專利名稱：一種制備和純化重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的制備和純化病毒抗原蛋白和其它重組治療性蛋白的方法，所述蛋白是由原核或真核細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的。
背景技術(shù)：
目前，在生物技術(shù)領(lǐng)域，采用原核和真核細(xì)胞系統(tǒng)來制備各種治療性蛋白分子是一種常規(guī)的方法。該方法通過構(gòu)建合適的分子遺傳學(xué)表達(dá)系統(tǒng)并將其整合到質(zhì)粒中，在細(xì)胞的生長過程中對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)以促進(jìn)目的蛋白的產(chǎn)生，在所述細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)目的蛋白。
類似地，為了提高病毒抗原的產(chǎn)量，使用各種可增殖病毒的細(xì)胞底物(substrates)，這也是一種常規(guī)的操作。該方法中，首先大量增殖細(xì)胞，然后用需要的病毒“感染”細(xì)胞以促進(jìn)病毒的繁殖。另外，也可培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后，從培養(yǎng)物上清液中或通過細(xì)胞裂解收集病毒。
在上述的兩種方法中，然后通過濃縮、純化和適當(dāng)?shù)倪M(jìn)一步處理(如滅活或剪切<cleaved>)，根據(jù)具體情況來制備治療性的制劑或疫苗。
上述方法面臨如下挑戰(zhàn)a)以更經(jīng)濟(jì)的方式回收目的蛋白或抗原；b)對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化以去除雜質(zhì)，例如宿主細(xì)胞蛋白、培養(yǎng)基組分及所采用的方法中所使用的其它物質(zhì)；c)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行濃縮以便后續(xù)處理；d)在純化的各個(gè)階段維持蛋白的功能結(jié)構(gòu)和活性，并且保持回收的效率；e)根據(jù)該方法最終制備出來的具有治療價(jià)值的制劑與對(duì)照產(chǎn)物相比，具有相同或更好的效果。
為了達(dá)到上述目的，人們采用了各種各樣的方法。重組分子可以在酵母例如Sacharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或大腸桿菌以及其他生物中以異源蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。許多生物藥物和其它多肽，例如乙型肝炎抗原、胰島素、溶栓酶、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoeitin)、人生長激素，都已經(jīng)通過重組DNA技術(shù)制備得到。純化表達(dá)宿主的培養(yǎng)物，獲得產(chǎn)物即表達(dá)的蛋白。類似地，通過不同類型的初級(jí)或連續(xù)細(xì)胞系的培養(yǎng)物，也可以制備若干種病毒疫苗。與疫苗的制備相類似，增殖后的病毒要經(jīng)過適當(dāng)?shù)丶兓?、濃縮和滅活/或使用。
通常的純化步驟有澄清、離心、過濾和超濾、硫酸銨沉淀、硅珠的使用、連續(xù)離心、速率區(qū)帶梯度離心(rate zonal gradient centrifugation)、各種色譜方法例如凝膠滲透(gel permeation)、體積排阻(size exclusion)、親和色譜以及離子交換等。上述純化方法的缺點(diǎn)在于步驟繁瑣，產(chǎn)物損耗，設(shè)備和耗材昂貴，有時(shí)要使用氯化銫等有毒物質(zhì)，有的方法由于下游步驟費(fèi)用昂貴導(dǎo)致實(shí)際上無法獲得產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的描述，在大腸桿菌、酵母、真核細(xì)胞等載體中表達(dá)重組蛋白，通過使用HIMAX方法提取和純化。應(yīng)當(dāng)理解，“HIMAX”由本發(fā)明人定義，僅僅針對(duì)下面描述的本發(fā)明方法而言。
發(fā)明目的本發(fā)明目的之一是提供一種使用HIMAX方法從載體中制備和純化重組蛋白的方法；本發(fā)明目的之二是制備一種高純度且不喪失其生物活性的重組蛋白；本發(fā)明目的之三是在重組蛋白的制備過程中，使得核酸或可能的其它雜質(zhì)的干擾可以忽略不計(jì)；本發(fā)明目的之四是提供一種同時(shí)濃縮和純化各種重組蛋白、病毒抗原和生物藥劑分子的方法；本發(fā)明目的之五是提供一種省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的蛋白純化方法；本發(fā)明目的之六是提供一種從細(xì)胞裂解產(chǎn)物和液體(fluid)中純化活的并且滅活了的病毒抗原的方法；本發(fā)明目的之七是結(jié)合使用Zn、Ca、Mg等二價(jià)陽離子與醋酸鹽、磷酸鹽和氯化物等陰離子，來純化重組蛋白。
因此，本發(fā)明涉及一種制備和純化如病毒抗原、其它重組治療性蛋白的方法，其特征在于所述純化是通過這里所描述的一種稱為HIMAX的新方法來完成的，然后回收所述蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如下方法和純化過程(a)在無去垢劑的條件下裂解載體細(xì)胞，獲得細(xì)胞裂解物；(b)在1000g至10,000g之間對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行離心；(c)通過傾析(decantation)從步驟(b)中獲得固形物，所述的固形物包含所述蛋白；(d)在pH值為6-7.5的緩沖液中懸浮所述的固形物；最好用本發(fā)明描述的去垢劑進(jìn)行處理以溶解(solubulize)可能存在的微量雜質(zhì)；(e)作為HIMAX技術(shù)的一部分，所述的蛋白質(zhì)被加入的濃度為0.2％-10％的二價(jià)離子鹽所捕獲而形成不溶性的基質(zhì)(matrix)，所述二價(jià)離子鹽的陰離子為硫酸鹽、氯化物和/或醋酸鹽；(f)將所述不溶性基質(zhì)離心，最好形成顆粒；(g)用pH值8.0-8.5的Tris緩沖液或pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris緩沖液重復(fù)進(jìn)行解吸附步驟，從不溶性的基質(zhì)/顆粒中釋放出被結(jié)合的抗原；(h)最后，通過超濾、硅膠色譜、疏水和/或親和色譜、離子交換、滲濾(diafiltration)、無菌過濾或綜合上述方法回收所述蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及類毒素的制備和純化，例如白喉和破傷風(fēng)類毒素。
發(fā)明詳述下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述a)通過重組表達(dá)或在適宜的組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法獲得目的蛋白，然后通過細(xì)胞裂解、去除細(xì)胞殘片和澄清等各種步驟獲得澄清的收獲物；b)用HIMAX方法對(duì)蛋白或抗原進(jìn)行初級(jí)捕獲。簡單地說，該方法包括加入濃度為0.2％-10％的二價(jià)離子鹽形成不溶性的基質(zhì)，所述二價(jià)離子鹽的陰離子為硫酸鹽、氯化物和/或醋酸鹽；然后，將得到的不溶性基質(zhì)進(jìn)行慢速離心以分離被結(jié)合的抗原物質(zhì)；然后用pH值8.0-8.5的Tris緩沖液或pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris緩沖液對(duì)獲得的顆粒重復(fù)進(jìn)行解吸附步驟；c)進(jìn)一步處理含有目的抗原的解吸附后得到的物質(zhì)。在病毒抗原的情況下，所述的處理可以包括色譜(離子交換)后的滅活步驟；在其它抗原的情況下，可直接對(duì)解吸附后得到的物質(zhì)進(jìn)行色譜純化以獲得高純度的蛋白；d)收集色譜純化后的含有目的蛋白的部分，即可獲得批量的最終產(chǎn)物，然后進(jìn)行滲濾；和e)或無菌過濾。
下面的一些重組蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白的實(shí)施例，更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的上述步驟。
本發(fā)明所描述的實(shí)施例只是為了詳細(xì)描述的目的，并不表明本發(fā)明受限于這些描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┑母鞣N選擇方案，雖然沒有在本發(fā)明說明書中進(jìn)行描述，但是也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例I通過重組方法制備乙肝病毒抗原對(duì)發(fā)酵后的細(xì)胞裂解物進(jìn)行離心，用去垢劑處理不溶性部分。離心后的上清用高度分散的硅膠(Aerosil)吸附和解吸附(傳統(tǒng)技術(shù))(如表1所示)；或者在硫酸鹽、氯化物或醋酸鹽存在的條件下，加入0.2％至10％(w/v)二價(jià)陽離子如鈣、鎂或鋅，形成白色不溶性的基質(zhì)，采用分批法初級(jí)捕獲HbsAg。原位形成的基質(zhì)進(jìn)一步與抗原相互作用，這種捕獲蛋白的方法稱為HIMAX方法(表20)。然后，在7000g至10,000g之間離心分離該基質(zhì)，用pH值為8.5的緩沖液對(duì)結(jié)合的抗原重復(fù)進(jìn)行解吸附。解吸附后進(jìn)一步用陰離子交換基質(zhì)即DEAE進(jìn)行純化。
表I和表II中給出了所有中間步驟中HbsAg的活性。
在另一方法中，在硫酸鹽、氯化物和醋酸鹽存在的條件下，用濃度為0.2至10％的陽離子直接對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗原初級(jí)捕獲。所有的后續(xù)步驟與前述步驟類似。
表III給出了所有中間步驟中HbsAg的活性。
采用HIMAX方法制備HbsAg的流程圖

表I 純化乙型肝炎抗原的傳統(tǒng)方法


表II 采用HIMAX方法純化乙型肝炎抗原

表III 采用HIMAX方法純化乙型肝炎抗原

表2和表3的主要區(qū)別在于去垢劑的使用在表2中，用去垢劑處理不溶性部分，然后進(jìn)行吸附和解吸附處理；而在表3的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞裂解物直接通過HIMAX方法進(jìn)行吸附和解吸附。
實(shí)施例II
通過細(xì)胞培養(yǎng)方法制備狂犬病病毒抗原(圖2)通過大規(guī)模病毒培養(yǎng)，從培養(yǎng)上清液中收集狂犬病病毒。在傳統(tǒng)方法中，將收集到的病毒通過超濾進(jìn)行濃縮，然后采用連續(xù)地或分批地蔗糖梯度超速離心進(jìn)行純化。而在本發(fā)明中，首先采用HIMAX方法即加入如鈣、鎂或鋅的二價(jià)陽離子鹽使最終濃度提高8-10倍(W/V)，以形成可進(jìn)一步相互作用的白色不溶性基質(zhì)，用來分批初級(jí)捕獲狂犬病病毒抗原，對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化。原位形成的基質(zhì)進(jìn)一步與抗原相互作用，這種蛋白捕獲的方法就稱為HIMAX方法。然后，在7000g至10,000g之間離心分離該基質(zhì)，用pH值為7.2的含有EDTA的Tris緩沖液對(duì)結(jié)合的抗原重復(fù)進(jìn)行解吸附。
然后，用常規(guī)方法對(duì)獲得的濃縮抗原進(jìn)行滅活，用陰離子交換基質(zhì)進(jìn)一步純化，獲得純化的狂犬病病毒抗原。然后像疫苗那樣，對(duì)抗原進(jìn)行滲濾和攪拌。
表IV給出了HIMAX方法所有中間步驟中狂犬病病毒抗原的純化產(chǎn)率。
用HIMAX方法制備狂犬病疫苗的流程圖
表IV HIMAX法純化的狂犬病病毒抗原

實(shí)施例III通過細(xì)胞培養(yǎng)方法制備甲型肝炎病毒抗原通過大規(guī)模病毒培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中收集與細(xì)胞結(jié)合的甲型肝炎病毒。在傳統(tǒng)方法中，收集澄清的以細(xì)胞裂解物形式存在的病毒，滅活，再采用連續(xù)地或分批地蔗糖梯度超速離心進(jìn)行純化。而在本發(fā)明中，首先采用HIMAX方法即加入如鈣、鎂或鋅的二價(jià)陽離子鹽使得最終濃度提高8-10倍(W/V)，以形成可進(jìn)一步相互作用的白色不溶性基質(zhì)，分批初級(jí)地捕獲甲型肝炎病毒抗原，對(duì)培養(yǎng)裂解物中的抗原進(jìn)行純化。原位形成的基質(zhì)進(jìn)一步與抗原相互作用，這種蛋白捕獲的方法就稱為HIMAX方法。然后，在7000g至10,000g之間離心分離該基質(zhì)，并用pH值為7.2的含有EDTA的Tris緩沖液對(duì)結(jié)合的抗原重復(fù)進(jìn)行解吸附。
然后用常規(guī)方法對(duì)獲得的濃縮抗原進(jìn)行滅活，用陰離子交換基質(zhì)進(jìn)一步純化，獲得純化的甲型肝炎病毒抗原。然后像疫苗那樣，對(duì)抗原進(jìn)行滲濾和攪拌。
表V給出了采用HIMAX方法的所有中間步驟中甲型肝炎病毒抗原的純化產(chǎn)率HIMAX法制備甲型肝炎病毒抗原的流程圖

表V HIMAX法純化的甲型肝炎病毒抗原

實(shí)施例IV白喉類毒素是來源于白喉棒桿菌培養(yǎng)物的純化蛋白。
對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行離心或過濾，然后加入0.60％的福爾馬林將上清液中的毒素轉(zhuǎn)化為類毒素。將毒素在33℃下溫育6周以轉(zhuǎn)化為類毒素。
通過動(dòng)物試驗(yàn)來證實(shí)是否已經(jīng)脫毒。在傳統(tǒng)方法中，需要對(duì)類毒素進(jìn)行濃縮、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析以及無菌過濾。通過絮凝檢測測量其活性。表VI中列出了類毒素的回收率。
在HIMAX方法對(duì)類毒素純化過程中，在硫酸鹽、氯化物或醋酸鹽存在的條件下，加入0.2％至10％(w/v)的二價(jià)陽離子鹽如Zn、Ca或Mg，形成白色不溶性的基質(zhì)，以分批的方式來捕獲類毒素。然后，在7000g至10,000g之間離心分離該基質(zhì)，用pH值為6.8-7.2的含有100-200mMEDTA的磷酸鹽緩沖液溶解結(jié)合的抗原。用SDS PAGE電泳檢測純化后樣品。
對(duì)溶液進(jìn)行超濾，0.22微米無菌過濾批樣。結(jié)果如表VII所示。
HIMAX方法制備白喉類毒素的流程圖收集的細(xì)胞↓離心/過濾↓毒素↓類毒素↓類毒素濃縮↓硫酸銨分級(jí)↓超濾↓無菌過濾表VI (純化白喉類毒素的傳統(tǒng)方法)

表VII (純化白喉類毒素的HIMAX方法)

實(shí)施例V破傷風(fēng)類病毒是來源于破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)物的純化蛋白對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行離心或過濾，加入0.40％的福爾馬林將上清液中的毒素轉(zhuǎn)化為類毒素。在轉(zhuǎn)化為類毒素的過程中需要將毒素在35℃-36℃下溫育4周。
通過動(dòng)物試驗(yàn)來證實(shí)是否已經(jīng)脫毒。在傳統(tǒng)方法中，需要對(duì)類毒素進(jìn)行濃縮、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析以及無菌過濾。通過絮凝檢測測量其活性。表VIII中列出了類毒素的回收率。
在HIMAX方法對(duì)類毒素純化過程中，在硫酸鹽、氯化物或醋酸鹽存在的條件下，加入0.2％至10％(w/v)的二價(jià)陽離子鹽如Zn、Ca或Mg，形成白色不溶性的基質(zhì)，以分批的方式來捕獲類毒素。然后在7000g至10,000g之間離心，從溶液中分離出該基質(zhì)，用pH值為6.8-7.2的含有100-200mM EDTA的磷酸鹽緩沖液溶解結(jié)合的抗原。
采用SDS電泳測試純度。
對(duì)溶液進(jìn)行超濾，0.22微米無菌過濾批樣。結(jié)果如表IX所示。
表VIII (純化破傷風(fēng)類毒素的傳統(tǒng)方法)

表IX (純化破傷風(fēng)類毒素的HIMAX方法)

權(quán)利要求
1.一種制備和純化蛋白例如病毒抗原蛋白、其他重組治療性蛋白的方法，其特征在于所述蛋白通過本發(fā)明所描述的一種稱為HIMAX的新方法進(jìn)行純化，然后回收所述的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白在載體例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)，所述的真核細(xì)胞例如大腸桿菌、酵母等。
3.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法和純化過程包括a)在無去垢劑的條件下裂解載體細(xì)胞，獲得細(xì)胞裂解物；b)在1000g至10,000g之間對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行離心；c)通過傾析，從步驟(b)中獲得固形物，其中所述固形物中包含所述的蛋白；d)在pH值為6-7.5的緩沖液中懸浮所述的固形物；最好用本發(fā)明描述的去垢劑進(jìn)行處理以溶解可能存在的微量雜質(zhì)；e)作為HIMAX技術(shù)的一部分，所述的蛋白被加入的濃度為0.2％-10％的二價(jià)離子鹽所捕獲而形成不溶性的基質(zhì)，所述二價(jià)陽離子鹽的陰離子為硫酸鹽、氯化物和/或醋酸鹽；f)將所述的不溶性基質(zhì)離心，最好形成顆粒；g)用pH值8.0-8.5的Tris緩沖液或用pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris緩沖液重復(fù)進(jìn)行解吸附步驟，從不溶性的基質(zhì)/顆粒中釋放出被結(jié)合的抗原；h)最后，通過超濾、硅膠色譜、疏水和/或親和色譜、離子交換、滲濾、無菌過濾或綜合上述方法回收所述的蛋白。
4.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的蛋白是病毒抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在解吸附(通過層析)步驟之前通過已知方法滅活病毒抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的蛋白不是病毒抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在解吸附之前不進(jìn)行滅活步驟。
8.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中收集經(jīng)過色譜純化的目的蛋白部分，進(jìn)行滲濾和/或無菌過濾。
9.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述二價(jià)陽離子優(yōu)選Zn、Ca、Mg或其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(d)中所述的去垢劑為非離子去垢劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(d)中不使用去垢劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(h)中的超濾采用截留分子量100-300K的膜過濾器。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(h)中離子交換基質(zhì)選自陰離子交換樹脂，例如硫酸纖維素/DEAE基質(zhì)。
14.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的蛋白被高度純化且不喪失生物活性。
15.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中的雜質(zhì)例如核酸片段等，不干擾/影響所述蛋白的制備和純化。
16.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中同時(shí)制備和純化病毒抗原、重組蛋白、生物治療性蛋白等。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種以蛋白或顆粒形式表達(dá)的重組蛋白的新的純化方法。在該純化方法中，通過疏水相互作用來純化蛋白。這種相互作用使該蛋白的收率和純度提高了15％－80％。經(jīng)過進(jìn)一步純化后，該蛋白可作為疫苗和藥物。
文檔編號(hào)C07K14/02GK1922201SQ200480042122
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者K·M·埃拉, S·K·威利麥都 申請(qǐng)人:伯哈拉特生物技術(shù)國際有限公司