATCTTCTTT-3，IFN-a2b-R055，-CATCAGCGGGGTCTCCGTCACGCCAACACCCTGAATCACACACGCTTCCA-3，IFN-a2b-R065'-GATCGTTCAGCTGCTGATACAGTTCGGTATAAAATTTATCCAGCAGGGT-3，IFN-a2b-R075，-TTCATCCCAGGCGGCGCTGCTATCTTTCGTGCTAAACAGATTGAAAATCT-3，IFN-a2b-R085'-GCTGGATCATCTCATGCAGCACCGGAATGGTTTCCGCTTTCTGAAACTG-3'IFN-a2b-R095'-GTTGCCAAATTCTTCCTGCGGGAAACCAAAATCATGGCGATCTTTCAGGC-3'IFN-a2b-R105，-AGCTAAACAGGCTAATACGGCGCATCTGCGCCAGCAGCATCAGGGTACG-3，IFN-a2b-Rll5'-ACGGCTGCCCAGGCTATGGGTCTGCGGCAGATCGCACATATGGGATCCCG-3，hIFN-a2b-F015,-GGAATTCCATAtgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctga-3'將表1中設(shè)計(jì)合成的22條引物(IFN-a2b-F01到IFN-a2b-Fll共11條，IFN-a2b-R01到IFN-a2b-Rll共11條)混合后進(jìn)行PCR預(yù)反應(yīng)，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反應(yīng)體系如下10xPCRBuffer5単dNTPmix(2.5mMeach)4.0^1上述22條引物(10nM)各1.5(xlTaqDNAPolymerase(5U/nl)l.OplddH207.0nlTotalVolume50.0nl用bio-radPTC-240PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR循環(huán)條件為195。C3min295°C30s365。C30s472°Clmin5Step2~45cycles695°C30s760。C30s6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以PCR預(yù)反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的擴(kuò)增，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反應(yīng)體系如下1OxPCRBuffer5.0|xldNTPmix(2.5mMeach)4.0^1IFN隱a2b-F01或WFN-a2b-F01(10pM)2.(^1IFN-a2b-R01(10nM)2.0^1TaqDNAPolymerase(5U/nl)1.OnlddH2036.0nlTotalVolume50.0^1用bio-radPTC-240PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR循環(huán)條件為195°C3min2950C30s360°C30s472°Clmin5Step2~430cycles672°ClOminPCR分別擴(kuò)增獲得大小約為520bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段，即大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的IFN-a2b基因和hlFN-a2b基因，如附圖1所示。用QIAquickGelExtractionKits(QIAGEN)分別對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化。純化后的片段用腸I(Takara,CatalogNo.D1161A)和i"coRI(Takara，CatalogNo.D1040A)雙酶切，重組表達(dá)載體pET43.la質(zhì)粒(Novagen，CatalogNo.70939-3)同樣用WeI和I雙酶切，酶切體系如下Totalvolume50.0|a1Totalvolume50.0nl將酶切純化后的片段IFN-a2b或hlFN-a2b與相同酶切的原核表達(dá)載體pET43.la用T4DNA連接酶(Takam，CatNo.D2011A)進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系如下將上述體系混勻，瞬時離心，16。C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化co/z'DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN,Cat.No.CB101-02)，涂含lOOmg/LAmp的LB篩選平板，挑取單克隆在培養(yǎng)擴(kuò)增后用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN，Cat.No.27106)進(jìn)行抽提，用AfcfeI和I進(jìn)行雙酶切鑒定，大小正確的重組質(zhì)粒(酶切大小為505bp+5612bp,如附圖2所示)送人類基因組北方中心(諾賽基因)進(jìn)行基因序列測定，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET43.1a-IFNa2b及pET43.1a-hlFNa2b。實(shí)施例2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)及重組人干擾素a2b的誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的重組質(zhì)粒pET43.1a-IFNa2b及pET".la-hlFNa^分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)(Novagen,CatalogNo.69450)的感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100mg/LAmp的LB篩選平板，表達(dá)菌株分別命名為BL21(DE3)10xT4DNAligasebufferIFN-a2b或hlFN-a2bpET43.1aT4DNAligaseddH20_Totalvolume載體酶切體系10xHbuffer5単遜I1.0|il五coRIl.OulpET43.1a15.0nlddH2028単片段酶切體系10xHbuffer敲IIFN-a2b或hIFN-a2bddH20<q<q<q刀<qolLiooooo<r8/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-h顧a2b。在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表達(dá)菌BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的單克隆接入5ml含100mg/LAmp的LB液體試管培養(yǎng)基中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)至OD值約為0.8(大約4-5h),加入IPTG(終濃度為lmM)在3(TC、150rpm條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時設(shè)置未加IPTG的對照菌，6小時后，以6000rpm離心3min收獲菌體。用PBS的洗兩遍后加入蛋白上樣緩沖液，沸水洛煮沸5min,12000rpm離心2min后，用上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，加入上述處理后的樣品，上層膠以8V/cm的電壓，分離膠以15V/cm的電壓進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時，停止電泳，切下分離膠，考馬斯亮藍(lán)染色lh后用脫色液進(jìn)行脫色，待蛋白條帶清晰后進(jìn)行拍照。SDS-PAGE檢測結(jié)果如附圖3所示未誘導(dǎo)的表達(dá)菌(泳道1和泳道6)未能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的表達(dá);IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b菌體(泳道2和泳道3)中能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的表達(dá)(表觀分子量約19kD,目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的15%);IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b菌體(泳道4和泳道5)中能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的高效表達(dá)(表觀分子量約19kD,目的蛋白表達(dá)量大于菌體總蛋白的50%)本發(fā)明所述的菌株BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b于2008年12月25日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。實(shí)施例3重組人干擾素a2b蛋白的可溶性表達(dá)分析在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表達(dá)菌BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的單克隆接入20ml含100mg/LAmp的LB液體三角瓶培養(yǎng)基中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)過夜，以1:200的比例轉(zhuǎn)接于4L含新鮮9LB液體培養(yǎng)基(100mg/LAmp)的發(fā)酵罐中，37。C培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6時，加IMIPTG至終濃度為lmM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6h，在4。C，6000rpm條件下離心15min收集菌體。用0.9。/。NaCl溶液洗滌菌體，在4。C，6000rpm條件下離心15min收集沉淀。按照lg菌體對應(yīng)10111188^1"17.2)的比例加入？88緩沖液，充分混句，在冰水洛中，使用600W(超聲頻率)，5s(超聲時間)，15s(間歇時間)進(jìn)行超聲破菌15min。吸取lml的超聲破碎液于4°C,13000rpm條件下離心5分鐘，吸出上清100pl加入IOOmI的蛋白上樣緩沖液，沉淀用PBS洗滌1次后再用lOOjil的PBS重懸并加入100ial的蛋白上樣緩沖液，沸水洛煮沸5min后，各取15樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳以檢測重組人干擾素a2b蛋白的可溶性。SDS-PAGE檢測結(jié)果如附圖4所示超聲破碎后的沉淀物(泳道1)和上清(泳道2)中均有重組干擾素a2b蛋白的表達(dá)(表觀分子量19kD處)，且在相同上樣體系(15jil)條件下，超聲破碎后上清中重組干擾素a2b蛋白的表達(dá)量要高于超聲破碎后的沉淀物。由于上清液(lml)與沉淀物(IOOmI)的體積比為10:1。所以在誘導(dǎo)后的表達(dá)菌株中，重組人干擾素a2b蛋白的90%以上以可溶性蛋白的形式存在。實(shí)施例4重組人干擾素a2b蛋白的表達(dá)純化及活性測定實(shí)施例3中菌體超聲破碎后上清液，經(jīng)離子交換層析、超濾濃縮、分子篩層析純化后，獲得純度99。/。以上重組人干擾素a2b蛋白。電泳純度檢測結(jié)果見附圖5。離子交換層析后層析主組分(泳道l、2)，電泳純度98%;分子篩層析純化后(泳道3、4)，電泳純度99%以上。經(jīng)細(xì)胞病變抑制法測活，比活達(dá)到4.0x108IU/mg。10序列表序列表<110〉北京凱因科技股份有限公司<120>重組人干擾素a2b的基因優(yōu)化及高效表達(dá)〈130>kawin0812〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.2〈210>1<211>520<212>腿<213〉大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)<400>1cgggatcccatatgtgcgatctgccgcagacccatagcctgggcagccgtcgtaccctga60tgctgctggcgcagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgatt120ttggtttcccgcaggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcgg犯accattccggtgc180tgcatgagatgatccagcagattttcaatctgtttagcacgaaagatagcagcgccgcct240ggg3tg犯3Ccctgctggataaat111ataCCg犯Ctgt3tcagcagctgaacgatctgg300aagcgtgtgtgattcagggtgttggcgtgacggagaccccgctgatgaaagaagatagca360tcctggcggtgcgtaaatatttccagcgcattaccctgtacctgaaagaaaaga犯tat3420gcccgtgtgcCtgggElElgttgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctgagcacca480atctgcaggaaagcctgcgt犯tg犯ttcc520<210>2<211>502<212〉腿〈213〉大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)<400〉2atgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctgatgctgctggcg60cagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgattttggtttcccg120caggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcggaaaccattccggtgctgcatgagatg180atccagcagattttcaatctgtttagcacga犯gatagcagcgccgcctgggatgaaacc240ctgctggataaattttataccgaactgtatcagcagctgaacgatctggaagcgtgtgtg300attcsgggtgttggcgtgacggagaccccgCtg3tg犯3g犯gatagcatcctggcggtg360cgt犯atatttccagcgcattaccctgtacctg犯aga^agaaatatagcccgtgtgcc420tggg犯gUgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctctgcaggaa480agcctgcgtagca犯gaataat5021權(quán)利要求1、兩條重組人干擾素a2b編碼基因的大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列IFN-a2b及hIFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo1及SEQIDNo2所示。2、一株高效表達(dá)重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/7er/c/2/aco//)CGMCCNo.2827。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列IFN-a2b及MFN-a2b在工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素a2b中的應(yīng)用。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸埃希氏菌在工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素a2b中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了兩條重組人干擾素a2b編碼基因的優(yōu)化序列，以及一株高效表達(dá)重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌。本發(fā)明提供的高效表達(dá)重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCCNo.2827，其重組人干擾素a2b基因序列是經(jīng)由大腸桿菌密碼子優(yōu)化的序列，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的50％以上，且表達(dá)的蛋白更易于純化并具有更高的活性。文檔編號C12P21/02GK101508994SQ20091007777公開日2009年8月19日申請日期2009年2月19日優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日發(fā)明者春吉,周德勝,張春麗申請人:北京凱因科技股份有限公司