專利名稱：一種植物基因組快速提取試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，通過對傳統(tǒng)堿裂解制備基因組
的方法進(jìn)行優(yōu)化而開發(fā)了一種適于PCR擴(kuò)增的快速提取多種植物基 因組的方法，以及適用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
自1994年首批轉(zhuǎn)基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花獲準(zhǔn)商 業(yè)化生產(chǎn)以來，國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物共有16類70 多種[James:Brief No.21-2000:Global status of commercialized transgenic crops.2000]。轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因食品因其在抗逆性或營養(yǎng) 學(xué)價(jià)值和食物風(fēng)味的改善等方面具有傳統(tǒng)食品無可比擬的優(yōu)勢，而迅 速占領(lǐng)了巿場，大大滿足了人們生活的需要。然而，與此同時，轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)品的安全性也是人們 一直關(guān)注的話題。包括中國在內(nèi)的很多國家 要求企業(yè)在產(chǎn)品包裝中標(biāo)明其中的轉(zhuǎn)基因成分，以便消費(fèi)者自主選 擇。這就要求國家和企業(yè)加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因食品的檢測。
基于PCR反應(yīng)的分子檢測具有速度快、靈敏度高、對模板要求 較低等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法。傳統(tǒng)的基 因組模板制備方法如CTAB法、SDS法，多是釆用表面活性物質(zhì)裂 解樣品細(xì)胞，從而使基因組釋放出來，再經(jīng)過一系列的抽提、分離， 將樣品中的雜質(zhì)一一除去，最終得到純凈完整的DNA分子。這些方 法的優(yōu)點(diǎn)是得到的基因組純度高、完整性好，在分子生物學(xué)研究上具 有廣泛的應(yīng)用，但是其缺點(diǎn)也是十分明顯的——即使經(jīng)過改進(jìn)，仍存 在反復(fù)離心、沉淀的步驟，消耗大量的人力和時間[GeorgeS.:ASimple
Bacterial DNA .[J]Plant Molecular Biology. 2004,22: 71-81],藥品中Tris-飽和酚、異戊醇等存在一定毒性，整個基因組提取過程需要約2h,
這顯然不能滿足快速檢測的需要。
目前國內(nèi)外開發(fā)了多種商品化的DNA提取純化試劑盒，其分離 原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用特異性膜與DNA結(jié)合達(dá) 到分離、回收的目的，如離子交換柱、磁珠等。這些試劑盒針對不同 的材料來源設(shè)計(jì)了不同的提取方法，操作簡單、高效，DNA質(zhì)量較 高，但價(jià)格昂貴且提取量少。
堿裂解法[Klimyuk V.I.:Alkai treatment for rapid preparation plant material for reliable PCR analssis.[J〗Plant.l993，3:493-494]和高溫水煮 法 [Henry R丄Practical Applications of Plant Molecular Biology.Chapman&Ha11,1997〗作為常見的快速簡便的提取基因組的 方法，利用堿性、高溫等條件對植物組織進(jìn)行處理，使其細(xì)胞膜溶解、 蛋白變性，基因組游離出來，得到的基因組不需經(jīng)過復(fù)雜的才純化過 程，即可直接用于PCR反應(yīng)。有資料介紹，利用堿裂解法提取基因 組，每人每天可以提取超過5000個樣品。但是，在目前的文獻(xiàn)中， 這些方法多被應(yīng)用于幼嫩的根、葉等少數(shù)DNA含量豐富的植物組織， 對于樣品要求較為苛刻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適于PCR擴(kuò)增的快速提取植物基因 組的試劑盒以及相應(yīng)的提取方法，以滿足植物原材料包括植物尤其是 轉(zhuǎn)基因作物分子檢測的需要。
堿裂解法提取植物基因組DNA主要包括裂解液裂解、中和液中 和以及沉淀液沉淀等步驟，本發(fā)明針對這三個關(guān)鍵步驟進(jìn)行了優(yōu)化， 對裂解液、中和液以及沉淀液作了調(diào)整，使其能夠最大限度地保留基 因組并取出雜質(zhì)。
基于此，本發(fā)明提供一種適于PCR擴(kuò)增的植物基因組快速提取 試劑盒，其包括如下組成
5裂解液0.3-1.0 mol/LNaOH， 5-20 mmol/LEDTA, 10-30 mmol/L Tris-HCl， 30-60 mmol/L KC1 ， 0.03-0.08% Tween20 ， 0.05-0.15% TritonX-100, 0.05-0.20% PVP， 0.05-0.15%牛血清白蛋白，0.05-0,15% DEPC;或其濃縮液
中和液2誦5 mol/L NaAc, 20-70 mmol/L NaCl, 20-40mmol/L MgCl2， 20-40 mmol/LMnCl2， pH=5.2;或其濃縮液
沉淀液0.05-0.20 % mol/L NaAc和0.05-0.20%mol/L NH4Ac的異 丙醇溶液；或其濃縮液。
優(yōu)選裂解液0.5mol/L NaOH, lOmmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl， 5O腿ol/LKC1， 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-100， 0.1% PVP, 0.1%牛血清白蛋白，0.1%DEPC;或其濃縮液
優(yōu)選中和液3mol/LNaAc, 50mmol/LNaCl， 25mmol/L MgCl2, 25 mmol/LMnCl2,pH=5.2;或其濃縮液
優(yōu)選沉淀液0.1 mol/L NaAc和0.1 mol/L NH4Ac的異丙醇溶液； 或其濃縮液。
上述濃縮液可以是工作液濃度的5~20倍，將工作液濃縮后可以 提高試劑盒的使用次數(shù)。在使用時，將濃縮液按照濃縮倍數(shù)稀釋到工 作液狀態(tài)，稀釋液為各試液的溶劑，對于裂解液和中和液而言，稀釋 液為水，沉淀液的稀釋液為異丙醇。
本發(fā)明提供的提取植物基因組的方法，其包括如下步驟
1) 取研磨成粉末狀的植物組織樣品，按重量體積比l: 5 20加 入上述試劑盒中裂解液；
2) 輕微攪動混勻后，沸水洛50 70S;
3) 加入上述試劑盒中的中和液調(diào)節(jié)pH至5.2-6.0，輕輕顛倒混
勾；
4) 離心取上清，加入上清液等體積預(yù)冷的上述沉淀液，混勾后 離心棄上清；5)用適量乙醇溶液洗滌沉淀并吹干，
在實(shí)際使用時，試劑盒一般釆用各試劑的濃縮液形式，這時需要 將它們稀釋至工作濃度使用。
其中上述步驟l)優(yōu)選按照樣品與裂解液重量體積比1: 10加入 裂解液；
其中步驟2)沸水洛時間以lmin為宜；
其中步驟3)優(yōu)選按照裂解液與中和液體積比2: 3加入中和液 中和；
其中步驟4)離心轉(zhuǎn)速一般為12000rpm,離心10 12min,預(yù)冷
沉淀液通常以零度以下為佳；
其中步驟5)通常使用70%的乙醇洗滌。
更具體地，可以采用如下步驟進(jìn)行提取
1)選擇植物組織適合部位研磨成粉末后，備用；
2 )稱取0.05g 0.lg樣品(不同樣品不同用量)于2ml Eppendorf
離心管中，加入500 1000jil裂解液；
3) 用槍頭小心攪拌使其充分混勻，沸水洛加熱lmin;
4) 取出后加入333 666ixl中和液中和，輕輕顛倒混勻；
5) 12000rpm離心10~12min后將盡可能多的上清轉(zhuǎn)移到另一個 新的2ml Eppendorf離心管中；
6) 加入與上清等體積的沉淀液，混勻后12000rpm離心10~12min 后棄去上清，如果加入中和液離心后上清太多，可將上清分兩部分沉 淀，最后合并沉淀。
7) 向沉淀中加入適量70%乙醇洗滌并吹干。
在使用時，向離心管中加入適量雙蒸水(30^1)溶解，用于PCR 反應(yīng)并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
本發(fā)明所述的樣本為植物組織，包含多種植物中可以食用的組織 或器官，以及食品領(lǐng)域內(nèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。淀液也可以分成兩部分加入，例如依次加入0.05倍體積的助沉 液(2mol/LNaAc, 2mol/LNH4Ac)和0.95倍體積的異丙醇，最終
使其比例為沉淀液上清液=1: 1。
本發(fā)明所述的沉淀液使用前可以在-20。C冰箱內(nèi)孕育15-30分鐘， 以達(dá)到與冷的目的。
本發(fā)明中和劑中3mol/LNaAc (pH=5.2)的作用是 一方面，調(diào) 節(jié)裂解后溶液的pH，經(jīng)過裂解步驟，在高pH的條件下，富含淀粉 的植物組織因淀粉糊化而呈現(xiàn)粘稠狀態(tài)，即使長時間高速離心也無法 得到上清液，嚴(yán)重影響植物基因組的提取，加入中和液后，破壞淀粉 糊化狀態(tài)。另一方面，中性鹽溶液(如NaAc、 NaCl等)具有沉淀多 糖、蛋白質(zhì)的作用，可以有效的去除雜質(zhì)，凈化基因組。
經(jīng)過中和的基因組由于含有大量鹽離子，離子強(qiáng)度較大，且基因 組濃度較小，直接用于PCR反應(yīng)可能導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。因此引 入含有NH4Ac等鹽類助沉劑的醇類沉淀液的沉淀步驟，可以對基因 組進(jìn)行洗滌，進(jìn)一步去除醇溶性雜質(zhì)，降低離子強(qiáng)度，同時也起到濃 縮作用，增加了方法的靈敏度。
此外，本發(fā)明在每一步反應(yīng)中，均進(jìn)行了試劑優(yōu)化。例如在裂解 液中加入抑制核酶活性的成分，中和液中加入穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的二價(jià) 離子和核酶抑制成分，在沉淀液中加入鹽類助沉劑等等。這些都使本 發(fā)明用于提取植物基因組時有更大的優(yōu)勢。
本發(fā)明優(yōu)化了裂解液的組成，可以更好的保持基因組的完整性。 優(yōu)化了中和液的組成與用量，通過調(diào)整中和后體系的pH值，增加核 酶抑制成分，來最大程度的保留基因組并去除雜質(zhì)。同時增加了含有 NH4Ac等鹽類助沉劑的醇類沉淀液的沉淀步驟，通過優(yōu)化沉淀液的 配方來最大限度的獲得基因組模板，去除其他雜質(zhì)并對基因組進(jìn)行濃 縮以提高檢測的靈敏度。本發(fā)明僅21min就可以提取出植物的DNA， 直接作為PCR的模板，用于分子生物學(xué)尤其是轉(zhuǎn)基因作物的分子檢
8測操作。
本發(fā)明與其他堿裂解法相比，明顯擴(kuò)大適用樣品的范圍，即使用
這種方法提取多糖、蛋白質(zhì)、脂肪含量豐富的樣品，仍可以得到令人 滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn),本發(fā)明提取的基因組雖然存在降解，
仍適用于600bp以下目的基因的有效擴(kuò)增，且對植物的內(nèi)源基因和外
源基因的擴(kuò)增均有良好效果。而且反應(yīng)靈敏度高，可用于在復(fù)雜的食 物體系中發(fā)現(xiàn)含量在1%以上的樣品。本發(fā)明使用的試劑均為分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常見試劑，試劑成本低，毒性小，安全性好，對條件要 求寬松，且方法簡便，尤其適用于新鮮樣品及轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測。


圖1顯示的是本發(fā)明方法的技術(shù)路線流程圖。
圖2顯示的是使用本發(fā)明的方法對多種植物基因組進(jìn)行提取的 結(jié)果，其中l(wèi).玉米，2.花生，3.大豆，4.芹菜，5.茼蒿，6.油菜，7.西 紅柿，8.胡蘿卜，9.西蘭花，M為marker。
圖3顯示的是以IVR226為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物的電泳 結(jié)果。圖中各樣品依次為l.玉米，2.花生，3.大豆，4.芹菜，5.茼蒿， 6.油菜，7.西紅柿，8.胡蘿卜，9.西蘭花，M為marker, 0為空白對 照。
圖4顯示的是使用本發(fā)明的方法擴(kuò)增不同片段大小的目的基因 結(jié)果，其中l(wèi)-3為以BT176-570為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物的 電泳結(jié)果，1以本發(fā)明的方法提取基因組為模板，2以CTAB法提取 基因組為模板，3為陰性對照。4~6為以CAMV35S-195bp為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物的電泳結(jié)果，4以本發(fā)明的方法提取基因組為 模板，5以CTAB法提取基因組為模板，6為陰性對照。7~9為以 BT176-100bp為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物的電泳結(jié)果，7以本發(fā) 明的方法提取基因組為模板，8以CTAB法提取基因組為模板，9為 陰性對照。
9圖5顯示的是本發(fā)明方法的靈敏度的檢測結(jié)果，其中1~4為玉米 含量50、 10%、 1%、 0.1%的玉米大豆混合樣品，5為純大豆樣品，0 為空白對照。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā) 明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步 驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
本發(fā)明中涉及到的百分號"％"，若未特別說明，是指質(zhì)量百分 比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有溶質(zhì)若 干克；液體之間的百分比，是指在2(TC時容量的比例。
實(shí)施例l使用本發(fā)明的方法對多種植物基因組進(jìn)行提取
作為一種用于分子檢測的植物基因組快速制備方法，我們希望這 種方法具有廣泛的適用性，可以廣泛的應(yīng)用于食品領(lǐng)域內(nèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 的分子檢測。植物中可以食用的組織或器官大體可以分為如下幾類 根、莖、葉、花、果實(shí)、種子，為了檢驗(yàn)方法的普適性，我們在選擇 樣品的時候不僅要涵蓋植物可以食用的組織部分，還要盡量選擇不同 科屬的植物作為研究對象，因此，在樣品選擇時，本例選擇(l)谷 物類玉米、大豆、花生；(2)莖類；茼蒿、芹菜；(3)葉類油菜、；(4) 根類胡蘿卜;(5)花類西蘭花；(6)果實(shí)類番茄。
具體操作如下
a、 糧谷類BT176轉(zhuǎn)基因玉米、大豆為實(shí)驗(yàn)室儲備，花生購自 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)菜巿場，用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩子備用；
b、 莖類茼蒿、芹菜取莖部分，液氣研磨后備用 e、葉類油菜，取新鮮葉子加液氣研磨后備用d、 根類胡蘿卜，去皮后取式適量樣品，加液氮研磨后備用
e、 花類西蘭花，去除莖部，僅保留花，加液氮研磨后備用
f、 果實(shí)類番茄，去除果蒂，取可食部分加液氮研磨后備用 b f樣品均購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)菜巿場。
樣品a f均按本發(fā)明的方法提取基因組
1. 稱取0.05g樣品于1.5ml Eppendorf離心管中，加入500pl裂解 液(裂解液配方為0.5mol/L NaOH， 10mmol/L EDTA， 25mmol/L Tris隱HCl， 5Ommol/LKC1， 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-lOO， 0.1% PVP, 0.1%牛血清白蛋白(BSA)， 0.1%DEPC。)；
2. 用槍頭小心攪拌使其充分混勻，沸水洛加熱lmin;
3. 取出后加入333|il中和液(中和液配方為3mol/L NaAc, 50mmol/L NaCl ， 25mmol/L MgCl2， 25腿ol/L MnCl2, pH=5.2。) 中和，輕輕顛倒混勻；
4.12000rpm離心10min后將盡可能多的上清轉(zhuǎn)移到另 一個新的 1.5ml Eppendorf離心管中；
5. 加入經(jīng)過-20。C冰箱內(nèi)孕育15分鐘與上清等體積的沉淀液(沉 淀液配方為異丙醇，0.1 mol/L NaAc, 0.1 mol/L NH4Ac。)，混勻后 12000rpm離心10min后棄去上清；
6. 向沉淀中加入適量70%無水乙醇洗滌并吹干；
7. 向離心管中加30^1水溶解，上清即為模板DNA,進(jìn)行PCR 電泳檢測。
選用葉綠體(Chloroplast) rRNA-180為引物作為PCR檢測引物， 反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段約為180bp:引物Chloroplast rRNA-180的堿基
序列為
F5,國CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG -3' R5，-TTC CAT TGA GCT TCT GCA CCT-3'
反應(yīng)在30|il體系中進(jìn)行，體系組成包括10 x PCR buffer 3^1(10xPCR Buffer: 100腿ol / L Tris國HCl ， 500 mmol / L KC1， 15 mmol /LMgCl2), 2.5mmol/LdNTP 2.4^il ( Sigma，USA),上、下游引物各 1.5(il (由上海生工合成)，TaqDNA聚合酶0.4jxl ( Sigma，USA ), 提 取的DNA lpil ,用水補(bǔ)足至30^1 。
PCR反應(yīng)條件為94X:預(yù)變性5min; 94°。變性30s， 68。C退火30s， 72°〇延伸30s，共35個循環(huán)；最后72。C延伸10min。
基因組用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝 膠電泳檢測。電泳緩沖液為lxTAE, GOLDVIEW染色，凝膠成像儀 拍照并記錄結(jié)果。
結(jié)果表明經(jīng)過瓊脂糖電泳時后發(fā)現(xiàn)，以本發(fā)明的方法提取上述 樣品得到的基因組并不令人滿意。大部分樣品點(diǎn)樣空中有蛋白殘留， 部分樣品殘留量較多。所有樣品的基因組普遍存在嚴(yán)重降解，但不同 組織基因組降解情況不同，如玉米基因組條帶主要集中在，500bp以 下，部分組織甚至沒有得到電泳可見的基因組(如芽菜、胡蘿卜)。 (圖2)
盡管如此，對提取的基因組以ChloroplastrRNA-180為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后，所有樣品均得到電泳可見的目的基因條帶，且擴(kuò)增片段 的亮度差異不大(圖3)?？梢姡瑢τ诘矸酆枯^多的樣品(如玉米)， 脂肪含量較多的樣品(如花生)，蛋白含量較多的樣品(如大豆)，以 及各種新鮮的植物組織，以本發(fā)明的方法提取得到的基因組均可用于 PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例2使用本發(fā)明的方法擴(kuò)增不同片段大小的目的基因
由本發(fā)明的方法所得植物基因組因降解而呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，基因組 電泳條帶主要集中1000bp 200bp,而以上實(shí)施例中所擴(kuò)增的基因均 為200bp左右的植物內(nèi)標(biāo)基因，因此有較好的擴(kuò)增效果。為了比較該 方法對不同片段大小的基因的擴(kuò)增效果，本例選擇BT176玉米中的 三段基因作為擴(kuò)增對象，具體操作如下BT176轉(zhuǎn)基因玉米用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩子。 按照實(shí)施例1的本發(fā)明的方法和CTAB法(CTAB法參見許芳, 李鑫,羅欣,劉志國.玉米中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測[J].武漢工業(yè)學(xué) 院學(xué)報(bào)，2008，27(1):5-7，27.)提取基因組。分別以上述兩種方法提取的 DNA為模板，進(jìn)行PCR電泳檢測。
相應(yīng)選用引物分別為BT176-570,反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段約為 570bp; BT176-100，反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段約為100bp; CAMV35S-195， 反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段約為195bp。引物的堿基序列為
引物名稱上下游ji物序列片段大小 /bp
BT176隨570F5，-AAG CAC GGT CAACTT CCG TAC-3' R5 ，-TCG ACT TTA TAG GAA GGG AGA GG-3,570
F5，-GTG TCA CCA GCA GCA AAC CA(3-3' R5、ACT CCA CTT TOT GCA GAA CAG ATC T腸3，
CAMV35S-I95F5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3， R5 ，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3 ，195
其PCR反應(yīng)體系、10xPCRbuffer、 PCR反應(yīng)條件及檢測條件等 均與實(shí)施例1 一致。
結(jié)果表明本發(fā)明的方法提取的基因組盡管已經(jīng)片斷化，但是不 影響600bp左右片斷大小目的基因片段的擴(kuò)增效果，且擴(kuò)增效果比 CTAB法提取的基因組作為模板的擴(kuò)增效果要好一點(diǎn)，這可能因?yàn)榛?因組片斷化后減少了染色體空間折疊造成的位阻，使得引物與目的片 斷更容易結(jié)合。同樣對于195bp和100bp大小的BT176品系和 CAMV35s基因特異性片斷也獲得了良好的擴(kuò)增效果(圖4)，也就是說 對于本發(fā)明的方法提取的基因組對于600bp以下的目的片斷擴(kuò)增效 果比較理想，甚至比CTAB法提取的基因組的擴(kuò)增效果更好。由此可 以看出，本發(fā)明的方法比其他快速提取法能夠提取出更高質(zhì)量的基因 組，并且基因組中因?yàn)槌煞执蟠鬁p少也減輕了堿裂法對于PCR反應(yīng) 的抑制效果。由于目前轉(zhuǎn)基因成分定性檢測的目的擴(kuò)增片斷基本都小 于600bp,所以本發(fā)明的方法完全可以滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測的需
13要。
實(shí)施例3本發(fā)明的靈敏度的檢測結(jié)果
將BT176轉(zhuǎn)基因玉米粉與大豆粉按質(zhì)量比50%、 10%、 1%、 0.1% 混合后，按照實(shí)施例1的本發(fā)明的方法提取基因組，以提取的DNA 為模板，進(jìn)行PCR電泳檢測。選用玉米內(nèi)標(biāo)基因IVR226為引物作為 PCR檢測的引物，反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段約為226bp:引物IVR226的 堿基序列為
F5,隱CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TCA C畫3' R5'-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3' 其PCR反應(yīng)體系、10xPCRbuffer、 PCR反應(yīng)條件及檢測條件等
均與實(shí)施例1 一致。
結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)當(dāng)玉米粉的含量小于等于1%時，PCR擴(kuò)增后可
以得到肉眼可辯的目的基因條帶，繼續(xù)增加大豆粉的含量，則超過該
方法的分辨范圍，不易得到目標(biāo)條帶，本發(fā)明的方法可以分辨含量大
于1%的樣品。(圖5)
實(shí)施例4試劑盒的組成
配置一 (5倍濃縮液)
濃縮裂解液2.5mol/L NaOH， 50mmol/L EDTA， 125mmol/L Tris誦HCl， 25Ommol/LKC1， 0.25% Tween20， 0.5% TritonX掘，0.5% PVP， 0.5%牛血清白蛋白，0.5%DEPC;
濃縮中和液15mol/L NaAc， 250mmol/L NaCl, 125mmol/L MgCl2， 125 mmol/LMnCl2;
濃縮沉淀液0.5 mol/LNaAc和0.5 mol/LNH4Ac的異丙醇溶液。
配置二
裂解液0.3 mol/L NaOH, 8 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris-HCl ， 30mmol/LKCl， 0.08% Tween20, 0,15% TritonX國100, 0.20% PVP， 0.15%牛血清白蛋白，0.15% DEPC;中和液2mol/LNaAc, 20 mmol/L NaCl， 20mmol/L MgCl2， 20 mmol/L MnCl2,;
沉淀液0.05 mol/L NaAc和0.20mol/L NH4Ac的異丙醇溶液。
配置三
裂解液1.0 mol/L NaOH, 5 mmol/L EDTA ， 30 mmol/L Tris畫HCl ， 6Ommol/LKC1， 0.03% Tween20， 0.05% TritonX-100, 0.05% PVP， 0.15%牛血清白蛋白，0.05%DEPC;
中和液5mol/LNaAc， 70 mmol/L NaCl， 30mmol/L MgCl2, 30mmol/LMnCl2, pH=5.2;
沉淀液0.20 mol/L NaAc和0.05mol/L NH4Ac的異丙醇溶液。
配置四
裂解液0.5mol/L NaOH，20 mmol/L EDTA,20 mmol/L Tris-HCl， 40腿ol/L KC1, 0.05% Tween20, 0.1% TritonX國100， 0.05-0.20% PVP， 0.05-0.15%牛血清白蛋白，0.05-0.15% DEPC;或
其濃縮液
中和液3 mol/L NaAc， 50 mmol/L NaCl, 25mmol/L MgCl2, 25 mmol/LMnCl2, pH=5.2;
沉淀液0.1 mol/LNaAc和0.1mol/LNH4Ac的異丙醇溶液。 按照實(shí)施例2和3的方法使用本例配置二-四試劑分別提取玉米 基因組DNA并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，這三種配置的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施 例2和3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，實(shí)施例2和3的效果更好。
15序列表
〈110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種植物基因組快速提取試劑盒及其應(yīng)用
〈130> KHP09112453. 5
<160〉 8
<170> Patentln version 3. 5
〈210> <211> <212> <213> <400>
1
20 腿
人工序列 1
cgaaatcggt agacgctacg 20
<210> 2 <211> 21 <212> 腿 <213>人工序列 <400> 2
ttccattgag cttctgcacc t 21
<210> 3 <211> 21 <212> 腿 <213>人工序列 〈400> 3
aagcacggtc aacttccgta c 21
<210> 4 <211> 23 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 4
tcgactttat aggaagggag agg 23
<210> 5
<211> 21〈212〉 麗 <213>人工序列 ■> 5
gtgtcaccag cagcaaacca g 21
<210> 6 <211> 25 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400> 6
actccacttt gtgcagaaca gatct 25
〈210> 7 〈211> 19 〈212> DNA <213>人工序列 〈400> 7
gctcctacaa atgccatca 19
<210> 8 〈211〉 20 <212> 腿 <213>人工序列 <400〉 8
gatagtggga ttgtgcgtca 20
權(quán)利要求
1、一種植物基因組快速提取試劑盒，包括裂解液0.3-1.0mol/L NaOH，5-20mmol/L EDTA，10-30mmol/LTris-HCl，30-60mmol/L KCl，0.03-0.08％Tween20，0.05-0.15％TritonX-100，0.05-0.20％PVP，0.05-0.15％牛血清白蛋白，0.05-0.15％DEPC；或其濃縮液中和液2-5mol/L NaAc，20-70mmol/L NaCl，20-40mmol/LMgCl2，20-40mmol/L MnCl2，pH＝5.2；或其濃縮液沉淀液0.05-0.20mol/L NaAc和0.05-0.20mol/L NH4Ac的異丙醇溶液；或其濃縮液。
2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述裂解液的配 置為0.5mol/L NaOH， 10mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/LKCl, 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-lOO, 0.1% PVP, 0.1% 牛血清白蛋白，0.1%DEPC;或其濃縮液。
3、 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述中和液的配 置為3mol/LNaAc， 50mmol/L NaCl， 25mmol/L MgCl2， 25 mmol/L MnCl2， pH=5.2;或其濃縮液。
4、 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述沉 淀液的配置為0.1 mol/L NaAc和0.1 mol/L NH4Ac的異丙醇溶液； 或其濃縮液。
5、 權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述試劑盒在提取植物基因組中的應(yīng)用。
6、 一種提取植物基因組的方法，其包括如下步驟1) 取研磨成粉末狀的植物組織樣品，按重量體積比l: 5~20加 入權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述試劑盒中裂解液；2) 輕微攪動混勻后，沸水洛50 70S;3) 加入權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述試劑盒中的中和液調(diào)節(jié)pH至 5.2-6.0，輕輕顛倒混勾；4) 離心取上清，加入上清液等體積預(yù)冷的權(quán)利要求1~4任一項(xiàng) 所述沉淀液，混勻后離心棄上清；5) 用適量乙醇溶液洗滌沉淀并吹干，若所述裂解液、中和液以及沉淀液為其濃縮液時，稀釋至工作濃 度使用。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中步驟1)按照 樣品與裂解液重量體積比1: IO加入裂解液。
8、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中步驟2)沸水 浴lmin。
9、 如權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中步驟3) 按照中和液與裂解液體積比2: 3加入中和液中和。
10、 如權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中步驟4) 離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心10 12min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于PCR擴(kuò)增的快速提取植物基因組的試劑盒，包括裂解液、中和液和沉淀液，本發(fā)明試劑盒針對傳統(tǒng)堿裂解制備基因組的方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，擴(kuò)大了堿裂解法制備基因組的適用范圍。本發(fā)明廣泛適用于多種植物的基因組提取，并且可直接從植物種子中快速提取出用于PCR模板的基因組。對于600bp的目的基因的檢測效果顯著，對內(nèi)源基因和外源基因均有良好的擴(kuò)增效果，可以發(fā)現(xiàn)待測組分含量大于1％的樣品。整個基因組提取時間控制在21min，大大縮短了基因組提取時間。
文檔編號C12N15/10GK101575597SQ20091008535
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者南 張, 李筱婷, 羅云波, 許文濤, 黃昆侖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)