專利名稱：煙草細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煙草細胞質(zhì)雄性不育 (Cytoplasmicmale sterility, CMS)材料胞質(zhì)的鑒別方法，應用于煙草CMS胞質(zhì)類型即 Nicotianasuavolens (Nta(sua) S)型不育胞質(zhì)、N. biglovii (Nta(big) S)型不育胞質(zhì)和 N. glauca(Nta(gla)S))型不育胞質(zhì)等三型不育胞質(zhì)類型鑒定。
背景技術(shù)：
細胞質(zhì)雄性不育是很普遍的遺傳現(xiàn)象，在作物雜種優(yōu)勢利用等方面有重要的應用價值。1932年，East研究發(fā)現(xiàn)煙草種間雜交，產(chǎn)生了不育性，證實了煙草細胞質(zhì)雄性不育材料的存在(EAST,Ε· M. · Studies of self-sterility. IX. The behavior of crossesbetween self-sterile and self-fertile plants. Genetics, 1932，17175-202)。與水稻、小麥等谷類作物不同，煙草的產(chǎn)品是葉片，而非種子，所以在利用雄性不育系配制煙草雜交種子方面，煙草比其它作物方便、簡單。利用煙草雄性不育系制種，不僅節(jié)省勞力、提高制種質(zhì)量， 降低生產(chǎn)成本，而且對于保護育種者的知識產(chǎn)權(quán)有重大意義。2009年，烤煙不育系推廣面積已占全部烤煙種植面積的50 %。迄今，世界上已發(fā)現(xiàn)有16種不同胞質(zhì)來源的煙草CMS材料，其中僅有Nta (sua) S、Nta (big) S和Nta (gla) S等材料其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)質(zhì)性狀與其同型品禾中基本相同(BERBEC A. Effect ofsixteen different sources of cytoplasmic male sterility(cms)on some traits of a flue-curedtobacco cultivar C0RESTA,2000,2)。 目前，我國烤煙主栽品種CMS的細胞質(zhì)全部來源于Nta(SUa)S，另外也通過種間雜交獲得了 Nta (big) S 和 Nta (gla) S 等煙草 CMS 材料。在配制烤煙雜交組合時，育種者需先明了所利用的CMS材料的胞質(zhì)類型；雜交種生產(chǎn)者在收獲、加工及包裝時需對CMS種子胞質(zhì)質(zhì)量進行嚴格的檢測，而對CMS胞質(zhì)的鑒定是有效利用煙草CMS的重要保證。因此，有必要尋找快速精確鑒定不同的CMS胞質(zhì)類型的方法。研究植物胞質(zhì)遺傳的常規(guī)方法是RFLP標記，而CAPS (cleaved amplifiedpolymorphic sequence)是特異引物PCR與限制性內(nèi)切酶相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標記，當特異擴增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時，可用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，再經(jīng)電泳檢測其多態(tài)性(Konieczny A. Ausubel F. M. A procedure for mappingArabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. PlantJ. 1993,4(2)403-410)。同RFLP相比，CAPS分析的主要優(yōu)點在于該方法易操作、成本低；直接用總DNA進行擴增而無須分離細胞器DNA ；樣品用量少，特別適合于對雜種進行早期遺傳分析(Bastia T, Scotti N, Cardi T. Organelle DNA analysis ofSolanum and Brassica somatic hybrids by PCR with'universal primers'. Theor. Appl. Genet., 2001，102 :1265 1272)。迄今為止，尚無利用CAPS分子標記方法檢測煙草CMS胞質(zhì)類型的相關(guān)技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用CAPS分子標記，提供3種CMS不同類型的鑒別方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的提取Nta (big) S,Nta (gla) S 和 Nta (sua) S 3 種煙草 CMS 基因組 DNA，以其為模板， 設計合成葉綠體基因TrnH-TrnK引物，進行聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增產(chǎn)物經(jīng)過TaqI酶切后，以瓊脂糖凝膠電泳檢測上述三種CMS不同胞質(zhì)類型的特征帶。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下煙草細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型的鑒別方法，包括以下步驟1)3種煙草CMS基因組DNA提??；2)以葉綠體通用基因TrnH-TrnK核苷酸分子為引物，對上述基因組DNA進行PCR 擴增；3)對PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過Taq I酶切后電泳，得到CAPS標記。步驟1)所述DNA提取是提取Nta (big) S、Nta (gla) S和Nta (sua) S 3種煙草胞質(zhì)雄性不育系基因組DNA。步驟幻所述引物核苷酸分子是具有下列堿基組成的序列TrnH :5’-ACGGGAATTGAACCCGCGC A-3'TrnK :5’_CCGACTAGTTCCGGGTTCG A_3，。步驟2)所述PCR擴增反應采用1)PCR反應體系為30μ 1，所用溶劑的組成及含量為10 X Taq DNA聚合酶緩沖液(不含氯化鎂MgCl2)3. 0 μ 1MgCl2 (25mM)2. 5 μ 1dNTP (2. 5mM)2. 0 μ 1TrnH(IOyM)Ι.ΟμΙTrnK(IOyM)Ι.ΟμΙTaq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2 μ 1模板 DNAΙ.ΟμΙ無菌水14. 3 μ 12) PCR 擴增在PCR儀上進行PCR擴增反應，反應條件為94°C變性:3min，94°C變性Imin，55 °C退火40s，72 °C延伸2min，35個循環(huán)后，在72 °C延伸5min，并放置4°C保存?zhèn)溆谩２襟E3)所述酶切反應采用酶切反應體系為20μ 1，所用溶劑的組成及含量為10倍酶切緩沖液2. 0 μ 1PCR 產(chǎn)物5. 0 μ 1牛血清白蛋白0. 2μ1TaqI 內(nèi)切酶0. 5 μ 1無菌水12·3μ1 上述混合液在65 °C下酶切反應證，在4°C保存?zhèn)溆谩?br> 電泳是PCR擴增產(chǎn)物以0. 9%的瓊脂糖凝膠進行電泳；酶切產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳2. 5h，電泳結(jié)束，均以0. 5μ g/ml的溴化乙錠EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。步驟幻得到的CAPS標記，Nta (big) S特異譜帶為340bp，Nta (gla) S特異譜帶為 410bp, Nta(Sua)S 特異譜帶為 380bp。本發(fā)明的優(yōu)點在于有關(guān)煙草CMS不同胞質(zhì)來源的CAPS分子標記鑒別尚未見報道，這為煙草CMS不同胞質(zhì)類型分子鑒別奠定了基礎。


下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。圖1煙草不同來源的胞質(zhì)雄性不育系葉綠體基因TrnH-TrnK PCR擴增產(chǎn)物圖譜M-IOObp ladder plus DNA 分子量標記，l_Nta (big) S，2_Nta (gla) S，3_Nta (sua) S圖2煙草不同來源的胞質(zhì)雄性不育系葉綠體基因TrnH-1TrnK PCR擴增產(chǎn)物TaqI 酶切圖譜M-IOObp ladder plus DNA 分子量標記，1-Nta (big) S，2_Nta (gla) S，3_Nta (sua) S
具體實施例方式實施例1 實驗材料Nta (big) S,Nta (gla) S和Nta (sua) S 3種煙草細胞質(zhì)雄性不育系由中國煙草育種研究(南方)中心提供。1、DNA 提取(1)、在液氮中研磨0. 6克葉片，使成粉狀，研磨時加入少許的β -巰基乙醇和PVP(2)、將粉狀物加入到1. 5ml的離心管中，加入Iml的經(jīng)65°C預熱CTAB緩沖液 (0. IM Tris-Cl, 1. 4M NaCl,0. 02M EDTA,2% CTAB,0. 5% β _ 巰基乙醇)，65°C水浴預熱 30-60min，中間每隔IOmin緩緩搖動一次。(3)、以12000\8離心511^11，吸取700 μ 1上清到一新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，緩緩翻轉(zhuǎn)，使充分混勻(約15min)，之后以6000 X g離心lOmin，取出上清置于
另一離心管中。(4)重復步驟(3) —次。(5)取上清加入1/10體積的3M醋酸鈉(NaAc)和2倍體積的無水乙醇，置于-20°C 30min或過夜，4°C 3000Xg離心lOmin，將沉淀自然風干lOmin。(6)將沉淀溶于 500 μ 1 0. IXTE 緩沖液中，加 1 2μ 1 RNase，37°C 保溫 30min 去 RNA。(7)加入等體積的氯仿/異戊醇，緩緩翻轉(zhuǎn)，使充分混勻(約15min)，之后以 6000X g離心lOmin，取出上清置于另一離心管中。往此管中加入1/10體積NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min(8) 10，OOOXg離心lOmin，收集沉淀，以70%的乙醇洗滌DNA沉淀2次，室溫下自
然風干至沉淀無乙醇味
(9)加入50 μ 1 0. IXTE緩沖液，37°C放30分鐘，并用75°C水浴處理去掉可能存在的DNase，保存于4°C下待用。2、引物合成參照 Demesure B 等人報道(Demesure B ；Sodzi N ；Petit R JA set of universal primers for amplification of polymorphic non-codingregions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecularecology 1995 ；4 (1) 129-131.)，合成葉綠體基因TrnH-TrnK的引物序列。引物的特定堿基序列組成如下TrnH :5’-ACGGGAATTGAACCCGCGC A-3'TrnK :5’-CCGACTAGTTCCGGGTTCG A-3'3、PCR 反應將以下試劑混合在一起10 X Taq DNA聚合酶緩沖液(不含氯化鎂MgCl2)3. O μ 1MgCl2 (25mM)2. 5 μ 1dNTP (2. 5mM)2. O μ 1TrnH(IOyM)Ι.ΟμΙTrnK(IOyM)Ι.ΟμΙTaq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2 μ 1模板 DNAΙ.ΟμΙ無菌水14·3μ1將上述混合液離心IOs后，以美國PE9600型DNA擴增儀進行PCR擴增。PCR反應程序為反應條件為94°C變性3min，94°C變性lmin，55°C退火40s，72°C延伸2min，35個循環(huán)后，在72 °C延伸5min，并放置4°C保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笠訡APS標記方法來鑒別Nta (big) S、Nta(gla)S和Nta (sua) S 3種煙草胞質(zhì)雄性不育系。4、CAPS標記利用TaqI內(nèi)切酶對3中的PCR產(chǎn)物進行酶切，獲得相關(guān)不育系胞質(zhì)的CAPS標記。酶切反應采用酶切體系為20μ 1，所用溶劑的組成及含量為10倍酶切緩沖液2. 0 μ 1PCR 產(chǎn)物5. 0 μ 1牛血清白蛋白0. 2μ1Taq I 內(nèi)切酶0. 5 μ 1無菌水12·3μ1上述混合液在65 °C下酶切反應5h，在4°C保存?zhèn)溆谩?、標記檢測PCR擴增產(chǎn)物以0. 9%的瓊脂糖凝膠進行電泳lh，以0. 5 μ g/ml的溴化乙錠EB染色，以凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄(見圖1)；酶切產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳2. 5h，以0. 5μ g/ml的溴化乙錠EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄(見圖2 箭頭所示)。
權(quán)利要求
1.煙草細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型的鑒別方法，包括以下步驟1)3種煙草細胞質(zhì)雄性不育系材料基因組DNA提?。?)以葉綠體通用基因TrnH-TrnK核苷酸分子為引物，對上述基因組DNA進行PCR擴增；3)對PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后電泳，得到CAPS標記。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于步驟1)所述DNA的提取是提取Nta(bih) S、Nta (gla) S和Nta (sua) S 3種煙草胞質(zhì)雄性不育系基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于步驟幻所述引物核苷酸分子是具有下列堿基組成的序列TrnH :5’ -ACGGGAATTGAACCCGCGCA—3’ TrnK :5’ -CCGACTAGTTCCGGGTTCGA-3’。
4.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于步驟2)所述PCR擴增反應采用 DPCR反應體系為30μ 1，所用試劑的組成及含量為10 X Taq DNA聚合酶緩沖液(不含氯化鎂MgCl2)3. 0 μ 1MgCl2 (25mM)2. 5 μ 1dNTP (2. 5mM)2. 0 μ 1TrnH(IOyM)1. 0 μ 1TrnK(IOyM)1. 0 μ 1Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2 μ 1模板 DNAΙ.ΟμΙ無菌水14. 3 μ 1 2) PCR擴增在PCR儀上進行PCR擴增反應，反應條件為94°C變性3min，94°C變性lmin，55°C退火 40s, 72°C延伸2min，35個循環(huán)后，72°C延伸5min，并放置4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.如權(quán)利要求書1所述的鑒別方法，其特征在于步驟3)所述酶切反應 酶切反應體系為20μ 1，所用試劑的組成及含量為10倍酶切緩沖液2. 0 μ 1PCR 產(chǎn)物5. 0 μ 1牛血清白蛋白0.2μ1TaqI內(nèi)切酶0. 5μ1無菌水12. 3μ1上述混合液在65°C下酶切反應證，在4°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求書1所述的鑒別方法，其特征在于所述電泳是PCR擴增產(chǎn)物以0.9%的瓊脂糖凝膠進行電泳；酶切產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳2. 5h，電泳結(jié)束，以0. 5μ g/ ml的溴化乙錠EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。
7.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于步驟3)得到的CAPS標記，Nta(big)S特異譜帶為34(^ ，附3&1&)3特異譜帶為41(^ ，附3(8皿)3特異譜帶為380bp。
全文摘要
本發(fā)明提供煙草細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型的鑒別方法，包括以下步驟1)3種煙草細胞質(zhì)雄性不育系材料基因組DNA提取；2)以葉綠體通用基因TrnH-TrnK核苷酸分子為引物，對上述基因組DNA進行PCR擴增；3)對PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過TaqI酶切后電泳，得到CAPS標記，Nta(big)S特異譜帶為340bp，Nta(gla)S特異譜帶為410bp，Nta(sua)S特異譜帶為380bp。本發(fā)明利用葉綠體TrnH-TrnK基因，獲得了煙草胞質(zhì)雄性不育系不同胞質(zhì)類型的特有CAPS標記，通過以上標記，可為育種者及種子生產(chǎn)者提供煙草細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型一種分子鑒別方法。
文檔編號C12Q1/68GK102199655SQ200910094979
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者劉勇, 盧秀萍, 徐照麗, 李文正, 李永平, 焦芳嬋, 肖炳光, 陳學軍, 高玉龍 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院