專利名稱：與植物耐逆性相關(guān)蛋白ZmPMP3及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白ZmPMP3及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、鹽漬、低溫、氧脅迫等許多非生物脅迫嚴(yán)重的威脅了作物的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致環(huán)境的不斷惡化。在世界范圍內(nèi)，非生物逆境都是造成作物減產(chǎn)的主要原因，每年平均占據(jù)作物減產(chǎn)的50%。非生物逆境脅迫通過(guò)對(duì)植物產(chǎn)生一系列的形態(tài)學(xué)，生理生化狀態(tài)及分子水平的影響，從而影響的植物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。植物作為一個(gè)復(fù)雜的生物系統(tǒng)，在應(yīng)答非生物脅迫時(shí)，往往產(chǎn)生一系列生化分子和基因水平的變化。植物體內(nèi)聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)胞膜，能夠直接感知來(lái)自于細(xì)胞外部的物理化學(xué)信號(hào)，于此同時(shí)，做為細(xì)胞與外界相連的介質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到外界脅迫時(shí)，往往也對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的破壞。近年來(lái)的研究揭示，細(xì)胞膜的蛋白組分和膜結(jié)構(gòu)在外界脅迫條件下發(fā)生了變化，以防御外來(lái)脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害。因此認(rèn)為，一些脅迫相關(guān)的膜蛋白在感知外界信號(hào)，保護(hù)和修復(fù)細(xì)胞膜方面起到一定的作用。iS^jft,(Arabidopsis thaliana), /Jn^ (Triticum aestivum), /Jcfg (Oryza sativa L·)，大麥(hordeum vulgure)，長(zhǎng) 燕麥(fophopyrum elongatum)，山羊草(Aneurolepidium chinense)，星星草(Puccinellia tenuiflora)等植物中分別克隆得到了編碼與酵母(Saccharomyces cerevisiae)Pmp3p—致性較高的膜蛋白基因。這些基因受到干旱，冷，和鹽脅迫誘導(dǎo)，編碼一類低分子量的膜蛋白。酵母(Saccharomyces cerevisiae)Pmp3p是一種含有55個(gè)氨基酸的酸性疏水蛋白。缺失了 PMP3的酵母突變體與野生型對(duì)照相比，增強(qiáng)了對(duì)鈉離子和潮霉素B的敏感性，同時(shí)也抑制了 Trklp和Trk2p突變體菌株生長(zhǎng)對(duì)鉀離子的依賴性。Navarre和Goffeau認(rèn)為Pmp3p作為一種質(zhì)膜蛋白起到維持細(xì)胞膜電勢(shì)，保證細(xì)胞內(nèi)外的離子動(dòng)態(tài)平衡的作用。由于MPM3蛋白是一種普遍存在的低分子量跨膜蛋白，且與 Escherichia coli 的 P77M0，線蟲(Caenorhabditis elegans)中的 P;34655、Q20516、Q22702、Q22701、Q22700，以及與植物中一些脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因編碼的蛋白具有極高的同源性。目前還未從玉米中發(fā)現(xiàn)類似的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白ZmPMP3及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為ZmPMP3，人工合成，是如下1)或2)或3)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列2或序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或保水力相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中序列2或序列4均由58個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述與植物耐逆性相關(guān)的蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)樗鼍幋a基因?yàn)槿缦?)-8)中任一所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第87位-283位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列3所示的DNA分子；5)序列表中序列3自5，末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列3自5’末端第88位-283位核苷酸所示的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性和/或保水力相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子；8)與1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有 75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與所述植物耐逆性和/或保水力相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，序列表中序列1由389位脫氧核糖核苷酸組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為自 5'末端第88位-264位堿基。序列表中序列4由389位脫氧核糖核苷酸組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為自5'末端第88位-264位堿基。所述嚴(yán)格條件也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC,0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體具體可為在pCAMBIA3301的Nco I和BstE II位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的pCAMBIA3301-ZmPMP3。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供培育耐逆性和/或保水力提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的方法，是將所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性和/或保水力高于所述目的植物。所述轉(zhuǎn)基因植物的保水力高于所述目的植物為所述轉(zhuǎn)基因植物的離體葉片保水率高于所述目的植物；所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。 所述編碼基因是通過(guò)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為擬南芥。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用克隆的方法得到ZmPMP3基因，將其導(dǎo)入擬南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐逆性和/或保水率高于野生型擬南芥，耐逆性表現(xiàn)在耐旱性和/或耐鹽性，保水率主要是葉片的保水率高于野生型擬南芥。本實(shí)驗(yàn)得到的ZmPMP3基因和轉(zhuǎn)基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的意義。


圖1為ZmPMP3基因在酵母突變體中的過(guò)表達(dá)圖2為ZmPMP3亞細(xì)胞定位。圖3為ZmPMP3的PCR擴(kuò)增 4 為 pCAMBIA3301-ZmPMP3 的酶切鑒定圖。圖 5 為農(nóng)桿菌 GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3 的 PCR 鑒定圖。圖6為SDS法小提轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組。圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組PCR檢測(cè)bar基因結(jié)果。圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組PCR檢測(cè)ZmPMP3基因結(jié)果。圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的萌發(fā)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖10為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的系的生物重統(tǒng)計(jì)圖11為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的株系的生物重圖12為完成全生育期擬南芥株數(shù)統(tǒng)計(jì)13為300mM NaCl處理前的擬南芥圖14為300mM NaCl處理兩天后的擬南芥圖15為300mM NaCl處理兩周后，在對(duì)照組和300mM NaCl處理下的ck和株系6圖16為離體葉片保水率統(tǒng)計(jì)圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、ZmPMP3的獲得及其功能的研究一、ZmPMP3 的獲得各種耗材、酶及試劑限制性內(nèi)切酶(NEB)、T4連接酶(ftOmega)購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司； 大腸桿菌感受態(tài)T0P10、卡那霉素、taq酶、2XPfu PCR Master Mix購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；DNA marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PEG3000 (polyethylene glycol，聚乙二醇)、carrier DNA、YPD培養(yǎng)基、LiAc緩沖液、TE緩沖液購(gòu)于泛基諾(北京)生物技術(shù)有限公司；Aureobasidin A (TaKaRa)、pAURl23 載體(TaKaRa)、pMD18_T 質(zhì)粒 (TaKaRa)購(gòu)于六合通(北京)生物科技有限公司；腺嘌呤、葡萄糖、dNTP mix購(gòu)于鼎國(guó)生物有限責(zé)任公司。載體及酵母菌株YR93-31 M tt (Mayumi Inada, Akihiro Ueda, Weiming Shi, Tetsuko Takabe(2005). A stress-inducible plasma membrane protein 3(AcPMP3)in a monocotyledonous halophyte, Aneurolepidium chinense, regulates cellular Na+and K+accumulation under salt stress. Planta 220 :395_402，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)是不含有酵母PMP3基因的突變體。YR93-1 M tt (Mayumi Inada, Akihiro Ueda, Weiming Shi, Tetsuko Takabe. (2005)A stress-inducible plasma membrane protein 3(AcPMP3)in a monocotyledonous halophyte, Aneurolepidium chinense, regulates cellular Na+and K+accumulation under salt stress. Planta 220 :395_402，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)是含有酵母PMP3基因的菌株，以該菌株作為對(duì)照。亞細(xì)胞定位用瞬時(shí)表達(dá)載體pBI221-GFP(Ying Fu, Ying Gu, Zhiliang Zheng, Geoffrey ffasteneys,Zhenbiao Yang. (2005)Arabidopsis Interdigitating Cell Growth Requires Two Antagonistic Pathways with Opposing Action on Cell Morphogenesis. Cell, Vol. 120，687-700，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)。含有酶切位點(diǎn)引物序列構(gòu)建pBI221-GFP亞細(xì)胞定位載體引物GFP-F 5、-TATCTAGAATGTCGGAGGGGACTGCCAACTGCG-3、GFP-R5、-ATGCCGCGGTAGTTGTTCTTGGTGATGGCGTAG-3、構(gòu)建pAUR123表達(dá)載體引物Ml-PAUR-Fl 5' -TGGGGTACCAAGAAGCATCGGCAGCAT-3‘Ml-PAUR-Rl 5' -TATGAGCTCACGCAGATACAGAGACAT-3‘YPDA 液體培養(yǎng)基(IOOml)YPD 培養(yǎng)基0. 8g0.2% 腺嘌呤1.5ml加ddH20至95ml，調(diào)pH至6. 5，高壓滅菌加入5ml滅菌的40%葡萄糖。YPDA固體培養(yǎng)基(IOOml)同YPDA液體培養(yǎng)基，只是需加入2g瓊脂，再高壓滅菌。AbA 為抗生素 Aureobasidin A 的縮寫主要儀器基因槍系統(tǒng)(Bio-rad)、真空旋轉(zhuǎn)干燥儀(concentrator 5301，印pendorf)、恒溫培養(yǎng)箱、激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP2 confocal laser scanning system)、顯微鏡 (OLYMPUS, BH-2)。l、ZmPMP3 的獲得提取玉米(Zea mays L.)骨干自交系CN165 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王天宇研究院創(chuàng)制)的cDNA，用Ml-full-F/Ml-full-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到389bp的片段，將該片段連接到 PMD18-T (TaKaRa)上，得到 pMD18-T/ZmPMP3_l。也可人工合成序列1，用Ml-full-F/Ml-full-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將該片段連接到 pMD18-T (TaKaRa)上，同樣得到 pMD18-T/ZmPMP3_l。Ml-full-F :5~-AGCGAAAGGAGAGAAGGAATC-3、Ml-full-R 5~-CATGGGGTGGGTACGGTAG-3"以 pMD18-T/ZmPMP3-l 為模板，用 Ml-full-F和 Ml-full-R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到約389bp的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1 自5 ‘末端第1-389位核苷酸，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為ZmPMP3，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列1的自5 ‘末端第88-264位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為ZmPMP3，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。序列1由389個(gè)核苷酸組成，序列2由58個(gè)氨基酸組成。2、酵母遺傳轉(zhuǎn)化A 酵母表達(dá)載體的獲得將上述1得到的pMD18-T/ZmPMP3_l用Kpn I和I進(jìn)行雙酶切，得到的片段與經(jīng)過(guò)同樣酶切得到的PAUR123載體片段連接，得到連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)ToplO 中，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1自5 ‘末端第1-389位核苷酸插入到pAUR123載體的Kpn I和Mc I酶切位點(diǎn)得到的載體，命名為 pAUR123-ZmPMP3，pAUR123-ZmPMP3中ZmPMP3的編碼區(qū)DNA片段位于啟動(dòng)子PADHl下游，該重組載體為酵母過(guò)表達(dá)載體。具體如下1)擴(kuò)增ZmPMP3的編碼區(qū)DNA，弓丨入酶切位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1)pMD18-T/ZmPMP3-l0.85 μ 1Ml-PAUR-Fl2· 5 μ 1 (10 μ Μ)Ml-PAUR-Rl2· 5 μ 1 (10 μ Μ)2 X Pfu PCR Master Mix25 μ 1ddH2019. 15 μ 1PCR 擴(kuò)增程序94°C IOmin94°C 30sec56°C 30sec72 °C Imin72 °C IOmin4°C保溫，；35個(gè)循環(huán)。電泳檢測(cè)目的條帶后純化回收。2)pAUR123-ZmPMP3-l 重組載體50 μ 1體系分步酶切步驟1)純化后 PCR 產(chǎn)物(50ng/ μ 1) 25 μ 1Bufferl5μ 1ddH2017. 5μ 1Kpn I1 μ 1Sac I1 μ 1BSA0. 5μ 130°C水浴酶切池；跑瓊脂糖凝膠，切膠回收，得到酶切DNA片段。pAUR123 載體酶切50 μ 1體系(同時(shí)酶切三管)分步酶切質(zhì)粒(lOOng/μΙ)30 μ 1Bufferl5μ 1Kpn I1 μ 1
Sac I1 μ 1BSA0. 5μ 1ddH2012. 5μ 137°C水浴酶切池，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收載體大片段。將酶切后DNA片段與酶切后載體大片段連接10 μ 1 體系:載體 QOng/μ 1)1μ 1片段(50ng/yl)7μ 1Τ4 Buffer1 μ 1Τ4 連接酶Ιμ 16°C空氣浴12h;轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)ToplO，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，得到 pAUR123-ZmPMP3。質(zhì)粒提取質(zhì)粒小提試劑盒(天根公司)(1)接種單菌落白斑于5ml含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(2)柱平衡步驟將吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500μ1平衡液， 12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(注使用當(dāng)天處理的吸附柱)(3)將菌液轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，12000rpm離心30sec，盡可能除凈上清，收集菌體。加入250 μ 1溶液P1，重懸菌體。(注此步一定要徹底懸開(kāi)，否則會(huì)影響菌體的裂解， 導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低)(4)加入250 μ 1溶液Ρ2，上下輕輕翻轉(zhuǎn)混合4 6次，使菌體充分裂解，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮，如未變清亮，則說(shuō)明菌體過(guò)多，未裂解充分。(注混合時(shí)不要?jiǎng)×?，以免打斷大腸桿菌基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有大腸桿菌基因組DNA)(5)加入350 μ 1溶液Ρ3，立即上下輕輕翻轉(zhuǎn)混合6 8次，此時(shí)應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心lOmin，離心管底部形成沉淀。(6)取上清于柱平衡處理過(guò)的吸附柱中，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，此步可多次收集。(7)在吸附柱中加入700μ 1漂洗液，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。(8)在吸附柱中加入500μ 1漂洗液，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。(9)將吸附柱放回收集管，12000rpm離心2min，以盡量除去漂洗液。(10)室溫放置數(shù)分鐘，盡可能除去殘留的漂洗液。(11)取出吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜中間部位不少于50μ1 65 70°C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置2min，12000rpm離心lmin。(12)為了獲得更多的純化產(chǎn)物，將(11)中離心得到的溶液再重新加入吸附柱， 12000rpm 離心 lmin。(1 取1 μ 1質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)DNA marker初步判定其質(zhì)量和濃度B、酵母遺傳轉(zhuǎn)化(1)挑取YR93-31酵母菌斑于IOmlYPDA液體培養(yǎng)基中，30°C 220rpm過(guò)夜培養(yǎng)。
(2)取適量于50ml液體培養(yǎng)基中，30°C 220rpm培養(yǎng)至0D600為0. 4。(3) 25°C 下，IOOOrpm 離心 5min 收集菌。(4)棄上清，用IOml無(wú)菌水重懸菌體。(5)25°C 下，IOOOrpm 離心 5min，棄上清，用 Iml IXTE 重懸菌體。(6) 300C 200rpm 搖菌 30min。(7)每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備2 μ g得到的pAUR123-ZmPMP3重組質(zhì)粒，處理的carrier DNA 10μ 1于1. 5ml離心管中。注carrier DNA用前處理沸水煮lOmin，冰上Imin ；再沸水煮lOmin，冰上lmin。(8)從(6)中取 200 μ 1 T (7)中。(9)每個(gè)反應(yīng)加入600 μ 1 PEG溶液。(10)30°C 200rpm搖菌30min后，加入70μ 1 DMSO輕輕顛倒混勻，勿渦漩。(11)42°C熱擊 15min，冰上 lmin。(12) 12000rpm離心30sec，收集菌體于管底。(13)用 0. 5ml IXTE 重懸菌體。(14)取200 μ 1涂布于YPDA (AbA抗性)固體培養(yǎng)基。(15)酵母平板30°C倒置培養(yǎng)3天。得到轉(zhuǎn)化子即為陽(yáng)性克隆，命名為YR93-31/pAUR123-ZmPMP3。3、ZmPMP3_l基因在酵母突變體中的過(guò)表達(dá)(1)挑取YR93-31/pAUR123-ZmPMP3單克隆于AbA抗性YPDA液體培養(yǎng)基中搖菌48hr至飽和。(2)按1 100轉(zhuǎn)接以上菌液一次后，搖菌36hr，此時(shí)OD6tltl約為1.0，稀釋菌液至 OD600 = 0 . 30 ( 3)將稀釋好的菌液分別再稀釋10倍、500倍、1000倍，并取此稀釋好的菌液 6 μ 1,分別接種于含有NaCl和 AbA 的 YPDA 固體培養(yǎng)基(YPDA+25mM NaCl+0. 5 μ g/L AbA) 和含有AbA的YPDA固體培養(yǎng)基(YPDA+0. 5 μ g/L AbA)中，30°C倒置培養(yǎng)48小時(shí)，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。采用同樣的方法將水稻同源基因0sLti6a轉(zhuǎn)入菌株YR93-31中得到重組菌 YR93-31/pAUR123-0sLti6a,已經(jīng)有研究證明0sLti6a能夠互補(bǔ)菌株YR93-31的功能，將重組菌YR93-31/pAUR123-0sLti6a作為陽(yáng)性對(duì)照，用于比較衡量ZmPMP3_l基因?qū)湍竿蛔凅w的功能的補(bǔ)充程度。以YR93-1 (未發(fā)生pmp3基因缺失突變的菌株)為對(duì)照菌株1，接種在不含AbA抗性的YPDA培養(yǎng)基(YR93-1不能生長(zhǎng)在含AbA抗性的YPDA培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的YR93-31菌株能夠生長(zhǎng)在含AbA抗性的YPDA培養(yǎng)基中)和含有NaCl的YPDA固體培養(yǎng)基(YPDA+25mM NaCl)中。以YR93-31作為對(duì)照菌株2，分別接種于含有NaCl和AbA的YPDA固體培養(yǎng)基 (YPDA+25mM NaCl+0. 5 μ g/L AbA)和含有 AbA 的 YPDA 固體培養(yǎng)基(YPDA+0. 5 μ g/L AbA)中。結(jié)果如圖1 所示，圖中為 YR93-1、YR93-31、YR93-31/pAUR123_0sLti6a(pAUR123-0sLti6b)、YR93-31/pAUR123-ZmPMP3(pAUR123-ZmPMP3-l)菌株在 YPDA 及 25mM NaCl+YPDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況；從左至右分別為稀釋1000、500、10和1倍的菌液。從圖中看出，在對(duì)照培養(yǎng)基(YPDA)中，四種菌株長(zhǎng)勢(shì)基本一致，YR93-31的長(zhǎng)勢(shì)似乎還要強(qiáng)于其他菌株；而在25mM NaCl處理下，四種菌株的長(zhǎng)勢(shì)均減弱，但YR93-31菌株的長(zhǎng)勢(shì)均低于其他3個(gè)菌株，因此，推測(cè)ZmPMP3-l基因可能與細(xì)胞內(nèi)的Na+代謝相關(guān)。3、洋蔥表皮中亞細(xì)胞定位1)、亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pBI221-ZmPMP3_GFP的獲得pBI221-GFP載體酶切采用)(ba I和&ic II雙酶切pBI221_GFP載體，得到酶切后 BI221-GFP 載體。30 μ 1體系酶切目的片段pMD18-T/ZmPMP3-l(300ng/μ 1)2 μ 1Buffer33μ 1BSA0. 3μ 1ddH2022. 7 μ 1Xba I1 μ 1Sac II1 μ 1370C 2hr ；跑1 %瓊脂糖凝膠，跑的時(shí)間要盡量長(zhǎng)些，切膠回收，得到酶切后片段。酶切后片段與酶切后的pBI221-GFP連接10 μ 1 體系:酶切后 pBI221-GFPQ0ng/y 1)0. 8 μ 1酶切后片段(IOOng/ μ 1)7. 2μ 1Buffer1 μ 1Τ4 連接酶Ιμ 16°C 12hr ；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)ToplO，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1自5 ‘末端第1-177位核苷酸插入到pBI221-GFP載體的 Xba I 和 Sac II 切位點(diǎn)得到的載體，命名為 pBI221-ZmPMP3_GFP。pBI221-ZmPMP3_GFP 中ZmPMP3的編碼區(qū)位于啟動(dòng)子CaMV35S下游。洋蔥材料的準(zhǔn)備在超凈工作臺(tái)中，將洋蔥剝?nèi)ネ獗砥ぶ?，切取第三、四層的鱗莖成約如m2的方塊，輕輕剝下表皮，使內(nèi)表皮與MS固體培養(yǎng)基貼緊，盡可能較少氣泡，培養(yǎng)皿用ParafilmH 口備用。手提式基因槍子彈制作(1)準(zhǔn)備Iml, 200 μ 1,20μ 1移液槍，無(wú)水乙醇一瓶，timer,記號(hào)筆，紙巾。(2)稱20mg(0. 02g) PVP放入一干燥潔凈的1. 5ml離心管內(nèi)，加入Iml無(wú)水乙醇，使其溶解，濃度為20mg/ml的母液。(3)吸出12. 5μ 1母液，稀釋至5ml，使其終濃度為0. 05mg/ml。(4)稱2. mg 1 μ M金粉，放入一干燥潔凈的1. 5ml離心管內(nèi)用Iml無(wú)水乙醇進(jìn)行3 次清洗(渦旋，短暫離心，吸出。注意此時(shí)有少量金粉被粘在管壁上)。(5)加入ΙΟΟμΙ 0.05Μ亞精胺，渦旋混勻，超聲波處理5 IOsec (去除電荷)。(6)加入25μ 1上述得到的pBI221-ZmPMP3-GFP(l μ g/μ 1)混勻。邊渦旋邊加入
10100 μ 1 IM CaCl2，室溫靜置 lOmin。(7)用Iml無(wú)水乙醇清洗5次，方法同上。(8)用3ml 0. 05mg/ml PVP將金粉稀釋在一個(gè)IOml的大離心管中。(9)打開(kāi)N2總閥，調(diào)整減壓閥，使N2壓力在0.4左右，用純度為99. 997% N2干燥管15min。停止N2氣流，然后切割管，使其長(zhǎng)于平臺(tái)10cm。(10)將切割的管的一端與注射器相連，渦旋金粒子溶液并迅速將該溶液轉(zhuǎn)入該切割的管，使其每一末端均留有6cm的空隙。(11)迅速將上步盛有溶液的管置于支持物上并使溶液在管中停留3min，標(biāo)記其充滿的位置。用注射器緩慢移動(dòng)溶液剛好經(jīng)過(guò)右側(cè)標(biāo)記。使管旋轉(zhuǎn)180°，將溶液全部倒
出ο(12)使管旋轉(zhuǎn)30sec，打開(kāi)隊(duì)在0. ；35 0. 4rpm，旋轉(zhuǎn)5min。(13)將管從支持架上取出，停止隊(duì)氣流。切開(kāi)封閉的管，將子彈放入盛有干硅膠的容器?；驑屴Z擊洋蔥表皮(1)將制好的子彈裝入基因槍。(2)將基因槍與氦氣罐相連，壓力為150 300psi。(3)打開(kāi)預(yù)先準(zhǔn)備的放有洋蔥表皮的培養(yǎng)皿，將基因槍對(duì)準(zhǔn)洋蔥表皮進(jìn)行轟擊，每塊洋蔥表皮打兩槍。(4) 26 0C，黑暗條件下培養(yǎng)Mhr。以空載體pBI221-GFP為對(duì)照。亞細(xì)胞定位熒光信號(hào)觀察取出黑暗條件下培養(yǎng)Mh的洋蔥表皮于載玻片上，加上一滴水，蓋上蓋玻片，注意不要有氣泡，放于熒光共聚焦顯微鏡上觀察綠色熒光信號(hào)，其中激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，掃描波長(zhǎng)為 500-5;35nm。結(jié)果見(jiàn)圖2所示，其中，A為質(zhì)壁分離前的亞細(xì)胞定位結(jié)果；B.質(zhì)壁分離后的亞細(xì)胞定位結(jié)果，C為轉(zhuǎn)化pBI221-GFP空載體的對(duì)照。在對(duì)照的洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均能檢測(cè)到GFP熒光，表明與空載體pBI221-GFP相比，ZmPMP3定位于細(xì)胞膜中。 ZmPMP3亞細(xì)胞定位的結(jié)果現(xiàn)實(shí)，該基因位于細(xì)胞膜發(fā)揮作用，很可能參與膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)生理過(guò)程。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的獲得及功能研究植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301 (以下簡(jiǎn)稱 p3301，Canberra, Australia,由該文中王國(guó)英教授提供，Zhao J.，Sun Z.，Zheng J.，Guo X.，Dong Z.，Huai J.，Gou M. ,He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G. , Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Mol Biol 69 (2009) :661-674. ,^ 眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)和根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Zhao J. , Sun Ζ.， Zheng J. , Guo X. , Dong Ζ. , Huai J. , Gou Μ. , He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G. . (2009) Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Molecular Biology，69 :661-674.，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)
常用培養(yǎng)基和溶液的配制YEB液體培養(yǎng)基(IL)酵母提取物Ig牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4. 7H200. 5g加蒸餾水定容至1L，調(diào)PH至7.0，高壓滅菌。YEB固體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌。含有抗生素的YEB培養(yǎng)基在高壓滅菌后的YEB培養(yǎng)基中，當(dāng)溫度降至50°C左右時(shí)加入所需抗生素(100mg/L 的 Rif，100mg/L 的 Kan)，搖勻。含有PPT的MS選擇性培養(yǎng)基高壓滅菌后的MS培養(yǎng)基在溫度降至50°C左右時(shí)加入終濃度為7mg/L的PPTj^ 勻。bar基因引物Barp-F 5' -GCGGTCTGCACCATCGTC-3‘Barp-R 5‘ -GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3‘帶有酶切位點(diǎn)引物M1-3301-F1 5~ -CATCGGCACCATGGCGGAGGGGACT-3‘(下劃線為 NcoI 酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)原序列是T，但在構(gòu)建載體的過(guò)程中在該位置引入了酶切位點(diǎn)，為了匹配酶切位點(diǎn)所以將該序列的T改成了 G。)M1-3301-R1 _ATGGGTCACCGTCGGCAAGGATGAC_3~RT-PCR 所用引物 ZmPMP3-I-RT-F 5~-CAACTGCGTGGACATCCTGA-3、ZmPMP3-I-RT-R :5:GGCGTAGATGGCGTAGATGA_3、Ms培養(yǎng)基、D-marmitol (D_甘露醇)(sigma)購(gòu)自經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司； NaCl購(gòu)自于鼎國(guó)生物有限責(zé)任公司。擬南芥act in引物Actin-F 5' -ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3‘a(chǎn)ctin-R 5' -GAAACATTTTCTGTGAACGATTCC-3‘l、pCAMBIA3301_ZmPMP3 載體的獲得以 pMD18-T/ZmPMP3-l 為模板，用 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1 進(jìn)行擴(kuò)增，得到的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列中序列3自5 ‘末端第87-283位核苷酸，該P(yáng)CR產(chǎn)物基因的編碼區(qū)為序列3自5 ‘末端第88-264位核苷酸。將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)NcoI和BstEII雙酶切與經(jīng)過(guò)同樣酶切得到的pCAMBIA3301 載體片段連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)ToplO，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定，均為陽(yáng)性的送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列3自5 ‘末端第88-283位核苷酸插入到pCAMBIA3301載體(以下簡(jiǎn)稱p3301)的NcoI和BstEII酶切
12位點(diǎn)得到的載體，命名為pCAMBIA3301-ZmPMP3。pCAMBIA3301_ZmPMP3中ZmPMP3的編碼區(qū)位于啟動(dòng)子CaMV35S下游，為植物超表達(dá)載體。具體如下擴(kuò)增ZmPMP3的編碼區(qū)DNA，弓丨入酶切位點(diǎn)50 μ 1 體系重組質(zhì)粒 pMD18-T/ZmPMP3_l0. 85 μ 1M1-3301-F12. 5 μ 1(10 μ Μ)M1-3301-R12. 5 μ 1(10 μ Μ)2 X Pfu PCR Master Mix25 μ 1ddH2019. 15 μ 1PCR 擴(kuò)增程序94°C IOmin ；94°C 30sec ；68°C 30sec ；72 °C Imin ；72 °C IOmin ；4°C保溫，；35個(gè)循環(huán)。電泳檢測(cè)目的條帶后純化回收，得到純化后PCR產(chǎn)物。結(jié)果見(jiàn)圖3所示，其中泳道 1、2、3分別為DNA maker, PCR擴(kuò)增的負(fù)對(duì)照結(jié)果、PCR擴(kuò)增得到的帶有酶切位點(diǎn)的目的條帶，箭頭所指為目的條帶，可以看出得到177bp的目的片段。構(gòu)建p3301_ZmPMP3 50 μ 1體系分步酶切上述得到的純化后PCR產(chǎn)物(50ng/ μ 1)25 μ 1Buffer35 μ 1ddH2017. 5μ 1Nco I1 μ 137 °C2h加入Iml無(wú)水乙醇，4°C下，12000rpm離心30min ；倒掉無(wú)水乙醇，吹干。力口入:Buffer35 μ 1ddH2043. 5 μ 1BSA0. 5 μ 1BstEII1 μ 1600C 2h ；跑1 %瓊脂糖凝膠，切膠回收，得到酶切后PCR產(chǎn)物。p3301載體酶切30 μ 1體系(同時(shí)酶切三管)分步酶切ρ3301 質(zhì)粒(50ng/μ 1)10 μ 1Buffer33 μ 1ddH2014. 7μ 1Nco I1 μ 137 °C 2h加入Iml無(wú)水乙醇，4°C下，12000rpm離心30min ；倒掉無(wú)水乙醇，吹干。
力口入:Buffer33 μ 1ddH2025. 7 μ 1BSA0· 3 μ 1BstEII1 μ 160°C 2h ；跑瓊脂糖凝膠，跑的時(shí)間要盡量長(zhǎng)些，切膠回收，得到酶切后P3301。連接9. 8μ1 體系:酶切后的 p330K20ng/y 1)0. 8 μ 1酶切后 PCR 產(chǎn)物(50ng/ μ 1)7 μ 1Buffer1 μ 1T4 連接酶1 μ 116°C 12h ；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)ToplO，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆10 μ 1體系新鮮菌液1 μ 1M1-3301-F1 和 Ml-3301_Rl(10yM)2X0. 5μ 1Taq0. 5 μ 1Buffer1 μ 1dNTP1 μ 1ddH205. 5 μ 1使用瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR結(jié)果，得到177bp的片段為PCR陽(yáng)性克隆。酶切檢測(cè)將PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒用NcoI和BstEII雙酶切，結(jié)果見(jiàn)圖4所示，泳道1、2均為酶切鑒定的電泳結(jié)果，泳道3為DNA marker,箭頭所指為目的條帶，從圖中看出，得到得到177bp的片段，將該質(zhì)粒命名為pCAMBIA3301-ZmPMP3。2、轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的獲得1)擬南芥Sf ^ M it ^f Columbia(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia) (DIRK VALVEKENS, MARC VAN MONTAGU, MIEKE VAN LIJSEBETTENS. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 85, pp. 5536-5540,公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。)種子先用75%的酒精消毒lmin，再用0.5% NaClO (ν/ν)消毒lOmin，超凈臺(tái)中，用滅菌ddH20漂洗5次，每次lmin，點(diǎn)種到MS固體培養(yǎng)基上，4°C春化3d，然后放置于光照培養(yǎng)箱，22°C 16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)約一周后移栽于裝有蛭石營(yíng)養(yǎng)土(1 1)的小盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。2)、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落于:3ml YEB液體培養(yǎng)基中(含Rif+ 100 μ g/ ml)J8°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(2)取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1 %接種于YEB液體培養(yǎng)基(Rif+ 100 μ g/ml)中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5，需4h。
(3)冰浴 3Omin, 4°C 5OOOrpm 離心 5min，棄上清。(4)力卩IOml 0. 15M NaCl懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，4°C 5000rpm離心5min，去上清。(5)加入Iml預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴24h內(nèi)使用或分裝成每管200 μ 1， 液氮中速凍lmin，置-76°C保存?zhèn)溆谩?)、植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3的獲得(1)取 200 μ 1 GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，加入 1 μ g 構(gòu)建好的 pCAMBIA3301_ZmPMP3，液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml不含抗性的YEB液體培養(yǎng)基，28°C 140rpm,慢速振蕩培養(yǎng)4h。O) IOOOOrpm離心30sec，棄上清，加入0. Iml YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有 100 μ g/ml Kan 和 125 μ g/ml Rif 的 YEB 平板上，培養(yǎng)約 36 48h。(3)挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于YEB培養(yǎng)液(含100 μ g/ml Kan和125 μ g/ mlRif)中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(4)進(jìn)行菌液PCR鑒定，引物為M1-3301-F1和M1-3301-R1，結(jié)果見(jiàn)圖5所示，其中， 泳道2-8均為農(nóng)桿菌GV3101的菌液PCR結(jié)果，泳道1為DNA marker,泳道9為PCR反映中的負(fù)對(duì)照，從圖中看出，得到177bp的片段為PCR陽(yáng)性克隆，將PCR鑒定陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒， 送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pCAMBIA3301-ZmPMP3，含有該質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆命名為GV3101/ pCAMBIA3301-ZmPMP3o4)、擬南芥的轉(zhuǎn)化沾花法(floraldipping)(1)用1)得到的生長(zhǎng)大約三周的野生型擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且在轉(zhuǎn)化的前一天澆足水，轉(zhuǎn)化之前剪掉所有果莢。(2)按1 1000比例將活化的陽(yáng)性克隆菌液GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3轉(zhuǎn)接于 500ml具有卡那霉素抗性的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 2(培養(yǎng)Mh)。(3)4°C 4000rpm 離心 15min 集菌。(4)用200ml滲入緩沖液(1 XMS大量元素+5%蔗糖)重懸菌體，使0D600為0. 8， 加siliet 40 μ 1 (0. 2%0，體積百分含量)。(5)將擬南芥花蕾浸入中，侵染lmin。(6)用保鮮膜或保鮮袋包裹植株，16°C黑暗條件下放置Mhr后，放于正常條件下生長(zhǎng)，得到TO代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥。收獲TO代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的種子，為Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥種子。3、轉(zhuǎn)基因株系的篩選與鑒定l)ppt除草劑噴霧篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系(1)將Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥種子經(jīng)4°C春化處理后直接播種于裝有蛭石營(yíng)養(yǎng)土(1 1)的托盤中，正常條件下生長(zhǎng)20天，用0.5%。(體積百分含量)的PPt除草劑(日本明治制藥株式會(huì)社，吸取500 μ Ippt原液，溶解于IL蒸餾水中，獲得體積百分比為0. 5%ο 的工作液，用此液噴施擬南芥幼苗。)噴霧篩選，每天一次連續(xù)噴3天，一周后，觀察結(jié)果，由于表達(dá)載體Ρ3301上的ppt抗性基因在轉(zhuǎn)化時(shí)能夠隨目的基因一起整合到植物基因組中， 所以經(jīng)除草劑PPt篩選后可以正常生長(zhǎng)的植株理論上應(yīng)該是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，結(jié)果為得到35株生長(zhǎng)正常植株，即為ppt篩選陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥。移栽ppt篩選陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥植株繼續(xù)培養(yǎng)，每小盒種2株。每個(gè) PPt篩選陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥生長(zhǎng)至2片葉時(shí)小量提取DNA，進(jìn)行PCR鑒定，引物為 M1-3301-F1和M1-3301-R1，結(jié)果為得到177bp的片段的植物即為陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥，得到14株陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥。2)通過(guò)基因組PCR鑒定擬南芥陽(yáng)性植株A =SDS法小量提取35株P(guān)PT篩選鑒定為陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥總DNASDS 提取緩沖液(IOOml)Tris-HCl(lmol/L pH8. 0) IOmlEDTA (0. 5mol/L pH8. 0)IOmlNaCl (lmol/L)50ml (或 2. 9g 固體)滅菌ddH20 定容至 100ml。SDS裂解緩沖液SDS 提取緩沖液20% SDS = 15 1 (V/V)步驟(1)取適量的PPT鑒定為陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥葉片放入1. 5ml離心管中，力口液氮充分研磨成粉末(最好只加一次液氮去研磨)。(2)加入800 μ 1 65°C預(yù)熱的SDS裂解緩沖液，充分混勻后，65°C下抽提20min，期間再混勻2次。(3)加入 250 μ 1 5mol/L KAc，冰上放置 5min。(4) 12000rpm,離心lOmin，吸取上清至一新的離心管中。(5) 12000rpm,離心5min，吸取上清至一新的離心管中。(6)加入600 μ 1異丙醇混勻。(7) 40C 12000rpm，離心 15min(8)棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次。(9) 12000rpm離心3min，真空抽干或超凈臺(tái)吹干。(10)加入20 μ 1 1 XTE或滅菌ddH20溶解DNA沉淀，_20°C保存。純化(1)上述(10)中加入 RNase 1 μ 1，37°C消化 30min。(2)補(bǔ)滅菌ddH20至總體積600 μ 1。(3)加入300 μ 1苯酚，震蕩混勻5 IOmin ；加入300 μ 1氯仿，震蕩混勻5min。(4) 12000rpm,離心lOmin，吸取上清至一新的離心管中。(5)加入600 μ 1氯仿，震蕩混勻anin。(6) 12000rpm,離心2min，吸取上清至一新的離心管中。(7)加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2 3倍體積的冷無(wú)水乙醇，4°C靜置 30mino(8) 4°C I2OOOrpm,離心 2Omin,棄上清。(9) 75%乙醇洗沉淀2次。(10) 12000rpm離心3min，真空抽干或超凈臺(tái)吹干。
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(11)加入20 μ 1 lXTE或滅菌ddH20溶解DNA沉淀，-2(rC保存?zhèn)溆?，得到DNA。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，得到基因組DNA。B:進(jìn)行PCR鑒定以上述獲得的基因組DNA為模板，用引物Barp-F 5' -GCGGTCTGCACCATCGTC-3‘ 和 Barp-R 5 ‘ -GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3 ‘進(jìn)行 PCR 鑒定，檢測(cè) bar 基因。用引物 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1，進(jìn)行 PCR 鑒定，檢測(cè) ZmPMP3 基因。20 μ 1反應(yīng)體系10XPCR buffer2μ 1dNTP mix0. 4 μ 1Barp-F 和 Barp-R (或 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1) (ΙΟμΜ) 各 0. 5 μ 1陽(yáng)性T1 代植株 DNA1. 5 μ 1Taq polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 6 μ 1ddH2013. 5μ 1PCR擴(kuò)增程序94°C IOmin ；94°C 30sec ；63°C (bar 基因)/58°C (ZmPMP3_l 基因)；30sec，72°C 2min，33 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，圖7為陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組PCR檢測(cè)bar 基因結(jié)果，泳道1為對(duì)照，轉(zhuǎn)空載體擬南芥基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2-13為轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道14為野生型擬南芥株系基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道15 為正對(duì)照，質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmPMP3的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道16為DNA marker。圖8為Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組PCR檢測(cè)ZmPMP3結(jié)果，泳道1為DNA marker (同圖10)；泳道2為為對(duì)照，轉(zhuǎn)空載體擬南芥基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2_12為轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-ZmPMP3基因擬南芥株系基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道13為正對(duì)照，質(zhì)粒 pCAMBIA3301-ZmPMP3的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道14為野生型擬南芥株系基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果。從圖中看出，PCR擴(kuò)增目的基因和bar基因進(jìn)行鑒定，能夠擴(kuò)增出230bp的目的條帶和470bp的bar基因?yàn)殛?yáng)性Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥，得到14株陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥，證明ZmPMP3基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中。而對(duì)照的轉(zhuǎn)空載體植株擬南芥株系只有470bp 的bar條帶，野生型擬南芥中無(wú)此帶。3)從陽(yáng)性Tl代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥上收獲的種子為T2代種子，將上述T2代種子點(diǎn)種在含有除草劑(7mg/L ppt)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將生長(zhǎng)有四片葉的成活陽(yáng)性植株移栽到裝有蛭石營(yíng)養(yǎng)土(1 1)的小盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并收獲種子得到T3代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥。T3代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥經(jīng)ppt篩選表現(xiàn)為100 %抗性的株系，再進(jìn)行PCR鑒定，方法同 2)，結(jié)果得到陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系，從陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系中隨機(jī)挑選12個(gè)株系繼續(xù)繁育，得到T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥種子。播種T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥種子，得到T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系，采用2) 的方法，進(jìn)行PCR鑒定，得到12個(gè)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系。
采用同樣的方法將空載體pCAMBIA3301轉(zhuǎn)入野生型擬南芥 Columbia (Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)中，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥，經(jīng)過(guò)同樣的PCR鑒定，結(jié)果為沒(méi)有目的基因ZmPMP3。4)擬南芥總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄酶從12個(gè)"Γ4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系選取6個(gè)編號(hào)為4、5、6、8、11和12株系進(jìn)行real time-PCR分子檢測(cè)，以野生型擬南芥和T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對(duì)照。具體如下使用天根植物總RNA提取試劑盒提取編號(hào)為4、5、6、8、11和12的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系及對(duì)照擬南芥葉片總RNA，并使用invitrogen M-MlV反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈合成試劑盒獲得cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法，使用Sybergreen染料。20 μ 1反應(yīng)體系ZmPMP3-I-RT-F 和 ZmPMP3_l-RT-R(10 μ Μ)2X0. 4 μ 1Τ4 代植株1 μ 12 X Pfu PCR subygreen Mix10 μ 1ddH206. 8 μ 1PCR擴(kuò)增程序94°C Imin ；94°C 5sec,60°C 5sec,72°C 31 sec，；40個(gè)循環(huán)。以actin基因作為對(duì)照。結(jié)果為與野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥相比，編號(hào)為4、5、6、8、11和12的T4 代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系均可以檢測(cè)到ZmPMP3-l的表達(dá)(177bp片段)，而野生型和轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株中沒(méi)有檢測(cè)到。野生型、轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株、編號(hào)為4、5、6、8、11和12 的jM代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系中均有actin基因的表達(dá)QOObp片段)。4、轉(zhuǎn)基因株系的表型鑒定A 對(duì)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合株系進(jìn)行鹽脅迫(NaCl)和干旱脅迫(D_甘露醇) 處理，觀察表型，具體如下1)萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)將消毒的野生型擬南芥(CK)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥及編號(hào)為6和11的 T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合的種子均分別點(diǎn)種到含不同濃度NaCl (0，150mM)以及不同濃度 D-mannitol (0,300和;350mM)的MS培養(yǎng)基上，4°C黑暗條件春化3天，然后移至22°C、16hr 光照(100 μ E πΓ2 s-1) /8hr黑暗的光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，分別在MS培養(yǎng)基、150mM NaCl+MS培養(yǎng)基以及300mM D-mannitol+MS、350mM D+MS培養(yǎng)基中統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)3、4、5天后的萌發(fā)數(shù)。每個(gè)重復(fù)40粒種子，每個(gè)處理設(shè)置獨(dú)立的5個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)中，以長(zhǎng)出兩片綠色子葉為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果如下如圖9所示，在MS培養(yǎng)基㈧中，野生型(ck)在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為99%、100%、 100%;而6號(hào)114代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系的在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為98. 5^^99%,99%。在150mM NaCl+MS培養(yǎng)基⑶中，野生型(ck)在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為 20%,22. 5%,25% ；而6號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系的在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為 51. 7%,60%,61. 2%，明顯高于ck中的萌發(fā)率。在300mM D-mannitol+MS培養(yǎng)基(C)中，野生型(ck)在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為Μ. 2%、90. 8%、96. 7% ；而6號(hào)"Γ4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系的在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為60%、84.4%、90% ；而11號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系的在萌發(fā)3、4、5天的萌發(fā)率分別為 85. 6%,95. 6%,96. 7%。在350mM D_mannitol+MS培養(yǎng)基(D)中，野生型(ck)在萌發(fā)4、5天的萌發(fā)率分別為47. 5%,82. 5% ;6號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系在萌發(fā)4、5天的萌發(fā)率分別為80%、 86. 7% ;11號(hào)"Γ4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株系在萌發(fā)4、5天的萌發(fā)率分別為76. 9%、85%。野生型擬南芥與轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。因此，6、11號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3 擬南芥株系在早期的萌發(fā)率明顯高于ck，說(shuō)明ZmPMP3除響應(yīng)鹽的脅迫外，在萌發(fā)早期也響應(yīng)旱脅迫。2)生物重統(tǒng)計(jì)將消毒的野生型擬南芥(CK)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥及編號(hào)為6、11、12的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥純合的種子按照1)的方法處理，不同的是分別在如下培養(yǎng)基中培養(yǎng)1)MS 培養(yǎng)基；2) 150mMNaCl+MS 培養(yǎng)基；3) 175mMNaCl+MS 培養(yǎng)基；4) 300mM D-mannitol+MS 培養(yǎng)基；統(tǒng)計(jì)以上生長(zhǎng)2周的各組各株系擬南芥幼苗的生物重(整株幼苗的重量，包括地上部和根)。每個(gè)稱取株系20株擬南芥，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如圖10和11所示，其中，在MS培養(yǎng)基中，ck、6號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥、11號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥、12 號(hào) T4 代轉(zhuǎn) ZmPMP3 擬南芥的生物重分別為 0. 14225g、0. 14675g、0. 179g、0. 17875g ； 在150mM NaCl+MS培養(yǎng)基中，ck、6號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥、11號(hào)T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥、12號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的生物重分別為0. 0835g,0. 10625g、0. 1215g、 0.09275g ；在175mM NaCl+MS 培養(yǎng)基中，ck、6 號(hào)！"4 代轉(zhuǎn) ZmPMP3 擬南芥、11 號(hào)！"4 代轉(zhuǎn) ZmPMP3 擬南芥、12號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的生物重分別為0. 067g、0. 0914g、0. 0947g、0. 0444g ；在300mM D-mannitol+MS 培養(yǎng)基中，ck、6 號(hào) T4 代轉(zhuǎn) ZmPMP3 擬南芥、11 號(hào) T4 代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥、12號(hào)T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥的生物重分別，0. 0467g、0. 0387g、0. 0554g, 0.053go可見(jiàn)，6、11號(hào)株系的生物重在鹽脅迫下均顯著高于ck，而11、12號(hào)(最好能與鹽脅迫的株系一致)株系在滲透脅迫下的生物重明顯高于ck。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。3)成熟植株的全生育期的鑒定將消毒的野生型擬南芥(作為對(duì)照CK)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥及編號(hào)為4、5、6、11、12的 T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥純合的種子點(diǎn)種到MS固體培養(yǎng)基上于4°C黑暗條件下春化3d，移至22°C、每天16hr光照(100 μ E m_2 sl/Shr黑暗的光照培養(yǎng)箱中垂直放置生長(zhǎng)5d，然后將幼苗移栽至含有重量比為1 1的營(yíng)養(yǎng)土-蛭石組成的混合土的小盆中繼續(xù)培養(yǎng)，使用植物營(yíng)養(yǎng)液澆透，至擬南芥生長(zhǎng)4周，分為兩組處理脅迫組向各株系澆灌含有300mM NaCl水溶液進(jìn)行脅迫處理，每周澆灌一次，保持土壤濕潤(rùn)；對(duì)照組向各株系澆灌蒸餾水，每周澆灌一次，保持土壤濕潤(rùn)；處理兩周后(澆灌300mM NaCl兩周后)觀察各株系表型，統(tǒng)計(jì)存活率。移栽時(shí)， 每盆種植5株，每3盆(15株)為一個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。 使用植物營(yíng)養(yǎng)液澆透，至擬南芥生長(zhǎng)4周時(shí)觀察表型，結(jié)果如圖13所示，此時(shí)擬南芥進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段時(shí)，野生型擬南芥(對(duì)照CK)、編號(hào)為5、6、11的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥均剛剛抽薹。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。編號(hào)為4、12的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥與編號(hào)為5、6、11的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。處理兩天后，觀察脅迫組各株系表型，結(jié)果如圖14所示，經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理兩天后，野生型擬南芥(作為對(duì)照CK)和編號(hào)為4、5、6、11、12的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥低端蓮座葉均開(kāi)始變黃。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。處理兩周后，觀察表型，結(jié)果如圖15所示，其中NaCl處理ck為經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理的野生型擬南芥，對(duì)照ck為用蒸餾水澆灌處理的野生型擬南芥，NaCl處理株系6為經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理的編號(hào)為6的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥，對(duì)照株系6為用蒸餾水澆灌處理的編號(hào)為6的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥。編號(hào)為5、11的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3 擬南芥與編號(hào)為6的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。處理兩周后的擬南芥部分株系抽出的薹開(kāi)始萎蔫變黃，此時(shí)的擬南芥已經(jīng)不能進(jìn)一步完成生殖生長(zhǎng)，不結(jié)實(shí)并開(kāi)始死亡，因此在鹽脅迫處理兩周后，統(tǒng)計(jì)能夠完成全生育期 (即可以收獲種子的植株)的擬南芥株數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如下經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的野生型擬南芥(作為對(duì)照 CK)株數(shù)為2. 67株;經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的編號(hào)為4的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥株數(shù)為3. 34株；經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的編號(hào)為5的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的編號(hào)為6的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥株數(shù)為9. 67株；經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的編號(hào)為11的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥株數(shù)為3. 34株；經(jīng)300mM NaCl水溶液脅迫處理后，能夠完成全生育期的編號(hào)為12的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥株數(shù)為3. 34株；經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的野生型擬南芥(作為對(duì)照CK)株數(shù)為5株；
經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的編號(hào)為4的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的編號(hào)為5的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的編號(hào)為6的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的編號(hào)為11的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；經(jīng)蒸餾水處理的對(duì)照組中，能夠完成全生育期的編號(hào)為12的T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥株數(shù)為5株；部分結(jié)果作圖12所示，可以看出，過(guò)表達(dá)ZmPMP3基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在生殖生長(zhǎng)期表現(xiàn)了良好的耐鹽性。B、離體葉片保水力將消毒的野生型擬南芥(作為對(duì)照CK)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥及編號(hào)為5、6的T4代轉(zhuǎn) ZmPMP3擬南芥純合的種子點(diǎn)種到MS固體培養(yǎng)基上于4°C黑暗條件下春化3d，移至22°C、每天16hr光照(100 μ E m_2 s—1)/8hr黑暗的光照培養(yǎng)箱中垂直放置生長(zhǎng)5d，然后將幼苗移栽至含有重量比為1 1的營(yíng)養(yǎng)土-蛭石組成的混合土的小盆中繼續(xù)培養(yǎng)，使用植物營(yíng)養(yǎng)液澆透，至擬南芥生長(zhǎng)6周(此實(shí)驗(yàn)為了鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)水分的保持能力，是衡量植株耐滲透脅迫的指標(biāo)之一。)，將6周大擬南芥的地上部分整株剪下，稱取鮮重a。將其置于空氣中(23°C，濕度40% ) 后再次稱取重量b。然后與90°C烘干24h后至恒重，稱取重量c。 根據(jù)公式計(jì)算保水率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。WRC(%) =b-c/a-cX100結(jié)果如下Ck的保水率為75. 49% ；株系5的保水率為77. 98% ；株系6的保水率為79.02%。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。結(jié)果作圖如圖16所示，可以看出株系5、6的WRC顯著高于ck，說(shuō)明編號(hào)為5、6的 T4代轉(zhuǎn)ZmPMP3擬南芥野生型擬南芥比野生型擬南芥的葉片保水力高。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列2或序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與植物耐逆性和/或保水力相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-8)中任一所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第87位-283位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列3所示的DNA分子；5)序列表中序列3自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列3自5’末端第88位-283位核苷酸所示的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)或幻或幻或4)或幻或6)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性和/或保水力相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子；8)與1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、 至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有 97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與所述植物耐逆性和/或保水力相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)品.ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因插入載體PCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
6.一種培育耐逆性和/或保水力提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性和/或保水力高于所述目的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物的保水力高于所述目的植物為所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片保水率高于所述目的植物；所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白ZmPMP3及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了的蛋白質(zhì)，名稱為ZmPMP3，來(lái)源于玉米，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或保水率相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用克隆的方法得到ZmPMP3基因，將其導(dǎo)入擬南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐逆性和/或保水率高于野生型擬南芥。本實(shí)驗(yàn)得到的ZmPMP3基因和轉(zhuǎn)基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102453083SQ20101052558
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者付靜, 劉穎慧, 宋燕春, 張登峰, 李會(huì)勇, 王天宇, 石云素, 黎裕 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所