與玉米雄性核不育相關的基因ms33及其在雜交育種中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與玉米雄性核不育相關的基因MS33及其在雜交育種中的應用。本發(fā)明提供了一種與玉米雄性核不育相關的MS33蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。MS33基因突變導致玉米完全雄性不育，性狀徹底，不受環(huán)境影響。該基因具有在玉米雜交種子生產(chǎn)上的應用潛力。
【專利說明】
與玉米雄性核不育相關的基因 MS33及其在雜交育種中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域，設及一種與玉米雄性核不育相關的基因 MS33及其 在雜交育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 玉米是我國第一大糧食作物，我國的玉米產(chǎn)量和消費量位居世界第二。因此，玉米 產(chǎn)量的穩(wěn)定提高對維持國內(nèi)糧食安全具有十分重要的作用。近年來，下游產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展 對玉米的需求量日益增加，國內(nèi)玉米需求已經(jīng)需要進口調(diào)節(jié)。玉米生產(chǎn)壓力日益增大。
[0003] 目前，玉米種子生產(chǎn)廣泛依賴雜交制種。傳統(tǒng)的雜交制種需要嚴格的人工去雄和 控制授粉W保障商品種子純度，耗費大量的人力成本和上地資源。今后運種限制對玉米種 子生產(chǎn)的影響將進一步增強。玉米是最早利用雄性不育系進行雜交制種的作物，通過選育 優(yōu)良的雄性不育系改良雜交育種流程，是進一步提高玉米種子產(chǎn)業(yè)效益的有效途徑之一。
[0004] 植物雄性不育(male sterility)是指植物在生殖生長階段，雄性生殖器官無法產(chǎn) 生正常的可育雄配子的現(xiàn)象。造成植物雄性不育的原因很多，如花粉母細胞、花藥壁、花粉 等組織發(fā)育異常均可導致不育發(fā)生。目前，玉米上已經(jīng)克隆獲得多個雄性不育相關基因。
[0005] 植物雄性不育可W分為胞質(zhì)不育和核不育。胞質(zhì)不育由細胞質(zhì)基因突變引起，后 代育性可被相應的核基因恢復;核不育由細胞核基因突變引起，核不育系的恢復系即其野 生型。
[0006] 早在上世紀30-70年代，基于T型細胞質(zhì)雄性不育的=系法雜交技術在玉米制種上 得到廣泛應用。然而后來由于玉米小斑病T小種的爆發(fā)，導致高感的T型胞質(zhì)不育系退出商 業(yè)制種體系。同時，S型胞質(zhì)不育表型不穩(wěn)定，C型胞質(zhì)不育又很難找到對應恢復系。運些因 素限制了后來細胞質(zhì)雄性不育系的應用開發(fā)。
[0007] 細胞核雄性不育的利用最早采用兩系法策略。制種過程中將純合不育株與雜合可 育株雜交，后代群體表現(xiàn)1:1育性分離。顯然，運種方法需要對育性進行田間鑒定，應用成本 高，效率低。針對運個問題，人們提出了許多解決方案。其中比較經(jīng)典的是利用雄性不育基 因與胚乳顏色基因或黃綠苗基因連鎖進行早期鑒定。然而，運類方法依賴人工鑒定，誤差較 大，存在應用風險，依然難W推廣。
[000引2006年，美國先鋒公司通過遺傳工程開發(fā)出一種新型不育系制種系統(tǒng)--SPT種 子生產(chǎn)技術。該體系的特點是利用轉(zhuǎn)基因系生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因種子，高效率分離不育系和保持 系。其技術路線是將育性恢復基因，花粉致死基因和巧粒巧光基因連鎖構建SPT保持系表達 核，然后將SPT表達核轉(zhuǎn)入隱性不育系純合子基因組中，構建SPT系。運樣，獲得SPT盒的ms45 純合植株獲得育性；同時由于攜帶SPT盒的雄配子致死，只能形成攜帶不育基因 ms45的花 粉。運樣，SPT系自交產(chǎn)生1:1比例的ms45/ms45，W及ms45/ms45: : SPT兩種基因型的子代，通 過巧光篩選即可將可育和不育個體分開；用SPT系給相應不育系授粉，即可得到不育系后 代，解決了不育系繁種問題。運樣就通過SPT技術實現(xiàn)了不育系和保持系的一系兩用；同時 SPT盒只通過雌配子傳代，就有效杜絕了轉(zhuǎn)基因花粉擴散。SPT種子生產(chǎn)技術成功解決了細 胞核雄性不育系和保持系分離的難題，在雜種作物種子生產(chǎn)上具有廣泛的應用前景。其技 術核屯、是要求利用的核不育基因具有穩(wěn)定的表型。
[0009] 與胞質(zhì)不育基因相比，玉米核不育基因數(shù)量豐富，遺傳背景來源廣泛，具有更好的 應用前景。然而，目前玉米上克隆的可供分子育種應用的核不育基因非常有限。優(yōu)良核不育 系的篩選和評估，是今后玉米不育系育種的關鍵環(huán)節(jié)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種與玉米雄性核不育相關的基因 MS33及其在雜交育種中 的應用。
[0011] 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為MS33,來源于玉米屬的玉米(Zea mays L.)，是如 下(a)或(b):
[0012] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0013] (b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加，且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0014] 序列表序列1為MS33的氨基酸序列，共有525個氨基酸。
[0015] 為了便于上述(a)中所示蛋白質(zhì)的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列 組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如下表所示的標簽。
[0016] 表:標簽的序列
[0017]
[0018] 上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一個或 幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0019] 編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020] 所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可W是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因（命名為 MS33)，所述基因具體可為如下1) -5)中任一的DNA分子：
[0022] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0023] 2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0024] 3)序列表中序列3的第83-1660位所示的DNA分子；
[0025] 4)在嚴格條件下與1)-3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與植物雄性育性相關 的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[00%] 5)與1)-4)中任一限定的DNA序列具有90% W上同一性，且編碼與植物雄性育性相 關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DM分子。
[0027] 其中，序列2為MS33基因在玉米基因組中的序列；序列3為MS33基因的cDNA序列，第 83-1660位為 CDS。
[0028] 含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0029] 所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0030] 所述重組表達載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 PBI121、地inl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它參與mRNA加工 或基因表達的DNA片段。所述聚腺巧酸信號可引導聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端。使用所 述基因構建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織 特異型或誘導型啟動子，例如花挪菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、泛素基因化iquitin啟動 子(P師i)、脅迫誘導型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用； 此外，使用本發(fā)明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增 強子，運些增強子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列 的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣 泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結構基因。 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如 加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素 標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接W逆境篩選轉(zhuǎn)化 植株。
[0031] 所述表達盒由能夠啟動所述基因表達的啟動子，所述基因，W及轉(zhuǎn)錄終止序列組 成。
[0032] 所述轉(zhuǎn)基因細胞系為轉(zhuǎn)入所述基因的非繁殖材料。
[0033] 所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生 物在如下任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0034] (a)植物育種；
[0035] (b)調(diào)控植物雄性育性；
[0036] (C)維持花藥絨拉層細胞形態(tài)和/或功能。
[0037] 所述(b)中，所述調(diào)控植物雄性育性可為提高植物雄性育性或降低植物雄性育性。 當所述MS33基因正常表達時，所述植物為雄性可育，花藥絨拉層細胞形態(tài)、功能正常；當所 述MS33基因為純合突變時，所述植物為雄性不育表型，花藥絨拉層細胞形態(tài)和功能受到破 壞。
[0038] 本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0039] 本發(fā)明所提供培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可為如下(A)或(B):
[0040] (A)培育雄性可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：
[0041] (al)向雄性不育的受體植物中導入MS33蛋白的編碼基因，得到表達所述編碼基因 的轉(zhuǎn)基因植物;所述受體植物的雄性不育性狀是由于所述受體植物表達有功能的所述MS33 蛋白的能力喪失或降低引起的；
[0042] (a2)從步驟(al)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性可育的轉(zhuǎn)基因植物；
[0043] (B)培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：
[0044] (bl)抑制雄性可育的受體植物中MS33蛋白的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0045] 化2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。
[0046] 在本發(fā)明中，所述雄性不育表現(xiàn)為"花藥內(nèi)沒有能夠被1%I2-KI染色鑒定為有活 力的花粉"，和/或花藥絨拉層細胞形態(tài)和功能受到破壞(花藥絨拉層細胞降解）。
[0047] 在本發(fā)明中，所述植物既可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。其中，所述單子葉 植物如禾本科植物，具體如玉米。
[0048] 本發(fā)明通過圖位克隆獲得了玉米雄性核育性基因 MS33的序列，該基因突變導致玉 米完全雄性不育，性狀徹底，不受環(huán)境影響。該基因具有在玉米雜交種子生產(chǎn)上的應用潛 力。
【附圖說明】
[0049] 圖1為玉米突變體ms33-6019的表型鑒定結果。其中，A左側(cè)為野生型，右側(cè)為ms33- 6019突變體；B為野生型雄穗；C為ms33-6019突變體雄穗;D為野生型雄花，Bar=lmm;E為 ms33-6019突變體雄花，Bar=lmm;F為野生型花藥，Bar=lmm;G為ms33-6019突變體花藥， Bar = lmm;H為野生型可育花粉，I2-KI染色；I為ms33-6019突變體不育花粉，I2-KI染色。
[0050] 圖2為野生型和ms33-6019突變體不同發(fā)育時期花藥半薄切片觀察結果。其中，A-E 為野生型；F-J為ms33-6019突變體。A和F為stage 6;B和G為stage 8a;C和H為stage 8b;D和 I為stage 10;E和J為stage 13eDMsp，降解的小抱子（degenerated microspores) ;E，表皮 層（epidermis) ;En，內(nèi)皮層（endothecium) ;ML，中間層（middle layer) ;Mp，成熟花粉 (ma1:ure pollen) ;Msp，小抱子(microspore) ;T，絨拉層（tapetum)，Tds，四分體（tetrads)。 Bars = 20]im。
[0051 ]圖3為MS33基因克隆和基因結構。其中，A為MS33基因的定位;B為不同玉米ms33突 變體等位系的MS33基因結構。
[0化2]圖4為ms33-6019突變體與sal突變體等位測驗結果。其中，A為野生型小花;B為sal 突變體小花;C為ms33-6019突變體小花;D為sal/ms33-6019互補系小花;E為野生型可育花 粉;F為sal突變體敗育花粉;G為ms33-6019突變體敗育花粉;H為sal/ms33-6019互補系敗育 花粉。E-H為I2-KI染色結果。
[0化3] 圖5為MS33基因組織表達模式分析。其中，A為MS33基因 qRT-PCR分析，Mean±SD(n = 3)eB-G為MS33基因在野生型不同發(fā)育時期花藥中的原位雜交。B為Stage 6;C為Stage 7; D為Stage 8a;E為Stage 10;F為Stage 11;G為MS33正義探針雜交，Stage 8aeB-F為反義探 針，用W直接檢測基因表達;G中的正義探針作為對照使用。Msp，小抱子(microspore) ;T，絨 拉層（tapetum) ;Tds，四分體（tetrads) 〇Bar = 50皿。
[0化4] 圖6為序列多重比對。
[0055]圖7為系統(tǒng)發(fā)生樹。
【具體實施方式】
[0056] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0化引 玉米突變體ms33-6019:由Maize Genetics Cooperation Stock Center保存，Co- op ID:228F;Description:228F ms33-6019。該玉米突變體在該保藏中屯、的具體網(wǎng)頁鏈接 女曰下：http: //www.maizegdb. org/data_center/stock?id = 130377。
[0059]玉米突變體ms33-6024:由Maize Genetics Cooperation Stock Center保存，Co- op ID: 228G;Description:228G ms33-6024。該玉米突變體在該保藏中屯、的具體網(wǎng)頁鏈接 女曰下：http: //www.maizegdb. org/data_center/stock?id = 130378。
[0060]實施例1、與玉米雄性核不育相關的基因 MS33的圖位克隆 [0061 ] 一、玉米ms33突變體的表型鑒定
[0062] 玉米male sterile 33(ms33)突變體發(fā)現(xiàn)于 1999年，目前在美國Maize Genetics Cooperation Stock Center公共突變體庫中保存的ms33突變體等位系有8個，本發(fā)明的發(fā) 明人在Maize Genetics Cooperation Stock Center申請獲得了ms33突變體等位系ms33- 6019(即玉米突變體ms33-6019)，并進行了表型鑒定。結果發(fā)現(xiàn)。ms33-6019突變體與野生型 玉米植株（自交系鄭58)相比，花粉敗育，營養(yǎng)生長階段沒有表現(xiàn)出明顯差異（圖1中A)，但當 ms33-6019突變體植株發(fā)育進入散粉期后，花藥不能從小花中吐出。通過顯微解剖和育性鑒 定，發(fā)現(xiàn)ms33-6019突變花藥出現(xiàn)嚴重的萎縮，花藥內(nèi)部用1%I2-KI溶液染色，未觀察到黑 色圓形飽滿成熟的花粉粒，即ms33-6019突變體表現(xiàn)出完全的雄性不育，根本沒有花粉產(chǎn)生 (圖1中C，E，G，I)。將突變體分別在北京和海南種植，不育表型表現(xiàn)穩(wěn)定，不受環(huán)境影響。
[0063] 為了進一步確定ms33-6019突變表型發(fā)生的時期和部位，本發(fā)明的發(fā)明人利用半 薄切片技術對比了野生型（自交系鄭58)和突變體花藥不同發(fā)育時期的解剖結構。結果發(fā) 現(xiàn)，ms33-6019突變體花藥在四分體期之前與野生型沒有明顯差異（圖2中A-C，F(xiàn)-H)，ms33- 6019突變體能夠形成正常的花粉璧結構，小抱子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂II并形成正常的四分 體（圖2中H)。進入單核期之后，野生型花藥產(chǎn)生小抱子，它們具有加厚的花粉外壁，絨拉層 清晰可見。然而，運時期的ms33-6019突變體絨拉層幾乎完全降解，小抱子外壁呈不規(guī)則狀 且著色明顯較淺，細胞質(zhì)收縮（圖2中I)。在隨后的時期里，ms33-6019突變體的小抱子完全 降解，僅在空痕的藥室內(nèi)留下一團殘基（圖2中J)。運些結果說明，ms33-6019突變體中造成 其雄性不育表型的異常表達的基因參與花藥小抱子的發(fā)育過程，并能夠維持絨拉層的正常 形態(tài)和功能。
[0064] 二、玉米ms33突變體遺傳分析及與玉米雄性核不育相關的基因 MS33的圖位克隆
[0065] 本發(fā)明的發(fā)明人用野生型玉米植株的花粉給不育的玉米突變體ms33-6019授粉， ms33-6019突變體可W正常結巧，說明ms33-6019突變體雌配子發(fā)育正常。為進一步研究 ms33突變體特性并獲得基因，本發(fā)明的發(fā)明人W玉米突變體ms33-6019作為母本，W玉米自 交系B73或鄭58為父本組配Fi，所有F1植株都表現(xiàn)出正常的雄性可育，將F1自交得F2群體。 而F2表現(xiàn)出3:1育性分離(雄性可育：雄性不育= 153: 55，x2<)c2(〇.〇5,1) = 3.84)。運說明 ms33突變體的雄性不育表型由一個隱性基因控制。
[0066] W上述所得的F2群體作為遺傳定位群體。通過捜索MaizeGDB公共數(shù)據(jù)庫化ttp:// WWW.maizeg化.o;rg/data_cente;r/ssr)，篩選了均勻覆蓋整個玉米基因組的366對SSR標記。 利用聚丙締酷氨凝膠電泳分析運些SS財示記在ms33-6019親本與不同自交系間的多態(tài)性。
[0067] 通過田間育性鑒定，在ms33XB73F2群體中選取了 273個不育單株，提取基因組DNA 進行定位分析。最終將突變位點定位在umc 1736和umc2214兩個分子標記。該區(qū)間長度約 1.84Mb，位于玉米2號染色體的長臂上（圖3中A)。在umcl736和umc2214兩個標記間缺乏具有 多態(tài)性的公用SSR標記，并且聚丙締酷氨凝膠電泳操作繁瑣，因此希望在兩個標記間開發(fā) Indel標記，結合瓊脂糖凝膠電泳法進行精細定位。區(qū)間內(nèi)總共開發(fā)了7對在玉米自交系B73 或鄭58群體內(nèi)具有多態(tài)性的Indel標記，引物在ms33-6019親本和鄭58自交系間的多態(tài)性較 高，因此在ms33 X鄭58F2群體中鑒定了 2871個不育單株，提取基因組DNA進行定位。
[006引最終將定位區(qū)間被縮小至標記IDP607和IDP647間190肺的范圍內(nèi)，該區(qū)間包含9個 預測基因。根據(jù)Maize GDB和NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關注釋發(fā)現(xiàn)，其中GRMZM2G070304編碼一個 可能的甘油醒-3-憐酸酷基轉(zhuǎn)移酶，其它基因除缺乏功能注釋的4個外，可能分別編碼巧調(diào) 蛋白、GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶sigma因子和錯定蛋白。此外，通過序列比對發(fā)現(xiàn)， GRMZM2G107508，GRMZM2G003182，GRMZM5G820632 和 GRMZM2G180172 四個預測基因在玉米 B73 基因組中存在多拷貝。為獲得突變位點，對定位區(qū)間內(nèi)的所有預測基因進行測序分析，發(fā)現(xiàn) 在GRMZM2G070304基因第一外顯子存在479bp片段缺失（圖3中B)。
[0069] 該基因包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，由3361個堿基構成，編碼一個可能的含525個 氨基酸殘基的甘油醒-3-憐酸酷基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)。因此推測片段插入導致了該基因移碼突 變，最終導致了 ms33突變表型，推測GRMZM2G070304基因即為要克隆的MS33基因。
[0070] W玉米自交系B73的基因組DNA為模板，采用引物對F1/R1進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn) 物的序列為序列表中序列2,序列2即為MS33基因在玉米基因組中的序列。提取玉米自交系 B73的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用引物對F2/R2進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物的序列為序列表 中序列3,序列3即為MS33基因的cDNA序列，其中第83-1660位為CDS。序列2和序列3均編碼序 列表中序列1所示的MS33蛋白。
[0071] F1:5 '-TTAATTGTTAGATGTGAGATAGCTAAC-3 '；
[0072] R1:5'-AATATGCGTGCAAGCACCG-3'。
[0073] F2:5 '-CTCACCAACTTGTGACTACACAATAATA-3 '；
[0074] R2:5 '-GTTGCTTCTTTACATACACATACACATA-3 '。
[00巧]實施例2、玉米ms33突變體MS33基因功能互補實驗
[0076] 為了進一步證明確認ms33突變體表型由MS33基因突變導致，本發(fā)明的發(fā)明人對另 外一個ms33等位突變系ms33-6024(即玉米突變體ms33-6024,具有同ms33-6019相同的雄性 不育性狀)進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)與野生型玉米植株一一自交系鄭58相比，ms33-6024突變 體的序列差異僅在于MS33基因編碼區(qū)第507bp堿基處插入2個堿基，因而導致移碼突變，翻 譯提前終止(圖3中B)。
[0077] 同時，本發(fā)明的發(fā)明人在自行開發(fā)的MuDR突變體庫中篩選到一個新的ms33突變體 等位系sal。將來自ms33-6019等位系的雜合可育株(+/ms33)花粉授給sal純合不育株，雜交 后代分別在北京和海南種植，觀察育性表型。結果發(fā)現(xiàn)雜交后代群體表現(xiàn)出1:1的育性分 離。該結果一方面說明，通過雜交的方式使sal純合不育株獲得正常的可育雄配子體（即 MS33基因通過雜交的方式被導入sal純合不育株)后，sal突變體的雄性不育性狀是可W回 復為雄性可育的，即MS33基因可W互補ms33突變體的雄性育性表型。另一方面，說明sal是 ms33的新等位系（圖4)。進一步的基因組測序發(fā)現(xiàn)，與野生型玉米植株相比，sal突變體的序 列差異僅在于MS33基因第二外顯子含有一個247bp的DM片段插入，導致該基因失活（圖3中 B)。
[0078] W上結果已充分說明，ms33突變體的雄性不育表型是由MS33基因突變導致，向 ms33突變體中轉(zhuǎn)入MS33基因可W互補ms33突變體的雄性育性表型。
[0079] 實施例3、MS33基因在各器官中的表達分析
[0080] 為進一步細致研究MS33基因的功能，本發(fā)明的發(fā)明人提取了野生型玉米植株（自 交系鄭58)不同器官(根、莖、葉和不同發(fā)育時期的花藥，即性母細胞期、四分體期、單核抱子 期、二核抱子期、成熟花粉期）的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用巧光定量PCR檢測MS33基因在不同 組織中的表達情況。其中，用于檢測MS33基因的引物為MS33-F和MS33-R; W玉米Aciton為內(nèi) 參，其檢測引物為Actin-F和Actin-R。
[0081 ] MS33-F:5 '-TCTGCGTCACTGCCATGC-3 '；
[0082] MS33-R:5 '-CGTCGGAGCTCACCACG-3 '。
[0083] Actin-F:5 '-GAGATGCCTGATGGTCAGGTCA-3 '；
[0084] Actin-R:5 '-AGTTGTACGTGGCCTCATGGAC-3 '。
[0085] 結果顯示:MS33基因在成熟根中表達較高，在葉片和莖中表達較低。然而，隨著花 藥發(fā)育的進行，MS33基因表達量逐步升高，在單核期花藥中達到最高，隨后開始下降（圖5中 A)。
[0086] 隨后，采用RNA原位雜交技術檢測MS33在花藥不同組織中的表達分布情況。
[0087] 反義檢測探針：
[0088] ms33_SP6：GATTTAGGTGACACTATAGAATGCTATGGCCAAGAAGAGGCTCC；
[0089] ms33_T7:TGTAATACGACTCACTATAGGGACGTCCTCCATGAGCCACTTG。
[0090] 正義對照探針：
[0091] ms33_SP6：GATTTAGGTGACACTATAGAATGCTTTGGGCAGCACGGCGCGGC；
[0092] ms33_T7:TGTAATACGACTCACTATAGGG TCCTCCTACTAGCGCACAAGA。
[0093] 結果顯示：從前減數(shù)分裂期到而二核花粉期，MS33基因信號主要出現(xiàn)在花藥絨拉 層細胞中。時空表達特性表明，MS33基因在花藥絨拉層細胞中發(fā)揮作用，并對小抱子發(fā)育具 有十分重要的作用。
[0094] 實施例4、ms33突變體植株與恢復系雜交分析
[0095] 根據(jù)前文遺傳分析得到的結果，W及雄性核不育突變體的特征，可知任何野生型 玉米自交系都可作為ms33突變體不育系的恢復系材料;雜合性植株(+/ms33)可W用作恢復 系給ms33不育系授粉，其后代群體產(chǎn)生1:1比例的不育系(ms33/ms33)和恢復系(+/ms33)材 料。
[0096] 實施例5、MS33基因編碼蛋白與水稻，大麥，高梁基因組中預測的同源蛋白的序列 比對
[0097] 本發(fā)明的發(fā)明人隨后利用玉米MS33基因得到氨基酸序列(序列1)在NCBI數(shù)據(jù)庫進 行化AST檢索，獲得了其在水稻，高梁，大麥，小麥，谷子和二穗短柄草中的同源蛋白序列進 行多重比對，并繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹。結果發(fā)現(xiàn)，玉米MS33基因在氨基酸水平上與它在高梁中 的同源基因相似度最高，達到81%;與水稻同源基因相似度為69%;而與小麥和大麥同源基 因相似度最低（圖6,圖7)。
【主權項】
1. 蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且 與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。3. 根據(jù)權利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為編碼權利要求1所述 蛋白質(zhì)的基因，所述基因為如下1)_5)中任一的DNA分子： 1) 序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 序列表中序列3所示的DNA分子； 3) 序列表中序列3的第83-1660位所示的DNA分子； 4) 在嚴格條件下與1 )_3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與植物雄性育性相關的由 序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子； 5) 與1)_4)中任一限定的DNA序列具有90%以上同一性，且編碼與植物雄性育性相關的 由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物。5. 根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組 克隆載體。6. 權利要求1所述蛋白質(zhì)或權利要求2或3所述核酸分子或權利要求4或5所述的重組載 體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物在如下任一中的應用： (a) 植物育種； (b) 調(diào)控植物雄性育性； (c) 維持花藥絨氈層細胞形態(tài)和/或功能。7. 培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下(A)或(B): (A) 培育雄性可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： (al)向雄性不育的受體植物中導入權利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達所述 編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物;所述受體植物的雄性不育性狀是由于所述受體植物表達有功能的 權利要求1所述蛋白質(zhì)的能力喪失或降低引起的； (a2)從步驟(al)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性可育的轉(zhuǎn)基因植物； (B) 培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： (bl)抑制雄性可育的受體植物中權利要求1所述蛋白質(zhì)的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物； (b2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。8. 根據(jù)權利要求6所述的應用或權利要求7所述的方法，其特征在于:所述植物為單子 葉植物或雙子葉植物。9. 根據(jù)權利要求8所述的應用或方法，其特征在于:所述單子葉植物為禾本科植物。10. 根據(jù)權利要求9所述的應用或方法，其特征在于:所述禾本科植物為玉米。
【文檔編號】A01H5/00GK106047830SQ201610471146
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】金危危, 張磊, 羅紅兵, 陳曉陽, 趙悅
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學