專利名稱：一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種兩步法鹽析純化重組絲 蛋白的方法。
背景技術(shù)：
桑蠶絲除了作為紡織原料外，由于其優(yōu)越的力學(xué)性能和相對良好的生 物相容性，近年來，以絲素蛋白為基材的各種細胞生長支架材料的研究應(yīng) 運而生，成為組織工程中的一個熱門研究領(lǐng)域。桑蠶絲素蛋白的分子一級
結(jié)構(gòu)具有高度的重復(fù)性，其中70y。由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser氨基酸序列 組成，是絲素蛋白結(jié)晶區(qū)域的主要構(gòu)成單元，為蠶絲蛋白提供良好的熱穩(wěn) 定性、強度和彈性模量；而Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr 、 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Val-Gly-Tyr等序列組成絲素蛋白的半結(jié)晶區(qū)，為蠶 絲蛋白提供良好的伸展能力和彈性。隨著對桑蠶絲素蛋白的基因和分子結(jié) 構(gòu)的深入研究，利用基因重組方法來合成類絲狀蛋白質(zhì)材料已經(jīng)成為了可 能。專利號為200610049415.3，名稱為"一種重組動物絲-RGD融合蛋白及 其生物合成方法"發(fā)明專利制得了重組動物絲一RGD融合蛋白SEQ ID NO: 1。 由于重組絲蛋白的后續(xù)應(yīng)用開發(fā)需要大量且具有一定純度的原料，而 外源基因在表達過程中必然伴有宿主以及其它基因的表達，所以從多種雜 蛋白體系中純化出目的融合蛋白顯得尤其重要，而采用親和層析雖然可以 制得高純度的重組蛋白，但工藝復(fù)雜，成本高且不適于大量制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供工藝簡單、成本低、操作方便的一種兩步法鹽析 純化重組絲蛋白的方法，該方法包括下列步驟(1) 將含有目的基因表達質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)表 達后，離心收集菌體，將其重懸于裂解緩沖液中，冰浴并超聲波破碎后， 離心收集上清，調(diào)節(jié)pH至6.0后，添加(朋4)2304至20%飽和度，并于37°C 靜置2小時后離心收集上清液；
(2) 將步驟(1)所得的上清液調(diào)至pH6.0，添加(NH4)2S04至40X飽 和度，并于37。C靜置2小時后離心收集沉淀，經(jīng)過真空干燥后得重組絲蛋 白粉末。
步驟(1)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)，其所用的發(fā)酵培養(yǎng)基是TB液體培養(yǎng)基。 步驟(1)中所述的IPTG的濃度是1 mM，誘導(dǎo)時間4小時。 步驟(1)中所述的誘導(dǎo)表達后離心收集菌體，其離心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
步驟(l)中所述的裂解緩沖液是pH8.0， 50mmol/LNaH2P04， 300mmol/L NaCl， 10咖ol/L咪唑。
步驟(1)中所述的超聲波破碎后離心是4。C， 14500 rpm， 10 min。 步驟(1)中所述的調(diào)節(jié)pH是用HC1和1N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值。 步驟(l)中所述的37。C靜置2小時后離心是4。C， 12000 rpm， 20min。 步驟(2)中所述的離心是4T:， 12000 rpm， 20 min。
本發(fā)明的有益之處在于，本發(fā)明的方法制備的每升培養(yǎng)基可以生產(chǎn)重 組絲蛋白lg左右，與現(xiàn)有技術(shù)(對照例)相比，提高20倍，大大提高了 重組蛋白的生產(chǎn)效率。


圖1分別為本發(fā)明實施例和對照例中重組絲蛋白的十二烷基硫酸鈉一 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)照片。
圖1中1泳道一蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2泳道一對照例中的重組絲蛋白， 分子量為22 KD; 3泳道一實施例中的重組絲蛋白，分子量為22 KD。
具體實施例方式
4下面結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 實施例
(1) 將含有目的基因(對應(yīng)的氨基酸序列為n個SEQ ID NO: 1)的 表達質(zhì)粒(pET30a(+)-SilkRGD(n)，具體參考專利200610049415. 3，名稱 為"一種重組動物絲-RGD融合蛋白及其生物合成方法")的大腸桿菌在1L TB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)0. 5小時，并經(jīng)IPTG (1 mM)誘導(dǎo)表達4小時后， 離心(4'C， 8000 rpm， 20 min)收集菌體，將菌體重懸于裂解緩沖液(pH 8.0， 50簡1/L NaH2P04 , 300 mmol/L NaCl， 10 mmol/L咪唑)中，冰浴 并超聲波破碎，離心(4°C， 14500 rpm， 10 min)收集上清，用HC1和1N Na0H溶液調(diào)節(jié)pH至6.0后，添加(NH4) 2304至20%飽和度，并于37。C靜置 2小時后離心(4°C， 12000 rpm， 20 min)收集上清液；
(2) 用HC1和1N NaOH溶液調(diào)節(jié)步驟(1)所得上清液的pH至6. 0， 添加(朋4)2S04至40%飽和度，并于37T靜置2小時后離心(4。C ， 12000 rpm， 20 min)收集沉淀，經(jīng)過真空干燥后得l g重組絲蛋白粉末。
對照例
為獲取高純度重組蛋白的親和層析法。
將含有目的基因表達質(zhì)粒的大腸桿菌(取與實施例1相同情況下的大 腸桿菌)在1L TB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)0. 5小時，并經(jīng)IPTG IPTG (1 mM) 誘導(dǎo)表達4小時后，離心(4°C, 8000 rpm， 20 min)收集菌體，將菌體重 懸于裂解緩沖液(pH8. 0， 50mmol/LNaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 10iranol/L 咪唑)中，冰浴并超聲波破碎，，離心(4"C， 14500 rpm， 10 min)收集上 清后，上樣于Ni-NTA柱(購自德國QIAGEN公司)，用相同柱床體積的洗滌 緩沖液(pH 8. 0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L咪唑) 洗柱3次，最后用同樣柱體積的洗脫緩沖液(pH8.0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 250 mmol/L咪唑)洗脫，收集含目的蛋白的洗脫溶液， 將洗脫溶液放入透析袋中，于4。C下透析三天，冷凍干燥后得60 mg重組 絲蛋白粉末。
實施例結(jié)合圖1:圖1分別為本發(fā)明實施例和對照例中制備的重組絲蛋白的SDS-PAGE圖。圖l中l(wèi)泳道一蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2泳道一對照 例中的重組絲蛋白，分子量為22KD; 3泳道一實施例中的重組絲蛋白，分 子量為22 KD。采用兩步法鹽析純化能夠得到純度較高的重組絲蛋白。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯 然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本 發(fā)明的保護范圍。序列表
SEQ ID NO 1:
15 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 30 Pro Gly Val Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 40 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ala Ser
權(quán)利要求
1、一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法，其特征在于包括步驟如下(1)將含有目的基因表達質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)表達后，離心收集菌體，將其重懸于裂解緩沖液中，冰浴并超聲波破碎后，離心收集上清，調(diào)節(jié)pH至6.0后，添加(NH4)2SO4至20％飽和度，并于37℃靜置2小時后離心收集上清液；(2)將步驟(1)所得的上清液調(diào)至pH6.0，添加(NH4)2SO4至40％飽和度，并于37℃靜置2小時后離心收集沉淀，經(jīng)過真空干燥后得重組絲蛋白粉末。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)， 其所用的發(fā)酵培養(yǎng)基是TB液體培養(yǎng)基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的IPTG的 濃度是l mM，誘導(dǎo)時間4小時。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的誘導(dǎo)表達 后離心收集菌體，其離心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的裂解緩沖 液是pH 8.0， 50 ramol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的超聲波破 碎后離心是4。C， 14500 rpm， 10 min。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的調(diào)節(jié)pH 是用HC1和1N Na0H溶液調(diào)節(jié)pH值。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的37。C靜 置2小時后離心是4。C, 12000 rpm， 20 min。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的離心是4°C， 12000 rpm， 20 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法，(1)將含有目的基因表達質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)表達后，離心收集菌體，將其重懸于裂解緩沖液中，冰浴并超聲波破碎后，離心收集上清，調(diào)節(jié)pH至6.0后，添加(NH₄)₂SO₄至20％飽和度，并于37℃靜置2小時后離心收集上清液；(2)將步驟(1)所得的上清液調(diào)至pH 6.0，添加(NH₄)₂SO₄至40％飽和度，并于37℃靜置2小時后離心收集沉淀，經(jīng)過真空干燥后得重組絲蛋白粉末。本發(fā)明的有益之處在于，本發(fā)明的方法制備的每升培養(yǎng)基可以生產(chǎn)重組絲蛋白1g左右，與現(xiàn)有技術(shù)(對照例)相比，提高20倍，大大提高了重組蛋白的生產(chǎn)效率。
文檔編號C12P21/02GK101487037SQ20091009619
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者吳娟紅, 吳羅杰, 姚菊明, 凱 沈, 范科杰 申請人:浙江理工大學(xué)