專利名稱：從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的昆蟲(chóng)種類鑒定技術(shù)多以成蟲(chóng)的形態(tài)特征為依據(jù)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)
非成蟲(chóng)態(tài)如卵、幼蟲(chóng)和蛹的鑒定，同時(shí)難以區(qū)分具有細(xì)微差異的近似種。自20世 紀(jì)90年代以來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者已對(duì)多種昆蟲(chóng) 進(jìn)行了分子鑒定方面的探索。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)進(jìn)行昆蟲(chóng)鑒定研究時(shí)，基因序列 的信息代表了遺傳本質(zhì)，不受標(biāo)本個(gè)體發(fā)育狀態(tài)和環(huán)境條件影響，能夠提供充分的 可定量測(cè)度的遺傳學(xué)信息。因此，從分子水平上對(duì)書(shū)虱進(jìn)行種類鑒定是一種高效、 便捷的方法，尤其是DNA基因序列分析技術(shù)的研究與應(yīng)用，為昆蟲(chóng)分子鑒定揭開(kāi)了 新的篇章。
世界常見(jiàn)的倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱種類包括嗜巻書(shū)虱厶6oW/rc力o/ 力i7aBadonnel、嗜蟲(chóng)書(shū) 風(fēng)厶 e/ fo/z7op力i7a (Enderlein)、無(wú)色書(shū)風(fēng)Z. Gfeco/or (Pearman)、小目艮書(shū) 虱厶 ； ae力a Pearman、 嚙書(shū)虱厶 corroofe/ 51 (Heymons)、 暗褐書(shū)虱厶力2-〃朋ea Motschulsky以及虛偽書(shū)虱L /z e/^ax Pearman。其中，僅嚙書(shū)虱在我國(guó)尚未見(jiàn)發(fā) 生報(bào)道，且與嗜巻書(shū)虱的形態(tài)特征極其近似。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)及其應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì),其核苷酸序列分別為序列
表中的序列1和序列2。
含有權(quán)利要求1所述的引物對(duì)的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法。 本發(fā)明所提供的從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法，是以待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱的基因組
DNA為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增
產(chǎn)物大小為250-500bp，待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱為嚙書(shū)虱。
其中，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或聚丙烯酰胺凝
膠電泳檢測(cè)。如果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率低，PCR產(chǎn)物大小 在250-500bp之間。
本發(fā)明解決了長(zhǎng)期以來(lái)困擾口岸檢疫和糧食儲(chǔ)藏部門(mén)的書(shū)虱種類鑒定問(wèn)題。由 于書(shū)虱個(gè)體微小(約lmm)、玻片標(biāo)本形態(tài)特征把握較為困難、國(guó)內(nèi)外書(shū)虱形態(tài)鑒 定專家屈指可數(shù)、鑒定所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因，使書(shū)虱形態(tài)鑒定存在較大困難。本發(fā) 明利用DNA基因序列分析技術(shù)，在所構(gòu)建的7種世界常見(jiàn)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱16S rDNA基因 序列信息庫(kù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)、篩選了用于從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的特異引物，建 立了一套從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法，實(shí)現(xiàn)了從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中快速準(zhǔn)確鑒別嚙書(shū) 虱，將嚙書(shū)虱與其余世界常見(jiàn)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱種類區(qū)別開(kāi)來(lái)，具有省時(shí)、高效、直觀等特 點(diǎn)。本發(fā)明的從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法可在檢驗(yàn)檢疫部門(mén)和糧食儲(chǔ)藏部門(mén)廣 泛使用。


圖1為凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明，所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途 徑獲得。
實(shí)施例1、利用特異引物通過(guò)PCR從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱鑒別嚙書(shū)虱 (1)書(shū)虱基因組DNA的提取
采用CTAB法分別提取不同地理種群的單頭書(shū)虱的基因組DNA，包括釆自捷克和 美國(guó)的嚙書(shū)虱、采自中國(guó)、捷克、美國(guó)的嗜巻書(shū)虱、采自中國(guó)、捷克的嗜蟲(chóng)書(shū)虱、 采自中國(guó)、捷克、美國(guó)的小眼書(shū)虱、采自中國(guó)、捷克、美國(guó)的無(wú)色書(shū)虱、采自捷克、 美國(guó)的暗褐書(shū)虱以及采自中國(guó)的虛偽書(shū)虱。上述書(shū)虱的種類均經(jīng)形態(tài)特征確證。
取待檢書(shū)虱單頭用無(wú)水乙醇?xì)⑺篮?，用雙蒸水清洗晾干(勿干透)，放入1.5mL 無(wú)菌離心管中，加入50pl提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HC1， pH 7. 0， 1. 4 mol/L NaCl， 20mmol/L EDTA， 2g/100ml CTAB)研勻；加入lpl蛋白酶K(20 mg/mL)，置 于60°C水浴鍋中保溫1 h，其間上下混勻3次；加入125pl苯酚氯仿異戊醇 (25 : 24 : 1)混勻5 min，放入離心機(jī)中，10000 r/min離心15 min后取上清液； 加入2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的3 mol/L醋酸銨(pH 7. 0)，混勻后置 于-20°C 8 h以上。14000 r/min離心10 min，用100^1 70%乙醇洗滌1次，37°C 干燥后，加入滅菌水lO)il室溫下溶解DNA。然后置于-2(TC保存待用。
4(2) PCR擴(kuò)增
利用16S rDNA基因片段通用引物16Sar 5， GCCTGTTTAACAAAAACAT3， ， 16Sbr 5' CCGGTCTGAACTCAGATCACGT3， 擴(kuò)增上述書(shū)虱16S rDNA基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 送公司雙向測(cè)序(北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。測(cè)序結(jié)果用DNAman比對(duì)分 析后，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)嚙書(shū)虱的特異引物。
針對(duì)嚙書(shū)虱的特異引物如下
上游引物5' AAGTTTCATTTTCTMTTTCCCCAAT 3'(序列表中的序列1);
下游引物5' TCAAGTCGMTCTGCCCACT 3'(序列表中的序列2)。
以(1)提取的書(shū)虱基因組DNA為模板，用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系總體積為20叱10叱2XTaq PCR Master Mix (天根生化科技(北
京)有限公司);艦ddH20; 0. 5ML上游引物，0. 5叱下游引物，引物濃度分別為訓(xùn);
l叱模板DNA。
PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C 3 min， 94°C 30 sec， 52°C 30 sec， 72°C30 sec， 30個(gè)循環(huán)；72。C 10 min。
取5Mi PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠1XTAE緩沖液中電泳，溴化乙錠(EB)染色， 在凝膠成像系統(tǒng)(Syngene G-box)中觀察并成像分析。
分析結(jié)果如圖1所示，表明采自兩個(gè)國(guó)家的嚙書(shū)虱的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 250-500bp。其它倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱均未得到PCR產(chǎn)物。圖1中，M: DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 采自捷克的嚙書(shū)虱；2:采自美國(guó)的嚙書(shū)虱；3:采自中國(guó)的嗜巻書(shū)虱；4:采自捷 克的嗜巻書(shū)虱；5:采自美國(guó)的嗜巻書(shū)虱；6:采自中國(guó)的小眼書(shū)虱；7:采自捷克 的小眼書(shū)虱；8:采自美國(guó)的小眼書(shū)虱；9:采自中國(guó)的無(wú)色書(shū)虱；10:采自捷克的 無(wú)色書(shū)虱ll:采自美國(guó)的無(wú)色書(shū)虱12:采自中國(guó)的嗜蟲(chóng)書(shū)虱；13:采自捷克的嗜 蟲(chóng)書(shū)虱；14:采自捷克的暗褐書(shū)虱；15:采自美國(guó)的暗褐書(shū)虱16:采自中國(guó)的虛 偽書(shū)虱；17:對(duì)照，水。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，用本發(fā)明的特異引物可以從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱。序列表
〈160〉 2
<210> 1 〈211〉 26 <212> DNA 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400〉 1
aagtttcatt ttctaatttc cccaat 26
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 2
tcaagtcgaa tctgcccact 20
權(quán)利要求
1、從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)，其核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2。
2、 一種從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
3、 一種從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法，是以待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱的基因組DNA為模 板，用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為250-500bp，待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱為嚙書(shū)虱。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱為嗜巻書(shū)虱、 嗜蟲(chóng)書(shū)虱、無(wú)色書(shū)虱、小眼書(shū)虱、嚙書(shū)虱、暗褐書(shū)虱或虛偽書(shū)虱。
6、 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)及其應(yīng)用。從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的引物對(duì)，其核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2。本發(fā)明還公開(kāi)了利用該引物對(duì)從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法。該方法是以待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱的基因組DNA為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為250-500bp，待測(cè)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱為嚙書(shū)虱。本發(fā)明的從倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱中鑒別嚙書(shū)虱的方法實(shí)現(xiàn)了嚙書(shū)虱的快速準(zhǔn)確鑒定，將嚙書(shū)虱與其余世界常見(jiàn)倉(cāng)儲(chǔ)書(shū)虱種類區(qū)別開(kāi)來(lái)，具有省時(shí)、高效、直觀等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法可在檢驗(yàn)檢疫部門(mén)和糧食儲(chǔ)藏部門(mén)廣泛使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101608238SQ200910090168
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者李志紅, 朔 趙 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)