專(zhuān)利名稱(chēng)：融合肝素酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程和生物催化領(lǐng)域，特別涉及融合肝素酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素酶(h印arinase)是一類(lèi)作用于肝素的多糖裂解酶，在許多種微生物中發(fā)現(xiàn)， 包括棒桿菌Co2T/2e^"ew'咖sp.(高寧國(guó)等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件，微 生物學(xué)報(bào)1999 Vol. 39:64-67)、鞘胺醇桿菌5^ i/^o&cz^W咖sp.(高寧國(guó)等， 鞘胺醇桿菌肝素酶的產(chǎn)生，微生物學(xué)報(bào)2003 Vol. 43:813-816)、枯草芽胞桿菌5ac sw&iA's (王忠彥等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究，四川大學(xué)學(xué) 報(bào)(自然科學(xué)版)2002 Vol. 39:777-779)、環(huán)狀芽孢桿菌^aci77ws ci扁7愿(Ya sutaka Tahara et al. ， Purification and characterization of hepaxinase tha t degrades both heparin and heparin sulfate from 5aciJJ〃51 circ〃2朋51 BioS ci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66:1181-1184)、解肝素?cái)M桿菌尸rerafe"a / eparzV2o/y"'C3 (Kazuyuki Sugahara et al. ，Characterization of heparinase from an oral bacterium jPrerote77a力eparz'/7CL/j^ica J". Biochem. 1998 Vol. 123:2 83-288)、糞便擬桿菌"acterazVes sfercoris HJ-15 (Dong Hyuu Kim et al., Pu rification and characterization of a novel hepaxinase from Sacfaraz'ofes ^rcoi^s HJ-15 J. Biochem. 2000 Vol. 128: 323-328)和肝素黃桿菌FZgra力acfej7'〃歷 力e; ari/2咖(Sasiekharan， R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University)。但是來(lái)自 肝素黃桿菌的肝素酶是商業(yè)化的唯一來(lái)源。
肝素酶的研究具有十分重要的意義(Sasiekharan，R. 1991 Ph.D. Thesis, Hava rd University; Sasiekharan，R. et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of h印arinase I, II， and III from /^/sra^scfer j'咖/ ep3n'/7w邁Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229:770-777):肝素酶是多糖裂解酶的一種，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之 間的相互作用有助于闡明多糖裂解酶的作用機(jī)制；肝素酶可以用于解析肝素等復(fù)雜粘 多糖的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能；肝素酶可以用于解析人體內(nèi)的凝血和抗凝血機(jī)制；肝素 酶可以用作臨床血液肝素化的去除，防止手術(shù)后出血；肝素酶用于PCR反應(yīng)前血液制 品的處理；肝素酶可以用于制備低分子的抗凝血藥物低分子量肝素。
來(lái)自肝素黃桿菌的肝素酶主要有三種，分別命名為肝素酶I (EC 4.2.2.7) 、 II(NO EC code)和III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. ， Purification and characterization of heparin lyases from /^3KoZ scferi鵬力epariV 咖JBC 1992 Vol. 267:24347-24355)。其中肝素黃桿菌的肝素酶I (H印A)是目前為止研究最充分 的肝素酶之一，其在低分子肝素的生產(chǎn)和體外血液循環(huán)中肝素的去除上的應(yīng)用已有報(bào) 道，具有巨大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。
肝素酶I通常是從肝素黃桿菌發(fā)酵液中提純獲得的，通常需要經(jīng)過(guò)多步的色譜純 化，收率比較低。肝素黃桿菌增長(zhǎng)速度慢，肝素酶的生產(chǎn)穩(wěn)定性差，而且，產(chǎn)肝素酶 需要價(jià)格昂貴的肝素誘導(dǎo)，增加了酶的成本，因而重組菌生產(chǎn)肝素酶I受到極大的關(guān) 注，但通常情況下重組肝素酶I極容易形成包涵體，需要復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程才能形成活 性蛋白。
來(lái)自大腸桿菌的天然的麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與大腸桿 菌對(duì)麥芽糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。MBP不但能與amylose結(jié)合，實(shí)現(xiàn)親和分離，也能與馬鈴 薯淀粉結(jié)合實(shí)現(xiàn)親和分離(廉德君等， 一種改進(jìn)的融合蛋白親和層析純化方法，生物 化學(xué)與生物物理進(jìn)展1998 Vol. 25:283-284; Usha Srinivasan et al. ， A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions Journal of Biotechnology 1998 Vol. 62:163-167)，從而可大大降低酶的分離純化的成本。 本研究小組前期利用融合蛋白技術(shù)，將MBP與從肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I融合，構(gòu)建 了高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，5L發(fā)酵罐生產(chǎn)酶活可達(dá)20000IU/L以上(Chen Yin, Xing Xin-hui， Ye Feng-chun， Kuang Ying, !Luo Ming-fang. Production of MBP-HepA fusion protein in recombinant Escherichia coli by optimization of culture medium, Biochemical Engineering Journal, 2007, 34:114-121)。該法得到的重組肝素酶I只需 進(jìn)行一步親和層析就能達(dá)到95%的純化效果。此項(xiàng)工作已申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為 200410038098. 6。
綠色熒光蛋白GFP，自從1994年Chalfie等(Chalfie M， Tu Y， Euskirchen G， Ward WW, Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994， 263:802-805 )首次在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)出來(lái)后，由于該熒光蛋白 穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性、熒光檢測(cè)簡(jiǎn)單，而且產(chǎn)熒光不需要底物等特點(diǎn)，已成為在生理 學(xué)和生物技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)中應(yīng)用最廣泛的報(bào)告蛋白之一。但是，目前為止GFP在生 物學(xué)和生物技術(shù)中的應(yīng)用主要側(cè)重于各種定性解析，將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)生物生產(chǎn)過(guò)程 的定量監(jiān)測(cè)及過(guò)程優(yōu)化是一個(gè)新的領(lǐng)域。Poppenborg等(Poppenborg L， Friehs K, Flaschel E The green fluorescent protein is a versatile reporter for bioprocess monitoring. J. Biotechnol. 1997， 58:79-88 )首次證明了將GFP融合到一親和耙物上可以實(shí)現(xiàn)諸如培養(yǎng)、色譜分離等過(guò)程的快速監(jiān)測(cè)。因此，GFP是用于定量快i!^測(cè)
細(xì)胞培養(yǎng)、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及追蹤固定化酶使用過(guò)程特性的具有極大潛力的工具。本
實(shí)驗(yàn)室前期利用融合蛋白技術(shù)，將GFP與從肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I融合，構(gòu)建了生 產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株(ChenYin， Xing Xin-hui, Ye Feng-chun， Kuang Ying. Soluble expression and rapid quantification of GFP-h印A fusion protein in recombinant Escherichia coli， Chinese Journal of Chemical Engineering, 2007， 15:122-126) 。 GFP的融合可以利用熒光測(cè)量對(duì)工程菌濃度及肝素酶I酶活進(jìn)行快速定量追 蹤，有利于肝素酶I生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化和控制，有利于肝素酶的保存和應(yīng)用過(guò)程的快速評(píng)價(jià)， 有利于解析大分子肝素的結(jié)構(gòu)和降解機(jī)理。此項(xiàng)工作已申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為200510090872. 2。 現(xiàn)有的肝素酶I生產(chǎn)和催化工藝中，缺乏酶生產(chǎn)一分離一應(yīng)用整個(gè)過(guò)程的集成方 法。因此，肝素酶I的高效可溶表達(dá)、分離純化、固定化、高效催化以及酶活的快速 檢測(cè)等多功能化集成就具有十分重要的意義。融合蛋白技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一多功能化集成 的有效手段之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合肝素酶。
本發(fā)明提供的融合肝素酶，命名為GFP-MBP-HepA，是如下a)或b)的蛋白
a) 序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
b) 在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
上述b)的蛋白的氨基酸序列具體可為序列表中序列1所示的氨基酸序列。 上述蛋白的編碼基因，命名為妳-附*-/^^4，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 上述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列
1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；
2) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼上述蛋白的核苷酸 序列；
3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼上述蛋白的 核苷酸序列。
序列2中，g歩的編碼區(qū)是序列2的自5'端第22-735位的堿基；m^的編碼區(qū)是序 列2的自5'端第781-1881位的堿基；//印^的編碼區(qū)是序列2的自5'端第1959-3048位 的堿基。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，PH7. 2，7%SDS)中，65-C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7.2， 7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65t:雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液 I (20ramol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 5%SDS) ， 65'C洗膜2次，每次30min;加入洗膜 液II(20,1/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 1%SDS)， 65。C洗膜30min。
含有上述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
上述重組載體是通過(guò)以下步驟構(gòu)建的
將序列表中序列2的第1位-1881位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；
所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1959-3048位所示的肝素酶I的編碼 基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到的重組質(zhì)粒。
含有權(quán)利要求上述基因的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
上述重組菌是含有上述的重組載體的重組大腸桿菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將上述的重組菌誘導(dǎo)培 養(yǎng)，表達(dá)得到肝素酶。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是0. 3-lmM的IPTG， 10-30。C誘導(dǎo)培養(yǎng)5-30小時(shí)。 搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明產(chǎn)生的融合肝素酶的酶活可達(dá)723. 1IU/L培養(yǎng)基，比 酶活可達(dá)1.548 IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在 線(xiàn)檢測(cè)。因?yàn)楸景l(fā)明中酶活與細(xì)菌濃度、熒光強(qiáng)度均存在著良好的線(xiàn)性關(guān)系，可以利 用熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌濃度以及酶活的快速定量。上述結(jié)果說(shuō)明在發(fā)酵培養(yǎng) 過(guò)程中可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以快速獲得菌體濃度和肝素酶I的酶活的變化，從而實(shí) 現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)化和控制。


圖1為表達(dá)載體pMAL-hepA的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖2為從肝素黃桿菌中PCR擴(kuò)增得到的肝素酶I基因電泳圖譜。
圖3為表達(dá)載體phGMH-Ll的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖4為大腸桿菌TBl/phGMH-Ll和TOP10/phGMH-Ll兩株工程菌株表達(dá) GFP-MBP-HepA的SDS-PAGE電泳分析圖。
圖5為大腸桿菌TBl/phGMH-Ll和TOP10/phGMH-Ll兩株工程菌株15度誘導(dǎo)培 養(yǎng)21h后菌體濃度、粗酶液酶活及熒光量比較情況示意圖。
圖6為大腸桿菌TBl/phGMH-Ll和TOP10/phGMH-Ll兩株工程菌株15度誘導(dǎo)培 養(yǎng)21h后粗酶液比酶活及比熒光強(qiáng)度比較情況示意圖。
6圖7為T(mén)OP10/phGMH-Ll培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L 培養(yǎng)基)和熒光強(qiáng)度(U/L)的變化曲線(xiàn)圖。
圖8為T(mén)OP10/phGMH-Ll培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞濃度(OD卿)、熒光強(qiáng)度(U/L)與肝素 酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)的關(guān)系曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1.綠色熒光蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I三重融合蛋白的表達(dá) 一、三重融合蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建
1、含有麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I 二重融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體 pMAL-c2x-H印A的構(gòu)建
表達(dá)載體pMAL-c2x-HepA的構(gòu)建過(guò)程如圖l所示，具體過(guò)程如下從肝素黃桿 菌(F/flVflte"e〃'ww/ze; an'"wm)(購(gòu)買(mǎi)自IAM)的染色體組DNA中擴(kuò)增肝素酶I基因， 所用的引物分別為
上游引物5' -GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC -3'(帶下劃線(xiàn) 的堿基為BamHI的酶識(shí)別位點(diǎn))，
下游引物5' - CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC- 3'(帶下 劃線(xiàn)的堿基為HindIII酶識(shí)別位點(diǎn))，擴(kuò)增后，分別引入BamHI和Hindin酶識(shí)別位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50ng模板DNA， 100pmol每種引物，lx擴(kuò)增緩沖液(北 京天為生物技術(shù)有限公司)，200(imol/L每種dNTP， l單位高保PfU酶；擴(kuò)增程序?yàn)?95攝氏度變性5分鐘，50-60 (51、 53、 55、 57或59。C)攝氏度引物退火45秒，72 攝氏度引物延伸90秒，30個(gè)循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應(yīng)。該P(yáng)CR結(jié)果如 圖2所示，表明擴(kuò)增得到l.lkb的肝素酶I基因片段。測(cè)序表明，該片段具有自序列表 中序列2的自5'端第1959-3048位核苷酸序列。圖2中，泳道2-6分別為引物退火 溫度為51、 53、 55、 57或59。C擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為分子量marker (條帶大小依次為 15kb、 10kb、 7500bp、 5000bp、 2500bp、 1000bp、 750bp)，箭頭所指處為l.lkb目標(biāo) 片段。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII雙酶切后，分別插入到購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司的pMAL-c2x載體的BamHI和HindIII酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到p MAL-c2x重組載體，將pMAL-c2x重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,以5'GCCTGGAT CCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3'禾卩5' CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3，為引物，通過(guò)菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，提取可得到l.lkb PCR產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)化子中的pMAL-c2x重組載體，分別通過(guò)BamHI和HindIII雙酶切驗(yàn)證。將通過(guò)Ba mHI和HindIII雙酶切得到l.lkb片段的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將含有具有序列表中序列2的 自5'端第1959-3048位核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白編碼基因的pMal-c2x重組載體 命名為pMAL-c2x-HepA。在pMAL-c2x-HepA中，T/e/W基因與/acZa基因之間有兩 個(gè)連續(xù)的終止密碼TAGTAA，從而能夠有效地終止蛋白翻譯不會(huì)表達(dá)lacZa蛋白。 2、三重融合蛋白表達(dá)載體phGMH的構(gòu)建
根據(jù)三重融合蛋白中連接綠色熒光蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白的氨基酸殘基序列不 同，我們構(gòu)建了 phGMH表達(dá)載體，命名為phGMH-Ll， phGMH-Ll中連接GFP與MBP 的氨基酸殘基序列為(GGGGS)3，構(gòu)建過(guò)程如圖3所示。具體過(guò)程如下
phGMH-Ll的構(gòu)建過(guò)程 以質(zhì)粒pSG1729 (從Bacillus Genetic Stock Center獲得)為模板，用上游引物
CATATGAGTAAAGGAGAAG- 3'(帶下劃線(xiàn)的堿基為Asel酶識(shí)別位點(diǎn))和下游引
CCAT -3'(帶下劃線(xiàn)的堿基為BamHI酶識(shí)別位點(diǎn))擴(kuò)增帶有組氨酸標(biāo)記His6的綠 色熒光蛋白基因to-g步，分別引入Asel和BamHI酶識(shí)別位點(diǎn)。
以質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA為模板，用上游引物5' -GCTGTTGGATCCGGTGGT GGTGGCTCAATGAAAATCGAAGAAGGTA- 3'(帶下劃線(xiàn)的堿基為BamHI酶識(shí)別 位點(diǎn))和下游引物5' CCGCTGCCAACCGAATTCTGAAATCCTTCCCTCGATCCCG 3'(帶下劃線(xiàn)的堿基為EcoRI酶識(shí)別位點(diǎn))擴(kuò)增麥芽糖結(jié)合蛋白蛋白基因m^，分 別引入BamHI和EcoRI酶識(shí)別位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50ng模板DNA， 100pmol每種引物，2XTransTaqHigh Fidelity (HiFi) PCR SuperMix II;擴(kuò)增程序?yàn)?5攝氏度變性5分鐘，60。C退火45 秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個(gè)循環(huán)后，72攝氏度延伸IO分鐘結(jié)束反應(yīng)。測(cè)序 表明，/w's-g歩具有SEQ ID Na: 2中5'端第1-735位核苷酸序列；m6/ 具有SEQ ID Na: 2中5'端第781-1881位核苷酸序列。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用Ase I和BamHI雙酶切，m6; 用BamHI和EcoRI 雙酶切后，與pMAL-c2x-HepA經(jīng)Ndel (酶切位點(diǎn)為CATATG) (Ndel與Ase I屬于 同尾酶)和EcoRI雙酶切后的大片斷用T4DNA連接酶連接，得到重組載體，將其轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并通過(guò)序列測(cè)定確認(rèn)(美國(guó)Invitrogen公司)。 將含有三重融合蛋白的編碼基因(如序列表中序列2所示)的重組載體命名為
8phGMH-Ll。其中，她的編碼區(qū)是序列2的自5'端第22-735位的堿基；的編 碼區(qū)是序列2的自5'端第781-1881位的堿基；i/e^4的編碼區(qū)是序列2的自5'端 第1959-3048位的堿基。
二、三重融合蛋白的表達(dá)
1、 誘導(dǎo)表達(dá)
提取步驟一中含有phGMH-Ll的大腸桿菌DH5ct中的質(zhì)粒，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大 腸桿菌TBI和TOPIO，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素篩選和利用步驟一中2提供的引物進(jìn)行菌落 PCR鑒定，得到含有phGMH-Ll的大腸桿菌TBI和TOPIO，即TBl/phGMH-Ll和 TOP10/phGMH-Ll作為表達(dá)GFP-MBP-HepA的工程菌。
以質(zhì)粒pMAL-c2x轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBI和TOPIO，得到空載體對(duì)照TBl/pMAL-c2x 和TOP10/pMAL國(guó)c2x。
以下操作對(duì)上面的工程菌平行進(jìn)行。
將空載體對(duì)照和工程菌分別在LB培養(yǎng)基(含IOO (ig/ml氨芐青霉素)37'C培養(yǎng) 至0D柳約為0. 600附近后，加入終濃度為0. 3 raM IPTG 15。C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)21h。 10000 rpm， 8min離心收集菌體并用20 mmol/L Tris-HC1 (pH 7.4)洗滌兩次，重懸至0D600 約為8. 000附近，取樣40|il做細(xì)胞全蛋白組分SDS—PAGE電泳。將上面OD,約為8. 00 重懸液進(jìn)行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的處理198次)， 12000rpm, 30min取上清液40(il做可溶蛋白組分SDS—PAGE電泳。結(jié)果如圖4所示， 圖4中3個(gè)M均為marker (從上而下分子量依次均為120kDa、 100kDa、 65kDa、 50kDa)， Cl為空載體對(duì)照TOP10/pMAL-c2x全蛋白組分；C2為空載體對(duì)照TBl/pMAL-c2x的 全蛋白組分；Sl、 S2分別為大腸桿菌TBl(phGMHS-Ll)的全蛋白組分和可溶蛋白組分; S3、 S4分別為大腸桿菌TOP10(phGMHS-Ll)的全蛋白組分和可溶蛋白組分。
結(jié)果表明空載體對(duì)照菌株TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x誘導(dǎo)培養(yǎng)后無(wú)熒 光無(wú)酶活，其它工程菌均表達(dá)出了可溶性的GFP-MBP-HepA三重融合蛋白，其中大 腸桿菌TOP10中的表達(dá)效果均要優(yōu)于大腸桿菌TB1。并且經(jīng)過(guò)測(cè)序，TBl/phGMH-Ll、 TOP10/phGMH-Ll表達(dá)出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所示；并且該融合 蛋白的GFP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第8-245位所示；該融合蛋白的MBP 的氨基酸序列如序列1的自氨基端第261-627所示；該融合蛋白的HepA的氨基酸序 列如序列1的自氨基端第654-1016所示。
2、 酶活及熒光強(qiáng)度檢測(cè)分析
粗酶液即為上面步驟中超聲破碎后離心所得的上清液。酶活力(單位為IU/L)的檢測(cè)采用232 nm的光吸收法，1 IU的酶活的定義為3(TC每分鐘產(chǎn)生lpmol不飽和鍵 的反應(yīng)效力。取肝素底物溶液0.5 ml (25 g/L肝素，40 mMNaCl， 3.5 mM CaCl2， 17 mM Tris-HCl， pH7.4)，加入步驟3中所得的粗酶液，其它體積以Tris緩沖液補(bǔ)充，最終 的反應(yīng)液體積為1.5ml，測(cè)單位時(shí)間內(nèi)在232nm的吸光度變化AA232。消光系數(shù)e= 3800 M'1。比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗酶液蛋白濃度(單位為 mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測(cè)采用常規(guī)的Bradford法。熒光強(qiáng)度(單位為U/L)檢測(cè) 采用熒光分光光度計(jì)HITACHI F-2500,激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè)吸收波長(zhǎng)為512nm。比 熒光強(qiáng)度定義為熒光強(qiáng)度與粗酶液蛋白濃度(單位為mg/L)的比值。
LB培養(yǎng)基(含IOO pg/ml氨芐青霉素)中15TH秀導(dǎo)培養(yǎng)工程菌21h后，OD柳、 酶活、熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖5所示，比酶活和比熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖6所示，其中空載體 對(duì)照誘導(dǎo)培養(yǎng)后無(wú)熒光無(wú)酶活未在圖上顯示，重組載體是phGMH-Ll時(shí)，酶活可達(dá)267.8 IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達(dá)1.548 IU/mg蛋白，比熒光強(qiáng)度可達(dá)1.000 IU/mg蛋白。
實(shí)施例2.三重融合蛋白肝素酶酶活的熒光定量追蹤
選取上述大腸桿菌TOP10/phGMH-Ll進(jìn)行了三重融合蛋白肝素酶酶活的熒光定 量追蹤實(shí)驗(yàn)。用含100 pg/ml氨芐青霉素的M9YE培養(yǎng)基(17. 1 g/L Na2HP04 12H20， 3.0 g/L KH2P04， 0.5 g/L NaCl; 1.0 g/L NH4C1， 12. 5 g/L酵母提取物，12 g/L葡萄 糖)對(duì)TOP10/phGMH-Ll進(jìn)行培養(yǎng)，在37。C培養(yǎng)大約3. 5小時(shí)(至OD,為0. 735)后， 加入終濃度為0. 3 mM的IPTG，并將培養(yǎng)溫度改為15。C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。之后每隔2小 時(shí)，取2ml菌液分別測(cè)其細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活和熒光強(qiáng)度(熒光分光 光度計(jì)HITACHI F-2500)，直至誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí)。
肝素酶I的酶活是按照實(shí)施例1步驟二中的步驟2的方法測(cè)定，結(jié)果表明肝素酶 I的酶活隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加。熒光強(qiáng)度的測(cè)定分為兩種方式:方 式1是直接利用菌液測(cè)定熒光強(qiáng)度值，方式2是將菌液離心后用相同體積的20 raM的 Tris緩沖液(pH7.4)重懸，用實(shí)施例1中步驟二中的步驟1的方法超聲破碎后離心 去上清來(lái)測(cè)定熒光強(qiáng)度值。
培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)和熒光強(qiáng)度(RFU) 的變化如圖7所示，最高酶活可達(dá)723. 1IU/L培養(yǎng)基。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)胞濃 度、酶活和熒光量均增加，但由于細(xì)胞散射的影響，方式l所測(cè)得的熒光強(qiáng)度偏小， 且細(xì)胞濃度越大，偏差越大。此時(shí)可通過(guò)方式2來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量熒光量。
為進(jìn)一步研究利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線(xiàn)檢測(cè)，我們研究了酶 活與0D6。。、熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，酶活與細(xì)菌濃度、熒光強(qiáng)度均存在著良好的線(xiàn)性關(guān)系，可以利用熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌濃度以及酶活的 快速定量。上述結(jié)果說(shuō)明在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以快速獲得菌體濃 度和肝素酶I的酶活的變化，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)化和 控制。序列表
<110>清華大學(xué)
〈120〉融合肝素酶及其編碼基因
<130〉 CGGNARL92433
<160> 2
<210> 1
〈211〉 1016
<212> PRT <213>人工序列 〈220〉 〈230〉
〈400〉 1
Met His His His His His His Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
15 10 15
Gly Val Val Pro lie Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His
20 25 30
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
35 40 45
Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
50 55 60
Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg 65 70 75 80
Tyr Pro Asp His Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
85 90 95
Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
100 105 110
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
12Arg
Gly 145 Ala
lie 130 His
Asp
115
Glu Leu Lys Gly
120
Asp Phe Lys Glu
Lys Leu Glu
Lys Gin Lys 165 Gly
Tyr 150 Asn
Ser
lie 135
Asn Tyr Asn Ser
125
Gly Asn lie Leu
Asn lie Glu Asp 180
Gly Asp Gly Pro
Gly lie Lys Val
His 155 Asn
Asp 140
Asn Val Tyr lie
Phe
Thr Pro lie 195
Gin Ser Ala Leu
Ser
Thr 210
Val Leu Leu Glu
Gin
Val 200 Lys
Val 170
Ala Asp His
Leu 185
Leu Ser Pro Asp
Lys Tyr
Met 225
Asp Glu Leu Tyr
Gly Gly Gly Gly
Asn
Glu
Lys 290 Glu
Asp 275 Asp
Ser 260 Lys
Thr
Lys 245 Met
Gly
Gly
Glu 305
lie Phe Trp Ala
Lys Phe Pro Trp
Leu Ala Glu lie 340 Asp
His 325 Thr
Phe 230 Gly
Lys
Tyr
lie
Gin 310 Asp
Ser 215
Val Thr Ala Ala
Gly lie Asn
Gly Glu
Asp Ala Gly
Pro Asn Glu 220 lie
Asn 205 Lys
lie
Gin 190 His
Arg 175 Gin
Tyr Asp
Thr His Gly
Met 160 His
Asn
Leu
Arg Asp His
Gly 235
Gly Gly Gly Gly
Ser 250
Gly Lys Leu
Glu 265
Leu Ala Glu Val
Gly Val
Gly 280
Val Thr Val Glu
Lys 295
Val Ala Ala Thr
His 300 Asp
Gly 285 Pro
lie 270 Lys
Ser 255 Trp
Lys Asp Lys Gly Pro Asp
Phe Thr Trp 355 Val
Arg Phe Gly Asp
Ala Val Arg
Gly 315
Tyr Ala Gin Ser
Pro Asp Lys
Tyr 360
iLeu
Ala 345 Asn
Gly 330
Phe Gin Asp Lys
Gly 335 Tyr
Met 240 Gly
lie
Phe
Leu
lie 320 Leu
Pro
Gly Lys Leu
lie Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu lie Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro
lie 365 Asp
Leu 350
Ala Tyr ProAsn 385 Lys
370 Pro
Ala
Pro Lys Thr
Lys
Phe Thr Trp
Glu Asn Gly 435 Ala
Lys
Gly
375
Glu Glu lie Pro
Lys 405 Leu
Trp 390
Ser Ala Leu Met
Pro 420
Lys Tyr Asp lie
Phe 410 Gly
Ala 395 Asn
380 Leu
Asp Lys Glu Gin
Leu Gin Glu
lie Ala Ala Asp 425
Asp Val Gly Val
Ala
Met 465 Gly
Gly Leu Thr Ala Asp Thr Glu Thr Ala
Lys 450 Asn
Lys 440
Leu Val Asp Leu
Gly Tyr Ala Gly
Phe 楊 Asn
Pro 415 Lys
Ala
Asp 470 Thr
Phe 455
Tyr Ser lie Ala
lie 460
Ala Ala Phe Asn
Asp Thr Ser Gly Gin Ala
Met 485
Val Asn Tyr Gly
Glu 475
Trp Ala Trp Ser
Lys 500
Ser Lys Pro
lie Asn Gly Pro 490
Thr Val Leu Pro
Pro 515
Ser Pro Asn Lys
Tyr Phe
Val 505
Gly Val Leu Ser
Asn 495 Phe
Ala 530
Leu Thr Asp Glu
Val 520
Leu Ala Lys Glu
Leu 545
Gly Ala Val Ala
Glu 535
Leu Glu Ala Val
Gly 550
Lys Ser Tyr Glu
Phe 540 Lys
Asp
Leu 565
Thr Met Glu Asn
Asn 555
Glu Leu Ala
Arg lie Ala Ala 580
Gin Met Ser Ala
Glu 570
Gin Lys Gly Glu
Lys Lys
Asn lie Pro 595
Ala Ala Ser Gly
Ala 585
Trp Tyr Ala Val
lie
Asn 610
Ala Gin Thr Asn Ser Ser
Phe 600
Gin Thr Val Asp
Arg 615
Ser Asn Asn Asn Asn
Leu 400 Tyr
Tyr
Gly
Asp 445
Lys Asn Lys His
■ lie
Lys
Thr 510
Gly lie Asn
Ala 525
Leu Glu Asn Tyr
Pro
Asp 575 Met
Leu 560 Pro
Pro
lie 590
Thr Ala Val
Arg 605
Ala Leu Lys Asp
Glu 620
Asn Asn Asn Asn Asn
14625 Asn
Lys
Lys
Lys
Leu Gly lie
Ser
Gin
Pro 690 Ser
Gly Gly
Asn 660 Glu
Glu 645 lie
630 Gly
Arg Tyr
lie lie Asp
Pro Tyr Arg
lie Ser Glu 650 Asn
635 Phe
Ser 675
Tyr Ala Leu Gin
Val 665 Lys
Gly Ser Gin Gin 655
Val Gin Ala Asp Ser
640 Lys
Ala
Pro Ser Tyr Arg Phe 705
Tyr Ala Ala Gly
Ala Thr Thr Asn 740
Ala Gin Cys Leu 755 Ser
Glu 725 Asp
Glu 710 Thr
Phe
Tyr 695 Leu
Lys
Lys
Asn 680
Asp Asp Lys Leu
Trp Val Ala Lys
Asp 670
Gly lie Asn
Val 685
Phe Asn Gly Lys
Lys Ala Glu Gly Arg Lys
Arg 700
Asn Ser Leu Glu
Asp 715
Glu Leu Ser Tyr
Gin
Ser Arg Ser
Gly 770
Pro Asp Asn Ala
Lys Thr Val Arg
Phe 745 His
lie 730
Pro Pro Ser Val
Ser 735 Gin
Gly 720 Tyr
Asn
Tyr His Tyr Gly Lys 760
Thr Phe Ser Val
Phe 785
Ser Arg Thr Leu
lie Glu Glu Phe 820
lie Ala His Asp 835 Ala
Tyr 775 Thr
Tyr 750
lie Cys Glu
Gly 765
lie Pro Ser Ser
Thr 790
Ala Thr Pro Glu
Tyr
Pro 865 Asn
Val 850
Pro Leu Ala Phe
Val 805
Leu Ala Leu Tyr
Lys Val Glu Lys 840
Gly Lys Pro Asn Gly
lie Phe Ala Gin 795 Glu
Tyr 780
Trp His Gly Ala
Asp 825 ILys
Gly 810
Arg Met lie Phe
lie Lys Thr Leu 815 Lys
Pro ■ Ser
Asn
Trp Lys
Ser Asp Arg Gin Trp Leu Thr Asp
Gly 870 Trp
Asn 855 Phe
Ser
Asp Lys Gly Lys
Lys Val
Asp
Glu 860 Phe
Gly 845 Gin
Lys 830
Lys lie Thr Gly Gly Tyr
Gly Lys
Tyr Phe Tyr lie 875
Ala Asp Arg Asn Asn
Ala 880 Ala885 890 895
Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys
900 905 910
Thr Ser Thr lie Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gin Phe Pro Lys Asp
915 920 925
Cys Trp lie Thr Phe Asp Val Ala lie Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys
930 935 940
Glu Ala Asn Thr lie Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr 945 950 955 960
Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gin Lys Ala His lie Val Asn Gin Gin
965 970 975
Glu lie Leu lie Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe
980 985 990
Gly lie Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu
995 1000 1005
Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg 1010 1015
〈210〉 2
〈211〉 3054
〈212〉 DNA <213>人工序列 <220> <230>
〈400〉 2
atgcaccacceiccaccaccEicatggigtaaei
attcttgttgaattagatggtgacgttaat
g肌ggtgatgcaacatacggaaaac 11 ac c
cctgttccatggccaacacttgtcactact
tacccagatcatatga肌cagcatgacttt
caggaaagaactatatttttcaaagatgac
ggagaagaac ttttcactggagttgtccca60
gggcacaaat tttctgtcagtggagagggt120
cttaaattta tttgcactactggaaaacta180
ctgacttatg gtgttcaatgcttttcaaga240
ttcaagagtg ccatgcccgaaggttatgta300
gggaactaca agacacgtgctg犯gtceiag360atacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagat420
ggaaacattcttggax:3caaattggaatacaactataactcacacaatgtatacattatg480
gcagacaaaceiatcaaagttaac 11 c aaaacattgaagat540
gg肌gcgttcaeictagc3gaccattatcaac aaaat ac t ccaattggcgatggccctgtc600
ctttcaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaa660
aagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatg720
gatgaactatac肌aggtggcggtggctcgggtggcggtggatccggtggtggtggctca780
3tgaa朋tcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggt840
ctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaatta肌gtcaccgttgagcat900
ccggata犯ctgg朋g卿eiattcccacaggttgcggc肌ctggcgatggccctgacatt960
atcttctgggC3C3cga_ccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaal:c1020
3CCCCgg3C3aagcgttccaggac肪gctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttac1080
aacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttg犯gcgttatcgctgat1140
gatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactg腦
gta卿gcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccg1260
ctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatg肌aacggcaagtacgacattaaa1320
gscgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgatt1380
acatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcc11 taataaa1440
ggcga認(rèn)agcgatgaccatca^cggcccgtgggcatggtccaacatcgaC3ccagcaaa1500
gtgaattatggtgt認(rèn)ggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgtt1560
ggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgcc3gtccga3C33卿gCtggCaaaagagttc1620
ctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaMaaagacaaaccgctg1680
ggtgccgtagcgctgaagtcttacg3ggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgcc1740
actatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttc1800
tggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatga^1,
gccctgaaagacgcgcag8ict犯ttcgagctcgaacaacacaataacaac簡(jiǎn)
犯cctcgggstcgsggg犯ggatttcagaattcggatccc3tccggtaac畫(huà)
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aaatgggtggcagtaggcatc aat aaac c ttatgcattacaatatgacgataaactgcgc2100
tttaatggaaaaccatcctatcgctttgagctta犯gccgaagacaattcgcttgaaggt2160
t3tgCtgC3ggagaaacaaagggccgtatagaattgtcgtacagctatgcaaccaccaat2220
gattttaagaaatttcccccaagcgtataccaaaatgcgc^aagcta^L肌ccgtttat2280cattacggceiaagggatttgtgaacaggggagctcccgcagctataccttttcagtgtac2340
ataccctcctccttccccgacaatgcga_ctactatttttgcccaatggcatggtgcaccc2400
6tgC3gaElCgCttgtagctacaccagagggagaaattaaaacactgagcatagaagagttt2460
ttggccttatacgaccgcatga_tcttcaaaaaaaatatcgcccatg3ta_aagttgaaaaa2520
aaagataaggacggaaaaattacttatgtagccgga^gcca^3tggctggaaggtagaa2580
caaggtggttatccaccgctggcctttggtttttctaaagggtatttttacatcaaggca2640
肌ctccgaccggcagtggcttaccgscaaagccgaccgtaEicaatgccaatcccgsgaat2700
a_gtga_agtaatgaagccctattcctcggaactaccattgcctataaaatg2760
ccctttgcccagttccctaa柳ttgctggattacttttgatgtcgccatagactggeicg2820
aagaggccaatacaattttgaaacccggta3gCtgg3tgtgatgatgeict2880
taitaccaag3ataagaeiacccatatcgtaaaccagcaggaaatcctgatc2940
ggacgt認(rèn)gatgacgatggctattacttcaaatttggaatttacagggtcggt犯cagc3000
acggtcccggttacttataacctgagcgggtacagcgaaaCtgCC3g3t3gtaa3054
18
權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能融合肝素酶，其特征在于所述b)的蛋白的氨 基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3、 權(quán)利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的序列是如下l)或2) 或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；2) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼權(quán)利要求1或2所述 蛋白的核苷酸序列；3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1 或2所述蛋白的核苷酸序列。
5、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是通過(guò)以下步 驟構(gòu)建的-將序列表中序列2的第1位-1881位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1959-3048位所示的肝素酶I的編碼 基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到的重組質(zhì)粒。
7、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組菌。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求5 或6所述的重組載體的重組大腸桿菌。
9、 一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將權(quán)利要求7或8所述的重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá) 得到肝素酶。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是0.3-lmM的 IPTG， 10-30。C誘導(dǎo)培養(yǎng)5-30小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種融合肝素酶。該融合肝素酶是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)生的三重融合蛋白的酶活通過(guò)搖瓶培養(yǎng)可達(dá)723.1IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達(dá)1.548IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線(xiàn)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101608179SQ20091009016
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者葉逢春, 翀 張, 蔣培霞, 邢新會(huì) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)