耐高溫甘藍(lán)型油菜乙二醛酶基因和蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及突變和遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域；尤其涉及一種耐高溫甘藍(lán)型油菜乙二醛 酶基因和蛋白及其應(yīng)用；具體涉及一種耐高溫甘藍(lán)型油菜乙二醛酶基因（Glyoxalase I， BnGLYI)的核苷酸序列，涉及耐高溫BnGLH的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，BnGLYI基因在畢赤酵 母中表達(dá)的重組菌株，涉及使用該基因構(gòu)建表達(dá)酵母表達(dá)載體，還涉及利用上述基因序列 進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子為我們供應(yīng)大多數(shù)食物和重要來(lái)源的動(dòng)物以及工業(yè)原料，高質(zhì)量的種子對(duì)社 會(huì)經(jīng)濟(jì)具有重要的意義[1]。很多生物和非生物因素影響種子活力萌發(fā)和耐貯性，例如環(huán)境 溫度較高或者種子在儲(chǔ)藏過(guò)程中因自身氧化產(chǎn)生的高溫可能降低種子活力、減緩或完全抑 制發(fā)芽[2]。然而，雖然目前已經(jīng)有部分研宄探討了植物耐高溫性分子方面、生理和遺傳學(xué)研 宄[2]，但是對(duì)種子耐熱性的研宄還比較稀少。
[0003] 甲基乙二醛（Methylglyoxal，MG)是一種細(xì)胞毒素的代謝物，MG產(chǎn)生于糖酵解、氨 基酸分解代謝、丙酮的正常代謝和環(huán)境逆境脅迫，在微生物、酵母、動(dòng)物以及高等植物中都 存在 [3]。生物體內(nèi)對(duì)MG的代謝主要是在乙二醛酶（glyoxalase，GLY)途徑完成的，該途徑 包括兩個(gè)酶，即乙二醛酶I(GLYI)和乙二醛酶II(GLYII)，是一種胞內(nèi)酶，普遍存在于各種 細(xì)胞器中。首先在GLH作用下將MG和谷胱甘肽（glutathione，GSH)縮合成生成S-D-乳 酸谷胱甘肽，降低MG的生理活性濃度，接著在GLH的作用下將S-D-乳酸谷胱甘肽水解成 無(wú)毒的GSH和D-乳酸[4]。近年來(lái)，研宄發(fā)現(xiàn)GLH基因是一個(gè)含多基因的基因家族[5]，不僅 參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫，及重金屬、高鹽、干旱等非生物脅迫產(chǎn)生 的應(yīng)答反應(yīng)和緩解其造成的損傷等方面起重要作用 [5] [6] [7]，但在高等植物中，有關(guān)GLH基 因是否具有耐熱性功能還鮮為報(bào)道。2002年，分離獲得騰沖噬熱厭氧菌中的耐高溫甲基乙 二醛合酶基因 [8]。2010年，研宄發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化香蕉乙二醛酶基因的釀酒酵母細(xì)胞抵抗極端溫度 的能力大幅度提高[9]。
[0004] 參考文獻(xiàn)
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[0012] [8]李蔚，于軍，鐘蘭，王俊，孫建東，杭州華大基因研發(fā)中心，耐高溫甲基乙二醛合 酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。申請(qǐng)?zhí)?1132107. 5,公開(kāi)號(hào)CN1364907。
[0013] [9]鄧成菊，張建斌，賈彩紅，金志強(qiáng)，徐碧玉。香蕉乙二醛酶基因增強(qiáng)釀酒酵母對(duì) 非生物脅迫抵抗能力的研究。中國(guó)生物工程雜志，2010,30(8) :22-26。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題和不足，提供一種耐高溫甘藍(lán)型油 菜乙二醛酶基因和蛋白及其應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0016] 我們?cè)诟仕{(lán)型油菜耐熱種質(zhì)資源中分離得到甘藍(lán)型油菜的乙二醛酶基因BnGLYI， 并通過(guò)酵母細(xì)胞的外源表達(dá)證明該基因具有耐熱性和耐冷性，并且該基因與騰沖噬熱厭氧 菌的耐熱GLH基因有很大的差異，兩者氨基酸的同源性僅為26%。因此，本發(fā)現(xiàn)不僅發(fā)現(xiàn) 了甘藍(lán)型油菜BnGLH基因的新功能，并且為轉(zhuǎn)基因工程菌和植物提供新的耐熱、耐冷基因 來(lái)源，進(jìn)而提高工程菌和植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的耐熱效果，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。
[0017] -、耐高溫甘藍(lán)型油菜乙二醛酶BnGLYI基因和蛋白
[0018] 針對(duì)目前世界糧食作物和油料作物儲(chǔ)藏面臨的問(wèn)題，以及對(duì)高溫及伴隨的干旱與 其它逆境對(duì)植物生產(chǎn)和生長(zhǎng)的影響與損失，本發(fā)明從耐熱的甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源中分離克 隆了新的基因BnGLYI，該基因表達(dá)產(chǎn)物使酵母細(xì)胞對(duì)高溫和低溫具有較高的抗性，而本發(fā) 明提供的該基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列與已知的GLH蛋白存在一定差異，并且我們首次 揭示了GLH的耐熱和耐冷性。這種新的基因可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)對(duì)溫 度脅迫的耐性。
[0019] 本發(fā)明提供一種對(duì)甘藍(lán)型油菜種子耐熱和耐冷性有貢獻(xiàn)的BnGLH基因序列，以 應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)生物和非生物脅迫的抗逆性。
[0020] 甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源3382,由國(guó)家自然科技資源e平臺(tái)（國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平 臺(tái)）提供，其保藏號(hào)為00003382,可保證20年提供共享利用。
[0021] 甘藍(lán)型油菜耐熱性BnGLYI基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示；
[0022] 甘藍(lán)型油菜耐熱性BnGLYI蛋白，由上述BnGLYI基因所編碼，其氨基酸序列如SEQ IDN02所示。
[0023] 二、耐高溫甘藍(lán)型油菜乙二醛酶BnGLYI基因和蛋白的應(yīng)用
[0024] ①BnGLYI基因在轉(zhuǎn)基因微生物中的應(yīng)用
[0025]轉(zhuǎn)化BnGLYI基因的畢赤酵母菌株GSGLYI，獲得耐熱性和耐冷性；
[0026] ②BnGLYI基因在植物抗逆性中的應(yīng)用。
[0027] 所述應(yīng)用為將含有BnGLYI基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物或植物，使之產(chǎn)生耐熱和 耐冷性。
[0028] 三、具體技術(shù)方案由以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0029] ①通過(guò)耐熱性甘藍(lán)型油菜中的篩選，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜3382的耐熱性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其 他油菜品種；對(duì)篩選得到的耐熱種質(zhì)進(jìn)行雙向電泳的分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)約21kD的小分子蛋白 在熱處理后是處理前表達(dá)量的2倍；該蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸同源性 與芥菜型油菜BjGLYI的同源性高，score值達(dá)到了 117。
[0030] ②提取甘藍(lán)型油菜種子的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成CDNA為模版，以引物對(duì)進(jìn)行BnGLH編 碼區(qū)域的擴(kuò)增與克隆：
[0031] BnGLYI F j'-ATGGCGTCGGAAGCGAAGG-S'，如SEQ ID N03所示；
[0032] BnGLYRj^TCAAGCTGCGTTTCCGGCTG-S'如SEQIDN04所示。
[0033] ③用KOD-PLUSDNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯示擴(kuò)增出約558bp的條帶，擴(kuò)增片段 末端加A后，連接到pEASY-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到重組質(zhì)粒GLY-T;對(duì)插入片斷 進(jìn)行測(cè)序分析，分析表明其含有開(kāi)放閱讀框，0RF1的位置是1-558,編碼185個(gè)氨基酸組成 的蛋白，同源分析表明該蛋白與其它的GLYI蛋白具有較高同源性；由于與已知的芥菜型油 菜GLH類蛋白氨基酸同源性最高達(dá)到99%，與已經(jīng)報(bào)道的騰沖噬熱厭氧菌的基因有很大 的差異，兩者氨基酸的同源性僅為26%，通過(guò)Blast結(jié)果顯示，該基因的具有GLH蛋白的保 守功能結(jié)構(gòu)域。
[0034] ④BnGLH轉(zhuǎn)畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建，