專利名稱：重組sars冠狀病毒m蛋白的表達(dá)和純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及到重組SARS冠狀病毒M蛋白的表達(dá)和純化。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是新發(fā)現(xiàn)的傳染病[Poutanen SM，Low DE，Henry B et al.Identificationof severe acute respiratory syndrome in Canada，N Engl J Med，www.nejm.org，March 31，2003，10.1056/NEMoa 030634；Lee N，Hui D，Wu A，Chan P，Cameron P，Joynt GM，Ahuja A，et al.A major outbreakof severe acute respiratory syndrome in Hong Kong，N Engl J Med，www.nejm.org，April 7，2003，10.1056/NEJMoa 030685]。SARS冠狀病毒為導(dǎo)致該病的病原體[Peiris J，Lai S，Poon L，Guan Y，Yam LY，LimW，Nicholls J，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acuterespiratory syndrome，Lancet，2003，3611319-1325；Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，Zaki SR，Peret T，Emery S，Tong S，et al.Anovel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，NEngl J Med，www.nejm.org，April 10，2003，10.1056/NEJMoa 020781]。其基因組測(cè)序已經(jīng)完成[Rota PA，Oberste MS，Stephan S，Monroe SS，Nix WA，Campagnoli R，Icenogle JP et al.Characterizationof a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，Sciencexpress/www.scienceexpress.org/l May 2003/Page1/10.1126/science.1085952；Marra MA，Jones SJM，Astell CR，Holt RA，Brooks-Wilson A，Butterfield YSN，Khattra J et al.The genome sequenceof the SARS-associated coronavirus，Sciencexpress/www.sciencexpress.org/l May 2003/Page1/10.1126/science.1085953]。
通過對(duì)已知冠狀病毒的基因組比較，SARS病毒的M蛋白(Membrane glycoprotein)基因得到確認(rèn)。M蛋白是冠狀病毒基質(zhì)糖蛋白，由221個(gè)氨基酸構(gòu)成。分析顯示M蛋白存在三個(gè)跨膜螺旋，大致定位于15-37，50-72和77-99氨基酸。M蛋白在病毒顆粒內(nèi)部有一個(gè)121個(gè)氨基酸的親水區(qū)，被認(rèn)為是與核蛋白體相互作用的區(qū)域[7]。對(duì)已知的冠狀病毒的研究已經(jīng)證明，M蛋白在冠狀病毒的組裝和出芽中起了關(guān)鍵的作用，M蛋白與S蛋白的結(jié)合對(duì)病毒包膜的構(gòu)成是必不可少的。M蛋白還與病毒引起的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在沒有其它病毒組分的情況下，單獨(dú)的M蛋白就可以引起Hela細(xì)胞和BHK細(xì)胞的凋亡。M蛋白在病毒侵染的早期抑制寄主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄。
重組M蛋白可被用來作為抗原檢測(cè)對(duì)應(yīng)冠狀病毒的感染和制備疫苗[Kopecky SA，Lyles DS Constrasting effects of matrix proteinon apoptosis in Hela and BHK cells infected with vesicularstomatitis virus are due to inhibition of host gene expression，J Virol，2003，77(8)465 8-69；Wang LF，Gould AR，Selleck PW et alExpression of equine morbillivirus(EMV)matrix and fusionproteins and their evaluation as diagnostic reagents，Arch Virol 19971422269-2279]。但是表達(dá)M蛋白有一定難度，目前為止只有Caninecoronavirus中的M蛋白用pQE30得到了表達(dá)，且表達(dá)量很低〔Wang LF，Gould AR，Selleck PW.Expression of equine morbillivirus(EMV)matrix and fusion proteins and their evaluation as diagnostic reagents，Arch Virol，1997，1422269-2279〕。因此，高效表達(dá)和純化重組SARS病毒M蛋白是診治SARS的一個(gè)重要基礎(chǔ)，同時(shí)也是研究SARS病毒蛋白結(jié)構(gòu)的必需環(huán)節(jié)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效表達(dá)和純化重組SARS病毒M蛋白的方法，以便能夠大量生產(chǎn)供科學(xué)研究和制備疫苗的重組SARS病毒M蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供重組SARS冠狀病毒M蛋白的表達(dá)和純化的方法，以獲得大量的重組SARS病毒M蛋白。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種表達(dá)純化重組SARS病毒M蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提供SARS病毒M蛋白基因；(2)將上述M蛋白基因插入表達(dá)載體；(3)用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使表達(dá)重組SARS病毒M蛋白；
(5)分離純化步驟(4)所述的重組SARS病毒M蛋白。
在一優(yōu)選例中，步驟(1)所述基因采用反轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增。較佳的，所述PCR擴(kuò)增引物為SEQ NO3，SEQ NO4。
在另一優(yōu)選例中，步驟(2)所述表達(dá)載體選自pMAL-cRI。
在另一優(yōu)選例中，步驟(4)所述表達(dá)條件是在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體至OD值為0.6±0.2。較佳的，當(dāng)菌體的OD值為0.6±0.2時(shí)，在37±2℃下，用0.5±0.2mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2±0.5小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(4)所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
在另一優(yōu)選例中，步驟(5)所述分離純化包括用親和層析進(jìn)行純化。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為按本發(fā)明所述方法獲得的融合重組表達(dá)產(chǎn)物。
在一優(yōu)選例中，所述融合蛋白為與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白另一端融合了MxeGyrA inteinCBD。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，含有安全有效量的本發(fā)明上述的SARS病毒M蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。
在一優(yōu)選例中，本發(fā)明所述藥物組合物為疫苗組合物。所述疫苗組合物含有免疫有效量的本發(fā)明上述的SARS病毒M蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。較佳的，所述疫苗組合物還含有佐劑。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種疫苗組合物，其特征在于，含有免疫有效量的本發(fā)明上述的融合蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。較佳的，所述疫苗組合物還含有佐劑。


圖1.SDS-PAGE檢測(cè)大腸桿菌JM109(DE3)中重組表達(dá)的M蛋白1，JM109(DE3)/pMALMD，沉淀2，JM109(DE3)/pMALMD，上清3，Marker(97kD，66.2kD，43kD，31kD)4，JM109(DE3)/pMALMD，全細(xì)胞裂解液5，JM109(DE3)/pMAL-cRI，全細(xì)胞裂解液圖2.用抗CBD的抗體Western印跡檢測(cè)重組表達(dá)的M蛋白1，蛋白Marker(New England Biolab #B7709S)2，JM109(DE3)/pMALMD沉淀，未誘導(dǎo)，3，JM109(DE3)/pMALMD上清，未誘導(dǎo)4，JM109(DE3)/pMALMD沉淀，用0.5mMIPTG誘導(dǎo)5，JM109(DE3)/pMALMD上清，用0.5mMIPTG誘導(dǎo)6，JM109(DE3)/pTXB1全細(xì)胞，用0.5mMIPTG誘導(dǎo)圖3.SDS-PAGE檢測(cè)純化的重組蛋白1-5，依次為從Amylose Resin上洗脫的圖2中2-6組分；6，Marker(97kD，66kD，43kD，31kD).
圖4.重組表達(dá)的M蛋白的質(zhì)譜圖具體實(shí)施方式
為了表達(dá)M蛋白，本發(fā)明人嘗試了pQE30以及pET24a、pET32b、pGEX2T、pGEX4T、pKK233-2、pT7ZZa、pThioHisA、pTYB12等許多原核表達(dá)載體和pPIC9、pPIC3.5K、pAS2等真核表達(dá)載體，但用SDS-PAGE都沒能檢測(cè)到M蛋白的表達(dá)。最終采用pMAL-cRI構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒才獲得了表達(dá)產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，除表達(dá)載體的選擇，培養(yǎng)和表達(dá)條件外，其它工藝條件均可采用本領(lǐng)域常規(guī)條件。
SARS病毒M蛋白與S蛋白構(gòu)成了病毒最外層的結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明所表達(dá)的SARS病毒M蛋白可用于SARS疾病診治，疫苗制備和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
材料(Material)1.質(zhì)粒、菌株與培養(yǎng)基大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pMAL-cRI和pTXB1購(gòu)自New EnglandBiolabs公司。質(zhì)粒pBluescriptSK(+)，大腸桿菌宿主細(xì)胞JM109(DE3)為市售的。
培養(yǎng)E.coli時(shí)用LB培養(yǎng)基(Tryptone，10g/L；Yeast Extract，5g/L；NaCl，10g/L.pH7.0)，以表達(dá)蛋白為目的時(shí)用豐富培養(yǎng)基(Tryptone，10g/L，Yeast Extract，5g/L，NaCl，5g/L，Glucose 2g/L)。
2.試劑PCR引物由賽百盛合成，限制性內(nèi)切酶，PyrobestTMDNA聚合酶，dNTP購(gòu)自Takara公司。Anti-Chintin Binding Serum和AmyloseResin購(gòu)自New England Biolabs公司。二抗購(gòu)自Promega公司。其它試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
實(shí)施例1 SARS病毒M蛋白基因的擴(kuò)增收集SARS-CoV BJ-01(可從北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得)感染VeroE6細(xì)胞后的培養(yǎng)上清液，用Trizol試劑(Gibco)抽提病毒RNA。以隨機(jī)引物為第一鏈DNA的起始引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20ul)。最后以M基因的特異引物擴(kuò)增M基因，引物序列為引物1M15’-GGGGGATCCACCATGGCAGACAACGGTACTA-3’引物2M663r5’-GGGCTGCAGCTGTACTAGCAAAGCAATA-3’PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和PstI酶切后，插入pBluescriptSK(+)的相應(yīng)位點(diǎn)得到pBM，經(jīng)測(cè)序與已發(fā)表序列吻合。
將pBM用XbaI和EcoRI酶切，得到的片斷插入pcDNA3.1(-)mychisA的相應(yīng)位點(diǎn)得到pXM。
實(shí)施例2 表達(dá)載體的構(gòu)建1.表達(dá)載體pMALM的構(gòu)建表達(dá)載體選用pMAL-cRI，該載體為Tac啟動(dòng)子，重組表達(dá)的產(chǎn)物為N端融合了麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose Binding Protein(MBP)，約42kD)的蛋白。
用引物1和引物2以pXM為模板高保真擴(kuò)增M基因，回收PCR產(chǎn)物，與EcoRV酶切后的pBluescriptSK(+)連接，得到pSKM，再用BamHI和SalI酶切pSKM，將得到的660bp的片段與BamHI+SalI酶切后的pMAL-cRI連接，得到pMALM。
引物35’-GTGGATCC(BamHI)ATGGCAGACAACGGTACT-3’引物45’-GCTCTAGATTACTGTACTAGCAAAGC-3’2.表達(dá)載體pTXBM的構(gòu)建表達(dá)載體選用pTXB1，該載體為T7啟動(dòng)子，重組表達(dá)的產(chǎn)物為C端融合了MxeGyrA intein CBD(約26kD)的蛋白。
用引物3和引物4以質(zhì)粒pBM為模板PCR擴(kuò)增M基因，NdeI和XhoI酶切PCR產(chǎn)物，與NdeI+XhoI酶切后的pTXB1連接，得到pTXBM。
引物55’-GGAATTCCATATG(NdeI)GCAGACAACGGTACT-3’引物65’-AGACCTCGAG(XhoI)CTGATACTAGCAAAGCAATA-3’3.表達(dá)載體pMALMD的構(gòu)建用引物5和引物6以pTXBM為模板，PCR擴(kuò)增得到C端融合了Mxe intein CBD蛋白基因的M基因，用XbaI和PstI分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMAL-cRI，連接，得到pMALMD。
引物75’-AAACTGCAG(PstI)TCATTGAAGCTGCCACAAGGCAG-3’引物85’-TGCTCTAGA(XbaI)ATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3’實(shí)施例3 M蛋白的表達(dá)當(dāng)含表達(dá)載體的菌體的OD值為0.6時(shí)，用0.5mM IPTG誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)2小時(shí)。離心收集菌體，懸浮于適量的細(xì)胞破碎液(20mMTris-HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，并用超聲波破碎細(xì)胞。細(xì)胞粗提液通過SDS-PAGE及Gel Scan 4.0軟件掃描分析。
討論1.pMALM在大腸桿菌中的表達(dá)和M蛋白的溶菌現(xiàn)象將含有M蛋白基因的質(zhì)粒pMALM轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞JM109(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。有趣的是，含pMALM的表達(dá)細(xì)胞在加入IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞被裂解(OD600降低到0.3以下)，而不加入IPTG時(shí)細(xì)胞正常生長(zhǎng)，這暗示溶菌現(xiàn)象可能與IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)相關(guān)。將溶菌后的上清取3ul加入到另一個(gè)新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中，菌能正常生長(zhǎng)。因?yàn)槭删w能在菌中自我繁殖，微量的噬菌體會(huì)在菌中大量繁殖，使菌體裂解，而M蛋白不能自我繁殖，當(dāng)其被轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中時(shí)量不會(huì)增加，極微量的M蛋白不能引起菌體裂解。這說明溶菌的原因不是噬菌體，而可能是表達(dá)的M蛋白。
M蛋白引起大腸桿菌細(xì)胞死亡的原因目前還不清楚，也許它像其它冠狀病毒中的M蛋白一樣，具有出芽功能，在出芽的過程中引起大腸桿菌細(xì)胞膜的裂解，從而引起細(xì)胞死亡；或者它可以抑制大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
2.pTXBM的表達(dá)由于質(zhì)粒pMAL-cRI的多克隆位點(diǎn)之前有一段42kD的融合蛋白，因此含pMALM的表達(dá)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白應(yīng)該是N端融合了該蛋白的M蛋白，溶菌現(xiàn)象表明此時(shí)M蛋白可能依然有出芽功能。因此如果融合蛋白在M蛋白的C端，也許可以改變蛋白的折疊情況，使M蛋白不再具有出芽功能，菌體就不會(huì)被裂解，使M蛋白有可能得到高表達(dá)。因此構(gòu)建了pTXBM。
然而，實(shí)驗(yàn)表明pTXBM不能在大腸桿菌中得到高表達(dá)。這說明M蛋白的成功表達(dá)不僅依賴于融合蛋白，還與所用的表達(dá)載體的特性有關(guān)。
3.pMALMD的表達(dá)由于pMALM表達(dá)時(shí)有溶菌現(xiàn)象，而pTXBM又不能在大腸桿菌中高表達(dá)，因此構(gòu)建了，希望通過在M蛋白的N端和C端都融合蛋白，抑制M蛋白的溶菌現(xiàn)象，從而使M得到高表達(dá)。
含pMALMD的表達(dá)細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約93kD處獲得一新蛋白(圖1)，該蛋白大小與估算的重組表達(dá)的M蛋白分子量相當(dāng)。
實(shí)施例4 M蛋白的純化和免疫印跡檢測(cè)pMALMD的表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)New England Biolabs公司的蛋白純化手冊(cè)，用Amylose Resin進(jìn)行純化。
免疫印跡檢測(cè)根據(jù)Promega公司的《The Source for Discovery》第三版中提供的方法操作。重組表達(dá)的蛋白用抗融合蛋白Mxe inteinCBD的抗體Anti-CBD serum進(jìn)行了Western檢測(cè)(圖2)。
含pMALMD的表達(dá)細(xì)胞粗抽提液可溶性部分經(jīng)Amylose Resin得到初步純化(圖3)。重組蛋白純化后伴隨著一條約48kD左右的條帶，這是因?yàn)榇竽c桿菌自身的MBP也可以與Amylose Resin結(jié)合。豐富培養(yǎng)基中的葡萄糖可以在一定程度上抑制大腸桿菌自身MBP的表達(dá)，從而降低純化蛋白中MBP的比例。表達(dá)量占菌體蛋白的26％。
實(shí)施例5 M蛋白的質(zhì)譜鑒定重組表達(dá)的蛋白經(jīng)中科院上海生命科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究分析中心進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白確實(shí)是M蛋白。測(cè)試主要參數(shù)如下檢測(cè)方式為正離子，進(jìn)樣方式為Normal spray，毛細(xì)管溫度為200度，Column為8mm×150mm(RP-18)，掃描范圍為400-2000KDAL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。
因?yàn)镸蛋白的活性難以檢測(cè)，因此需用質(zhì)譜對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行確證。質(zhì)譜鑒定出重組蛋白中含EITVTSRE、CDIKDLPK以及VGTDSGFAAYNR等3條肽段，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)表明，這3條肽段都是M蛋白(putativeprotein M)中的片段，占該蛋白分子量的12.09％，氨基酸組成的12.67％，因此鑒定為putative protein M中的片段。這說明重組融合蛋白中確實(shí)含有M蛋白。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>重組SARS冠狀病毒M蛋白的表達(dá)和純化<130>030829<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>663<212>DNA<213>SARS病毒<400>1atggcagaca acggtactat taccgttgag gagcttaaac aactcctgga acaatggaac60ctagtaatag gtttcctatt cctagcctgg attatgttac tacaatttgc ctattctaat120cggaacaggt ttttgtacat aataaagctt gttttcctct ggctcttgtg gccagtaaca180cttgcttgtt ttgtgcttgc tgctgtctac agaattaatt gggtgactgg cgggattgcg240
attgcaatgg cttgtattgt aggcttgatg tggcttagct acttcgttgc ttccttcagg300ctgtttgctc gtacccgctc aatgtggtca ttcaacccag aaacaaacat tcttctcaat360gtgcctctcc gggggacaat tgtgaccaga ccgctcatgg aaagtgaact tgtcattggt420gctgtgatca ttcgtggtca cttgcgaatg gccggacact ccctagggcg ctgtgacatt480aaggacctgc caaaagagat cactgtggct acatcacgaa cgctttctta ttacaaatta540ggagcgtcgc agcgtgtagg cactgattca ggttttgctg catacaaccg ctaccgtatt600ggaaactata aattaaatac agaccacgcc ggtagcaacg acaatattgc tttgctagta660cag 663<210>2<211>221<212>PRT<213>SARS病毒<400>2Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu15 10 15Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met20 25 30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile35 40 45Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe50 55 60Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala65 70 75 80Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val85 90 95Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn100 105 110Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val115 120 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile130 135 140Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile145 150 155 160Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser165 170 175Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe180 185 190Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp195 200 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln210 215 220<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>引物<400>3gggggatccaccatggcagacaacggtacta31<210>4<211>28<212>DNA
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<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>引物
<400>5gtggatccat ggcagacaac ggtact26<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物<400>8tgctctagaa tggcagacaa cggtactatt ac3權(quán)利要求
1.一種表達(dá)純化重組SARS病毒M蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提供SARS病毒M蛋白基因；(2)將上述M蛋白基因插入表達(dá)載體；(3)用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟(3)所述宿主細(xì)胞，使表達(dá)重組SARS病毒M蛋白；(5)分離純化步驟(4)所述的重組SARS病毒M蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述表達(dá)載體選自pMAL-cRI載體。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(4)所述表達(dá)條件是在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體至OD值為0.6±0.2。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述表達(dá)條件是當(dāng)菌體的OD值為0.6±0.2時(shí)，在37±2℃下，用0.5±0.2mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2±0.5小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述分離純化包括用親和層析進(jìn)行純化。
7.一種融合蛋白，其特征在于，按權(quán)利要求1所述方法獲得的融合重組表達(dá)產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為SARS病毒M蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白另一端融合了MxeGyrA intein CBD。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的SARS病毒M蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組SARS冠狀病毒M蛋白的表達(dá)和純化方法。本發(fā)明人將SARS冠狀病毒M基因克隆到不同的菌體表達(dá)載體中表達(dá)。結(jié)果，M蛋白在大腸桿菌中得到高度表達(dá)，經(jīng)親和層析純化得到重組SARS冠狀病毒M蛋白，所表達(dá)的蛋白占菌體總量的26％。本發(fā)明表達(dá)的重組SARS冠狀病毒M蛋白可用于SARS診治、結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和疫苗制備等。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1597964SQ03159428
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2003年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 張曉麗, 王晶茹, 謝幼華, 汪垣, 楊晟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院