專利名稱：：番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蔬菜抗病育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其屬于一種用于番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇的方法。
背景技術(shù)：
：番茄a(bǔ)yco^ra/cw7eycw/ewft/mMi11.)是世界上重要的蔬菜作物。它品種多，產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，用途廣泛。限制番茄生產(chǎn)發(fā)展和產(chǎn)量的主要原因在于病害的流行危害和逆境條件的制約。番茄黃化曲葉病毒病(TYLCVD)是限制番茄生產(chǎn)的重要病害之一，該病害是由雙生病毒科(Gem/"/v/n^^)菜豆金色花葉病毒屬(Segomov,my)的番琉黃化曲葉病毒(7b附ato_y￡〃cwcwr/.v/ms，TYLCV)引起的，并通過煙粉虱(fiem/s/atokcO傳播，早在19世紀(jì)60年代，以色列等國(guó)就有報(bào)道。隨著全球氣候的變化、農(nóng)業(yè)耕作制度的改變、國(guó)際貿(mào)易活動(dòng)的迅速加強(qiáng)和煙粉虱介體在世界各地空前擴(kuò)展，TYLCVD在世界范圍內(nèi)大面積爆發(fā)流行，在番茄生產(chǎn)上引起嚴(yán)重危害，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，至少已有39個(gè)國(guó)家的番茄正在遭受此類病毒的毀滅性危害。自20世紀(jì)90年代起，我國(guó)的浙江、山東、上海、廣西、云南、江蘇、河南、廣東、福建、海南和臺(tái)灣等地也相繼在番茄上發(fā)現(xiàn)有雙生病毒的危害。番茄黃化曲葉病毒病在首次暴發(fā)后，數(shù)年內(nèi)便迅速蔓延開來并導(dǎo)致大暴發(fā)，故須立即采取措施進(jìn)行積極有效的防控，其中防治該番茄黃化曲葉病毒病最有效的途徑就是培育優(yōu)良的抗病品種。傳統(tǒng)的抗病育種主要是通過抗性鑒定與植株表型選擇來進(jìn)行，但這種方法不僅需要育種家具有豐富的育種經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也還存在有諸如工作量大、周期長(zhǎng)、易受環(huán)境條件的影響、育種效率低等的限制因素。分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection,MAS)是一禾中通過分析與該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記有否存在，從而來確定該基因是否存在的一種方法。這種間接的選擇方法不受環(huán)境條件的限制，并在育種早期世代材料的苗期階段即可實(shí)現(xiàn)，這既大大減少了工作量，又加快了育種的進(jìn)程，從而明顯提高了抗該病害品種的育種效率。以往的研究表明，在番茄普通栽培種(Z_ycopers/co"escw/ewfww)中是不存在抗TYLCV基因的，僅有少量的品系對(duì)TYLCV表現(xiàn)出一定的耐性，而在野生番茄材料中含有抗TYLCV的基因。因此，在番茄育種體系中，找到與抗TYLCV基因緊密連鎖的標(biāo)記，對(duì)于抗病植株篩選和基因克隆都是必要和有益的。其中，Hanson等(2002)(HansonPM,BernacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV,PadmajaAS,ChenHM,KuoQFangD,ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20)利用92個(gè)RFLP標(biāo)記作為探針對(duì)來自野生番茄抗黃化曲葉病毒的抗性基因進(jìn)行定位分析，將其定位在11號(hào)染色體長(zhǎng)臂的TG36(84cM)和TG393(103cM)標(biāo)記之間約14.6cM的范圍之內(nèi)，2006年該基因被命名為7^-2，并定位在TG36(84cM)禾tlTG26(92cM)標(biāo)記之間。Garcia等(2007)(GarciaBE,MartinCT，MaxwellDP.Detectionmethodsforthe2^-7geneforresistancetobegomovirusesonchromosome6oftomato.2007,http:〃www.plantpath.wise.edu/GeminivirusResistantTomatoes/Markers/MAS-Protocols/IntroTyl.pdf)根據(jù)T0302(89cM)標(biāo)記設(shè)計(jì)的2對(duì)引物T0302F/T0302R和T0302F/TY2R1能夠有效的檢測(cè)基因型/>^/&2和&2/3>2，但由于不知道這個(gè)標(biāo)記與基因的連鎖程度，所以該標(biāo)記或許不能檢測(cè)所有含3>-2基因的材料。Ji等(2007)(JiY，SchusterDJ，ScottJW.7)/-3，abegomovirusresistancelocusneartheTomatoyellowleafcurlvirusresistancelocusJonchromosome6oftomato.MolecularBreeding,2007，20:271-284)利用易感品種7781x抗病自交系021108(來自丄yco;e^/cowc/H7mseLA2779)和易感品種8248x抗病自交系034611(來自Z^copera/cowc/2//emeLA1932)雜交后的F2分離群體進(jìn)行連鎖遺傳分析和QTL定位分析；源于LA2779的F2群體，抗性位點(diǎn)定位在番茄6號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，源于LA1932的F2群體，抗性位點(diǎn)定位7>-3位點(diǎn)。2007年Maxwell等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，來自于LA2779禾卩LA1932的G8基因序列不同，并且把來自LA2779的基因命名為7>-3，來自LA1932的基因命名為7>-&。在上述抗性分子遺傳基礎(chǔ)的研究已證實(shí)，在6號(hào)染色體和11號(hào)染色體上存在抗性位點(diǎn)，并已找到相應(yīng)的分子標(biāo)記，如的標(biāo)記有TG36、TG393、C2—At4g32930、TG105A、T0302、C2一At5g25760、Hba78A16T7、T0386A等；7>-3的標(biāo)記有T1079、TG590、cLET畫l畫I13、P169C、C2—At3gl1210、C2—At5g05690、T0507、C2—At5g41480、TG118、C2—At4g27700、FLUW25、P6-25、FER-G8、UBC621、UBC697、UBC169等，這為分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)方法在番茄抗黃化曲葉病毒病育種上的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。今后的一個(gè)方向?qū)⑹茄芯扛鱾€(gè)位點(diǎn)的具體功能，進(jìn)行不同效應(yīng)基因的聚合育種。如果把7>-2及7>-3聚合到同一個(gè)品系中，將會(huì)產(chǎn)生更加穩(wěn)定持久的抗性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是，針對(duì)番茄抗病育種中常規(guī)采用的抗性鑒定與植株表型相結(jié)合方法所存在的工作量大、進(jìn)程慢、周期長(zhǎng)、易受環(huán)境條件的限制、育種效率低、成本高等的缺陷，提供一種在番茄抗黃化曲葉病毒病育種進(jìn)程中，用于早期分離世代與苗期抗病性鑒定，能準(zhǔn)確、快速、高效選擇出含有抗黃化曲葉病毒病基因材料的分子標(biāo)記輔助選擇的方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(1)從育種分離世代材料提取DNA:將番茄抗黃化曲葉病毒病育種分離世代材料的種子，播種；待幼苗長(zhǎng)至34片真葉時(shí)，每植株取l片幼葉，用改進(jìn)的CTAB法提取DNA;(2)篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記根據(jù)已發(fā)表(HansonPM，BernacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV，PadmajaAS,ChenHM,KuoGFangD，ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20;JiY,BetterayBV,SmeetsJ，JensenKS，MejiaL，ScottJW，HaveyMJ,MaxwellDRCo-dominantSCARMarker,P6-25,forDetectionof3^-3，！^-3",and3^-36introgressionsfromthreeSolanumchilenseaccessionsat25cMofChromosome6ofBegomovirus-ResistantTomatoes.http:〃www.plantpath.wisc.edu/GeminivirusResistantTomatoes/Markers/MAS-Protocols/P6-25-locus.pdf)的文獻(xiàn)資料，初選出抗番茄黃化曲葉病毒病基因的分子標(biāo)記，合成引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并根據(jù)PCR擴(kuò)增的純合和雜合帶型以及人工苗期接種鑒定結(jié)果，從中篩選出適合自己育種材料的抗番茄黃化曲葉病毒病基因和的SCAR分子標(biāo)記；ry-2和？>-3SCAR標(biāo)記的引物序列為引物1:5，-TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC-3，，引物2:5，-AGTGTACATCCTTGCCATTGACT誦3，，弓1物3:5,-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC誦3，，引物4:5，-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3，；(3)雙重PCR反應(yīng)體系的建立與電泳分析檢測(cè)2>-2和7>-3基因的雙重PCR反應(yīng)體系為擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為IO微升，0.7(iLDNA模板，0.2pL10mmol'L"dNTPs，50ng卞L—1的2上、下游引物各0.125(iL，50ng.[iL"的3>畫3上、下游引物各0.125pL，1^L含20mmol'L"Mg2+的10x反應(yīng)緩沖液，2U卞L"的ra酶0.25juL，無菌純水7.35pL;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C2min預(yù)變性后，接著94。C變性30s，54。C復(fù)性lmin，72。C延伸1min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72。C延伸10min;PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離分析、EB染色，在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)上自動(dòng)成像；(4)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)育種分離世代材料抗性的評(píng)價(jià)依據(jù)成像對(duì)育種分離世代材料抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，若擴(kuò)增條帶中含有900bp和/或450bp大小的DNA條帶，則該材料中含有抗番茄黃化曲葉病毒病的r,2和/或r,3基因；若反之，則該材料中沒有和/或5>-3基因。所述的育種分離世代材料為高度分離的F2后代群體或者高度分離的Bd后代群體。所述改進(jìn)的CTAB法提取DNA為，配制CTAB緩沖液100mL1mol.L/1TrispH7.5，140mL5mol丄"NaCl，20mL0.5mol'L國(guó)1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB;10mg的新鮮葉片放入研缽中，加入150pLCTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150pLCTAB緩沖液混勻；65'C水浴40min;加入300|iL24:1氯仿/異戊醇，上下混勻5min，使樣品與氯仿充分混和；13000rmin"離心5min;取上清液150)iL，加入在-20。C預(yù)冷的異丙醇200pL，輕輕上下顛倒混勻；10000~12000rmin"離心34min，棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50100含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的瓊脂糖電泳所述的雙重PCR反應(yīng)體系，其Mg^濃度為2mmol丄—、引物濃度為0.625ng卞L—1，退火溫度為54'C，循環(huán)數(shù)為40;本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明采用了目標(biāo)材料DNA的雙重PCR技術(shù)，二對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增，這樣大大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。雙重PCR擴(kuò)增中消耗的試劑和準(zhǔn)備的時(shí)間比使用2個(gè)試管的單一PCR少一半，因此該技術(shù)具有高效率和低成本的特點(diǎn)，適合對(duì)大量樣本材料進(jìn)行分析與鑒定，大大縮短時(shí)間和減少工作量，對(duì)標(biāo)記材料的篩選效率提高一倍。(2)采用本發(fā)明改進(jìn)的CTAB法提取DNA，既能簡(jiǎn)易、快速地提取出番茄DNA，又不需要經(jīng)過液氮處理，且在提取過程中也不利用特殊化學(xué)藥品如巰基乙醇及PVP等，降低了成本；(3)本發(fā)明可在實(shí)驗(yàn)室對(duì)抗番茄黃化曲葉病毒病育種進(jìn)程中任何世代的材料，均可對(duì)其是否聚合抗TYLCV的基因進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的直接檢測(cè)，這既不受環(huán)境條件的影響，又可在任何時(shí)期進(jìn)行，且不影響植株的正常生長(zhǎng)。(4)本發(fā)明分子標(biāo)記輔助選擇聚合番茄抗黃化曲葉病毒病育種方法，與常規(guī)抗病育種、鑒定方法相比較，具有周期短、規(guī)模小、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、省力、省成本等優(yōu)點(diǎn)。圖1利用雙重PCR技術(shù)對(duì)(2698BCr6X07-027)F2部分分離世代材料的電泳檢測(cè)注M:Marker;1:(2698BC1-6X07-027)F2-l;2:(2698BC1-6X07-027)F2-6;3:(2698BC1-6X07-027)F2-8;4:(2698BC1-6X07-027)F2-12;5:(2698BCh6X07-027)F2-13;6:(2698BC1-6X07-027)F2-18;7:(2698BCl-6X07-027)F2-22;8:(2698BCl-6X07-027)F2-27;9:(2698BCl-6X07-027)F2-29;10:(2698BC1-6X07-027)Fr30;11:(2698BC1-6X07-027)F2-41;12:(2698BC1-6X07-027)F2-52;13:(2698BC1-6X07-027)F2-53;14:(2698BC1-6X07-027)F2-55;15:(2698BC1-6X07-027)F2-61;16:(2698BC1-6X07-027)F2-67;17:(2698BC1-6X07-027)F2-68;18:(2698BC1-6X07-027)F2-71;19:(2698BC1-6X907-027)F2-72;20:(2698BC卜6X07-027)F2-79:21:(2698BC1-6X07-027)Fr80;22:(2698BC1-6X07-027)F2-83;23:(2698BCl-6X07-027)F2-84;24:(2698BC1-6X07-027)F2-89;圖2利用雙重PCR技術(shù)對(duì)((9179x07-027)x07-026)F2部分分離世代材料的電泳檢測(cè)注M:Marker;1:((9179x07-027)x07-026)F2-12;2:((9179x07-027)x07-026)F2-54;3:((9179x07-027)x07-026)F2-88;4:((9179x07-027)x。7-026)Fr67;5:((9179><07-027)x07-026)F2-112;6:((9179x07-027)x07-026)F2-193:7:((9〗79x07-027)x07-026)F2-13;8:((9179x07-027)x07-026)F2-105;9:((9179x07-027)x07-026)F2-5;10:((9179x07-027)x07-026)F2-48;具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限制。實(shí)施例1:(利用分子標(biāo)記輔助選擇方法對(duì)雜交后代材料的抗性檢測(cè)1)本例的具體實(shí)施步驟是1、親本材料與雜交方法①親本材料番茄優(yōu)良株系T01-198:由浙江省農(nóng)科院蔬菜研究所育成并保存，該株系無限，大紅，中果，耐貯運(yùn)，抗葉霉病，感番茄黃花曲葉病毒病，分離于荷蘭弓1進(jìn)雜交一代'TomatoSerrei，；07-026:含抗番茄黃化曲葉病毒病抗性基因7V-3，由亞洲蔬菜研究發(fā)展中心(AVRDC)提供；07-027:含抗番茄黃化曲葉病毒病抗性基因7V-2，由亞洲蔬菜研究發(fā)展中心(AVRDC)提供；②雜交方法以T07-026為母本，T01-198為父本，獲得Ft雜交組合07-026xT0卜198;10再以T01-198為父本對(duì)Fi進(jìn)行回交，獲得回交世代Bd;對(duì)BC,分離后代進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，篩選出07-026XT01-198BC廣6，命名為2698BC廣6;以2698BCr6為母本，07-027為父本進(jìn)行巧-3和^-2抗性基因聚合，獲得F!雜交組合2698Bd-6X07-027，通過自交，獲得高度分離的F2后代群體。2、利用SCAR分子標(biāo)記輔助選擇方法，從上述育種分離世代材料中檢測(cè)、篩選出抗性材料(1)從育種分離世代材料提取DNA:將番茄抗黃化曲葉病毒病育種分離世代材料Bd及F2的種子，播種于基質(zhì)為草炭蛭石=2:l(體積比)的育苗穴盤中，待幼苗長(zhǎng)出3~4片真葉時(shí)，每個(gè)植株分別取1片幼葉，然后用改進(jìn)的CTAB法提取DNA;首先配制CTAB緩沖液lOOmL1mol.L"TrispH7.5，140mL5mol.L"NaCl，20mL0.5mol.L-1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB。DNA提取是取10mg的新鮮葉片放入研缽中，加入150liLCTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150pLCTAB緩沖液混勻；65。C水浴40min;加入300pL24:l氯仿/異戊醇，上下混勻5min，使樣品與氯仿充分混和；13000rmin"離心5min;取上清液150pL，加入在-20。C預(yù)冷的異丙醇200^L，輕輕上下顛倒混勻；1000012000rmin"離心34min，棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50~100nL含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)；(2)篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記根據(jù)已發(fā)表(HansonPM,BemacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV，PadmajaAS，ChenHM,KuoQFangD,ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20;JiY，BetterayBV，SmeetsJ,JensenKS,MejiaL,ScottJW,HaveyMJ,MaxwellDP.Co-dominantSCARMarker,P6-25,forDetectionof2^-3,and7^-36introgressionsfromthreeSolatiumchilenseaccessionsat25cMofChromosome6ofBegomovims國(guó)ResistantTomatoes.http:〃www.plantpath.wise.edu/GeminivimsResistantTomatoes/Markers/MAS-Protoc0ls/P6-25-locus.pdf)的文獻(xiàn)資料，選擇18個(gè)抗番茄黃化曲葉病毒病基因的分子標(biāo)記，合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；再根據(jù)PCR擴(kuò)增的純合和雜合帶型以及人工苗期接種鑒定結(jié)果，篩選出適合自己育種材料的抗番茄黃化曲葉病毒病和7^5基因的SCAR分子標(biāo)記&-2和5^-3SCAR標(biāo)記的引物序列引物1:5'-TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC國(guó)3，，引物2:5，畫AGTGTACATCCTTGCCATTGACT函3,，引物3:5，-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC-3'，引物4:5，-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3，。(3)雙重PCR方法的建立與檢測(cè)建立一步法可同時(shí)檢測(cè)r,2和2>-3基因，優(yōu)化反應(yīng)體系及條件，獲得最佳的擴(kuò)增和檢測(cè)效果，r,2和r少-3基因的混合引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增，雙重PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)總體積為IO微升；0.7)iLDNA模板，0.2pL10mmol-L"dNTPs，50ng卞L"的2>-2上、下游引物各0.125[iL，50ng卞L'1的t,3上、下游引物各0.125(jL，l)iL含20mmol丄"Mg2+的10x反應(yīng)緩沖液，2U卞L"的rag酶0.25(iL，無菌純水7.35pL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C2min預(yù)變性后，接著94'C變性30s，54。C復(fù)性lmin，72'C延伸1min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72。C延伸10min;該反應(yīng)體系中，最佳Mg"濃度為2mmol丄'1，引物濃度為0.625ng^U1，退火溫度為54。C，循環(huán)數(shù)為40;PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，電泳結(jié)束后用EB染色，并在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)上自動(dòng)成像，即可依據(jù)此分析檢測(cè)結(jié)果對(duì)育種分離12世代材料的抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)；經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果可靠，可以用于在同一PCR反應(yīng)體系中對(duì)7>2和r,3基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。3、結(jié)果與分析在所用的番茄材料中優(yōu)良株系T01-198，沒有擴(kuò)增出900bp和/或450bp大小的DNA條帶，說明該材料中沒有^-2和/或^-3基因；在07-026材料中擴(kuò)增出一條450bp大小的條帶，說明該材料是基因型；在07-027材料中擴(kuò)增出一條900bp大小的條帶，說明該材料是^-2/:^-2基因型。獲得的目標(biāo)中間材料07-026xT01-198和07-026XTO1-198BC廣6，都擴(kuò)增出320bp和450bp大小的兩條DNA條帶，說明這些材料是7>-3/&-3基因型；中間材料2698BC廣6X07-027，擴(kuò)增出320bp、450bp、800bp和卯0bp的4條DNA條帶，說明該材料是7>-27V-3/^-3基因型。對(duì)2698Bd-6X07-027高度分離的F2后代群體進(jìn)行和^-3分子標(biāo)記檢測(cè)(圖1)，其中18份是^-2基因型，7份是3>-3/5>-3基因型，12份是^v-2/y-3^-2基因型，10份r,20^/0^^-3基因型，其它的是2&-3//>^0^基因型。實(shí)施例2:(利用分子標(biāo)記輔助選擇方法對(duì)雜交后代材料的抗性檢測(cè)2)本例的具體實(shí)施步驟是1、親本材料與雜交方法①親本材料9179是從歐洲引進(jìn)的高抗葉霉病的鮮銷雜交一代品種9502和亞洲蔬菜研究發(fā)展中心引進(jìn)材料9132雜交后，在高度分離后代中經(jīng)8代株系選擇而成的穩(wěn)定株系，該株系無限，粉紅，大果，抗葉霉病，感番茄黃花曲葉病毒??；07-026和07-027材料同實(shí)施例1;②雜交方法以9179為母本，07-027為父本，獲得F！雜交組合9179x07-027;以07-026為父本對(duì)該Ft進(jìn)行雜交，獲得三交組合"(9179x07-027)x07-026";利用^-2和分子標(biāo)記對(duì)三交組合高度自交分離后代進(jìn)行檢測(cè)。2、利用SCAR分子標(biāo)記輔助選擇方法，從上述育種分離世代材料中檢測(cè)、篩選出抗性材料具體從育種分離世代材料提取DNA、篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記及DNA的雙重PCR擴(kuò)增與檢測(cè)的方法同實(shí)施例1;3、結(jié)果與分析在所用的番茄材料中優(yōu)良株系9179，沒有擴(kuò)增出900bp和/或450bp大小的DNA條帶，說明該材料中沒有和/或，3基因；在07-027材料中擴(kuò)增出一條900bp大小的條帶，說明該材料是&-2/7>-2基因型；在07-026材料中擴(kuò)增出一條450bp大小的條帶，說明該材料是r,3/T,3基因型；獲得的目標(biāo)中間材料9179x07-027，擴(kuò)增出800bp和900bp大小的兩條DNA條帶，說明這些材料是2/^-2基因型；三交組合材料"(9179x07-027)x07-026"，擴(kuò)增出320bp、450bp、800bp和900bp的4條DNA條帶，說明該材料是7>-27>-3~-2/>^基因型(見圖2);對(duì)三交組合高度自交分離后代進(jìn)行^-2和^-3分子標(biāo)記檢測(cè)，其中2份是3>-基因型，8份是r,3/2>3基因型，30份是7V-2/);-3/0^^3基因型，5份是&-3^-2/^-3tv-2基因型，25份是3>-2r,3/W-2tv-3基因型，其它的是(v-2&-3~-2~-3基因型。實(shí)施例3:(應(yīng)用人工苗期接種鑒定法對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇抗性材料的驗(yàn)證)應(yīng)用篩選標(biāo)記的抗性純合和雜合帶型選擇抗性植株，在番茄抗黃化曲葉病毒病育種過程中，采用雙重PCR技術(shù)對(duì)r,2和^-3基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，從中篩選出含抗性基因的材料07-026XT01-198BCr6、07-026XT01-198BC廣86、07-02614XT01-198BC廣112、(2698BC廣6X07-027)F2-53、(2698BC廠6X07-027)F2-72、((9179x07-027)x07-026)F2-88、((9179x07-027)x07-026)F2-105等，隨后進(jìn)一步應(yīng)用人工苗期接種鑒定法對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇抗性植株進(jìn)行驗(yàn)證(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法〈160〉4<210〉1<211〉25<212〉腿<213〉人工序列〈220><223>根據(jù)己知序列而設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)有限公司合成，用作7>-2分子標(biāo)記的上游引物<400〉1tggctcatcctgaagctgatagcgc25<210〉2<211〉23<212>腿<213〉人工序列<220〉〈223〉根據(jù)己知序列而設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)有限公司合成，用作7>-2分子標(biāo)記的下游引物<400>2agtgt.acatccttgccattgact23<210〉3<211>22<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>根據(jù)已知序列而設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)有限公司合成，用作7>-3分子標(biāo)記的上游引物<棚〉3ggtagtggaaatgatgctgctc22<210>4<211〉27<212>DNA<213>人工序列〈220><223>根據(jù)己知序列而設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)有限公司合成，用作7>-3分子標(biāo)記的下游引物〈400>4gctctgcctattgtcccatatataacc271權(quán)利要求1、番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行(1)從育種分離世代材料提取DNA將番茄抗黃化曲葉病毒病育種分離世代材料的種子，播種；待幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，每植株取1片幼葉，用改進(jìn)的CTAB法提取DNA；(2)篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，初選出抗番茄黃化曲葉病毒病基因的分子標(biāo)記，合成引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并根據(jù)PCR擴(kuò)增的純合和雜合帶型以及人工苗期接種鑒定結(jié)果，從中篩選出適合自己育種材料的抗番茄黃化曲葉病毒病基因Ty-2和Ty-3的SCAR分子標(biāo)記；Ty-2上、下游引物的序列分別如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，Ty-3上、下游引物的序列分別如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；(3)雙重PCR反應(yīng)體系的建立與電泳分析檢測(cè)Ty-2和Ty-3基因的雙重PCR反應(yīng)體系為擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為10微升，0.7μLDNA模板，0.2μL10mmol·L-1dNTPs，50ng·μL-1的Ty-2上、下游引物各0.125μL，50ng·μL-1的Ty-3上、下游引物各0.125μL，1μL含20mmol·L-1Mg2+的10×反應(yīng)緩沖液，2U·μL-1的Taq酶0.25μL，無菌純水7.35μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃2min預(yù)變性后，接著94℃變性30s，54℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離分析、EB染色，在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)上自動(dòng)成像；(4)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)育種分離世代材料抗性的評(píng)價(jià)依據(jù)成像對(duì)育種分離世代材料抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，若擴(kuò)增條帶中含有900bp和/或450bp大小的DNA條帶，則該材料中含有抗番茄黃化曲葉病毒病的Ty-2和/或Ty-3基因；若反之，則該材料中沒有Ty-2和/或Ty-3基因。2、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的育種分離世代材料為高度分離的F2后代群體或者高度分離的Bd后代群體。3、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法,其特征在于所述改進(jìn)的CTAB法提取DNA為，配制CTAB緩沖液100mL1mol'L"TrispH7.5，140mL5molL"NaCl，20mL0.5molL國(guó)1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB;10mg的新鮮葉片放入研缽中，加入150pLCTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150pLCTAB緩沖液混勻；65。C水浴40min;加入300pL24:1氯仿/異戊醇，上下混勻5min，使樣品與氯仿充分混和；13000rmin—1離心5min;取上清液150^L，加入在-2(TC預(yù)冷的異丙醇200juL，輕輕上下顛倒混勻；1000012000r.min"離心34min，棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50100liL含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。4、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的雙重PCR反應(yīng)體系，其Mg^濃度為2mmol七"，引物濃度為0.625ng'(iL"，退火溫度為54°C，循環(huán)數(shù)為40。全文摘要本發(fā)明公開了番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，屬于蔬菜抗病育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法按以下步驟進(jìn)行(1)從育種分離世代材料提取DNA；(2)篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記；(3)DNA的雙重PCR擴(kuò)增與電泳分析檢測(cè)；(4)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)育種分離世代材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。本發(fā)明可在實(shí)驗(yàn)室對(duì)育種進(jìn)程中的任何世代材料，對(duì)其是否聚合抗TYLCV的基因進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)，從而明顯縮短了抗病育種的周期，縮小了育種規(guī)模，并具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、省力、省成本等優(yōu)點(diǎn)，減少了工作量，提高了對(duì)抗性材料的篩選效率，加快了抗病育種進(jìn)程。該發(fā)明可在番茄育種單位推廣應(yīng)用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101560566SQ200910097378公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年4月13日優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日發(fā)明者葉青靜,周國(guó)治,姚祝平,李志邈,楊悅儉,王榮青,阮美穎申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院