專利名稱：鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用的制作方法
鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用。背景技術(shù)：
鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer， RA )病是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì) 菌性傳染病。鴨疫里氏桿菌病的防制措施有疫苗接種和藥物治療?，F(xiàn)有的疫 苗為滅活疫苗，其優(yōu)點(diǎn)是安全且研制成本較低，但常達(dá)不到較好效果，因?yàn)?流行菌抹的血清型經(jīng)常改變，致使免疫失敗時(shí)有發(fā)生。養(yǎng)殖戶常選用藥物治 療，而目前鴨疫里氏桿菌敏感的藥物不多且易產(chǎn)生耐藥性，所以多種藥物超 劑量或超療程應(yīng)用的情況屢見(jiàn)不鮮，其后果， 一方面導(dǎo)致鴨胴體制品中的獸 藥殘留，攝入人體后影響人類的健康；另一方面，鴨場(chǎng)排泄物向周圍環(huán)境排 放，藥物又成為環(huán)境污染物，給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)不利影響。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了找到一種能對(duì)鴨疫里氏桿菌病采用生物療法,以 減少藥物的應(yīng)用從而保護(hù)人類健康，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，而提供的一種鴨疫里氏 桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用。
本發(fā)明所述的鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37,屬于細(xì)菌 病毒雙股DNA病毒群尾病毒目(Caudovirales )長(zhǎng)尾病毒牙牛(Siphoviridae )， 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心簡(jiǎn)稱CGMCC 保藏日2009年3月2日 保藏號(hào)CGMCC NO. 2908,先培養(yǎng)該噬菌體
能裂解的鴨疫里氏桿菌RAf71,培養(yǎng)基為添加10mL/L新生牛血清的胰酶大 豆瓊脂，培養(yǎng)條件為37。C蠟燭缸中24h。將菌泥用無(wú)菌10mM硫酸鎂溶液洗 下，調(diào)OD525nm值為0.4,取100微升與適量RAP37混勻，37。C水浴15min， 加入45。C 7g/L瓊脂，立即均勻鋪在添加10 mL/L新生牛血清的胰酶大豆 瓊脂上，待瓊脂凝固后置37。C蠟燭缸中培養(yǎng)24h,可見(jiàn)透亮的噬菌空斑，其直徑約為l-2mm,周圍無(wú)暈環(huán)。該噬菌體由l個(gè)多面體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部 組成，頭部平面輪廓為六角形，直徑約為60nm尾部長(zhǎng)約200nm寬約8nm， 其基因組為雙鏈DNA。
鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，能對(duì) 鴨疫里氏桿菌發(fā)生裂解作用，可用于對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏 桿菌所導(dǎo)致的鴨疫里氏桿菌病采用生物療法治療和預(yù)防。
噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，分為溫和性和烈性兩類。烈性噬菌體感染細(xì) 菌后可立即在細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始自身的生命循環(huán)，引起細(xì)胞的裂解，可應(yīng)用于細(xì)菌 病的生物防治。Matsuzaki等使用小鼠模型證實(shí)，噬菌體可以治療金黃色葡萄 球菌感染。Huff等的試驗(yàn)表明，對(duì)人工感染引起的大腸桿菌呼吸道疾病，早 期注射噬菌體能起到有效的治療作用，與抗生素療法相似，噬菌體療法的有 效性與治療的時(shí)機(jī)密切相關(guān)；2004年他們又比較了噬菌體和恩諾沙星單一使 用和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肉雞大腸桿菌病的治療效果，認(rèn)為單純的噬菌體和恩諾沙星 都能有效防制大腸桿菌病，但二者的聯(lián)合應(yīng)用效果更好。Carrillo等的研究已 證明，在肉雞臨屠宰前對(duì)其喂食彎曲桿菌特異性噬菌體，能減少?gòu)澢鷹U菌進(jìn) 入食品的加工環(huán)節(jié)。美國(guó)一些大型醫(yī)藥公司已生產(chǎn)出治療葡萄球菌和結(jié)腸桿 菌等感染的噬菌體。以上文獻(xiàn)表明，噬菌體作為一種天然而安全的抗生素替 代品，在防治細(xì)菌性疾病方面的應(yīng)用受到人們的高度關(guān)注。本發(fā)明的鴨疫里 氏桿菌敏感的烈性噬菌體能對(duì)鴨疫里氏桿菌發(fā)生裂解作用，由于這種裂解作 用，可對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌所導(dǎo)致的鴨疫里氏桿菌病 進(jìn)行生物療法，從而達(dá)到治療和預(yù)防鴨疫里氏桿菌病的作用，以減少藥物的 應(yīng)用，從而保護(hù)人類健康，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

生物材料保藏說(shuō)明鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，屬 于細(xì)菌病毒雙股DNA病毒群尾病毒目(Caudovirales )長(zhǎng)尾病毒科 (Siphoviridae),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心簡(jiǎn) 稱CGMCC 地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日 2009年3月2日 保藏號(hào)CGMCC NO, 2908 。
圖1噬菌體RAP37的噬菌斑形態(tài)圖2噬菌體RAP37的電鏡照片 圖3噬菌體RAP37的基因組的酶切分析 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一 步的描述。
具體實(shí)施方式
先培養(yǎng)該噬菌體能裂解的鴨疫里氏桿菌RAf71，培養(yǎng)基為添加10mL/L 新生牛血清的胰酶大豆瓊脂，培養(yǎng)條件為37。C蠟燭缸中24h。將菌泥用無(wú)菌 10mM硫酸鎂溶液洗下，調(diào)OD525nm值為0.4,取100微升與適量RAP37混 勻，37。C水浴15min，加入45°C 7g/L瓊脂，立即均勻鋪在添加10 mL / L 新生牛血清的胰酶大豆瓊脂上，待瓊脂凝固后置37。C蠟燭缸中培養(yǎng)24h，可 見(jiàn)透亮的噬菌空斑，其直徑約為l-2mm，周圍無(wú)暈環(huán)。該噬菌體由l個(gè)多面 體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成，頭部平面輪廓為六角形，直徑約為60nm,尾 部長(zhǎng)約200 nm，寬約8nm,其基因組為雙鏈DNA。
鴨疫里氏桿菌敏感的烈 性噬菌體命名為RAP37，能對(duì)鴨疫里氏桿菌發(fā)生裂解作用，可用于對(duì)危害養(yǎng) 鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌所導(dǎo)致的鴨疫里氏桿菌病采用生物療法治
療和預(yù)防。
鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37可以通過(guò)如下的方法鑒別 得到
(一)培養(yǎng)鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體的材料與方法 1菌林及培養(yǎng)條件
鴨疫里氏桿菌分離林(見(jiàn)表1 ),由申請(qǐng)人分離、鑒定，其16srDNA部 分序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)與鴨疫里氏桿菌參考菌抹ATCC11845的 序列比對(duì)，其同源性均在99%以上，進(jìn)一步證實(shí)分離菌株為鴨疫里氏桿菌屬 細(xì)菌。培養(yǎng)基為添加10mL/L新生牛血清的胰酶大豆瓊脂(TSA)或胰酶大 豆肉湯(TSB)。大腸桿菌菌抹，由筆者所在研究室分離、鑒定，培養(yǎng)基為麥 康凱瓊脂或LB肉湯。禽多殺性巴氏桿菌C48-l株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察 所，禽多殺性巴氏桿菌分離林，由筆者所在研究室分離、鑒定，培養(yǎng)基為馬 丁瓊脂或肉湯。三種細(xì)菌的培養(yǎng)均在37。C進(jìn)行。
2樣品的采集與處理
新鮮糞便樣品于2007年12月采自福建省福州市閩候某番鴨場(chǎng)(30曰齡健康番鴨)。樣品中加入等體積無(wú)菌PBS,充分混勻后8000 X g離心10 min， 上清用450nm濾膜過(guò)濾。
樣品先進(jìn)行噬菌體的增殖。濾液中加入等體積的2XTSB,然后加入六種 鴨疫里氏桿菌新鮮培養(yǎng)物的混合液(RAf32、 RAf40、 RA傷3、 RAf68、 RAf75、 RAfl17)， 37。C溫箱中放置過(guò)夜。將培養(yǎng)液8000Xg離心10 min， 上清用450 nm濾膜過(guò)濾。濾液重復(fù)增殖l次，2次增殖后的濾液即為原液。
3 噬菌體的分離、純化、效價(jià)測(cè)定、培養(yǎng)和濃縮
分別以上述6種菌為指示菌，取適量原液和指示菌混勻，37。C水浴15 min,力口45。C7g/L的LB瓊月旨，混勻后立即倒入TSA上制成雙層平板，待 瓊脂凝固后將平板置37。C溫箱中培養(yǎng)10 h~16 h后觀察噬菌斑，同時(shí)以單純 指示菌鋪雙層平板作為陰性對(duì)照。
吸取雙層平板上的單個(gè)噬斑，加入1 mL SM緩沖液(NaCl 5.8 g / L， MgS04 . 7H20 2g/L，明膠0.1g/L)中，加入50uL氯仿，室溫下在搖 床上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)lh， 4。C靜置數(shù)小時(shí)，然后10000Xg離心5min,吸取上清裝 于新的小管中。將上清適當(dāng)稀釋，取適量與原指示菌混勻后按上述方法再次 鋪雙層平板。再次挑單噬菌斑重復(fù)上述步驟5次，即認(rèn)為得到純化的噬菌體 原種。
將噬菌體液用SM緩沖液作IO倍連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度取適量與指示菌 鋪雙層平板，按密度適當(dāng)?shù)钠桨迳系氖删邤?shù)計(jì)算效價(jià)，以PFU(噬菌體液 能形成的噬菌斑^(guò):)表示。
將新鮮指示菌培養(yǎng)液測(cè)定OD525nm值， -換OD525nm值為1對(duì)應(yīng) 5X10kFU(菌液能形成的單菌落數(shù))/mL估算培養(yǎng)液的含菌量。按PFU/ CFU-0.1的比例加入噬菌體液和指示菌液，37。C溫箱中培養(yǎng)10h,然后離心， 上清用450nm濾膜過(guò)濾。對(duì)濾液進(jìn)行噬菌體效價(jià)的測(cè)定。重復(fù)上述培養(yǎng)過(guò) 程，直至得到大量濃度達(dá)10"PFU/mL左右的噬菌體液。
用聚乙二醇沉淀噬菌體顆粒。在噬菌體液中加入DNase I和RNase A至 終濃度均為lmg/L，室溫溫育30min。然后每500 mL噬菌體液中加入29.2 g固體NaCl，輕孩i攪拌溶解，冰浴lh。 4。C下8000Xg離心10min，小心吸 取上清，加入PEG8000至終濃度為100g/L,輕輕搖動(dòng)溶解后冰浴3h。 4°C下8000Xg離心10min,徹底棄上清，加適量SM浸泡1 h后輕輕重懸。加入 等體積氯仿，溫和振蕩30s, 4°C 3000Xg離心15min,小心吸上清即為濃縮 液。
4 電鏡觀察
取噬菌體濃縮液滴加于載膜銅網(wǎng)上，用20g/L的磷鴒酸(pH6.8)負(fù)染 lmin,干燥后用JEOL1010透射電子顯微鏡觀察。
5 噬菌譜的測(cè)定
以表l所列的各種菌分別為指示菌，與適量的噬菌體鋪雙層平板。上層 瓊脂均為7g/L的LB瓊脂，大腸桿菌的下層瓊脂為麥康凱瓊脂，禽多殺性 巴氏桿菌的下層瓊脂為馬丁瓊脂，二者的觀察時(shí)間均為6h 12h。
6噬菌體的核酸類型測(cè)定
取噬菌體濃縮液，用病毒基因組提取試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)提取 噬菌體的基因組，分別以RNaseA、 DNase I和綠豆核酸酶(均購(gòu)自大連寶 生物工程有限公司)按各自說(shuō)明書進(jìn)行酶切，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳后 觀察結(jié)果。
7 噬菌體的治療試-驗(yàn)
選擇14日齡健康雛番鴨34羽，10羽作為對(duì)照組，每羽于左側(cè)腿部肌肉 注射2 X 108CFU的RAf71菌林；24羽作為試驗(yàn)組，每羽于左側(cè)腿部肌肉注射 2X 108CFU的RAf71菌林，同時(shí)于右側(cè)腿部肌肉注射5 X 109PFU的RAP37 噬菌體液。在同樣條件下飼養(yǎng)觀察10天，記錄死亡鴨的數(shù)量并對(duì)死亡鴨進(jìn)行 剖檢觀察。
(二)結(jié)果
1 噬菌體的分離及純化
以RAf32為指示菌時(shí)，可觀察到噬菌斑，挑單個(gè)噬菌斑，傳代5次后， 噬菌斑的形態(tài)和大小保持均勻一致，斑呈圓形透明，邊緣清晰，直徑約為1-2 mm,提示得到了純化的噬菌體，命名為RAP37見(jiàn)圖1。
2噬菌體的電鏡形態(tài)
在電子顯微鏡下觀察磷酸鎢負(fù)染的噬菌體顆粒如圖2所示，該圖噬菌 體RAP37的電鏡照片放大倍數(shù)IO萬(wàn)倍，圖中標(biāo)尺lOOnm,該噬菌體由1個(gè)多面體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成，頭部平面輪廓為六角形，直徑約為60
nm,尾部長(zhǎng)約200nm，寬約8nm。 3 噬菌體的核酸類型
噬菌體RAP37的基因組可以被DNase I消化，但不能被RNase A消化， 也不能被綠豆核酸酶消化見(jiàn)圖3，說(shuō)明RAP37的基因組為雙鏈DNA。圖3中 lADNA/Hindlll分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2.噬菌體RAP37基因組的RNaseA酶切產(chǎn)物 3.噬菌體RAP37基因組的DNase I酶切產(chǎn)物 4.噬菌體RAP37基因組的綠
豆核酸酶酶切產(chǎn)物。
4噬菌體的噬菌譜
噬菌譜測(cè)定結(jié)果表明，RAP37不能裂解試驗(yàn)所用的5林大腸桿菌和5抹 禽多殺性巴氏桿菌株，可以裂解試驗(yàn)所用的22株鴨疫里氏桿菌分離抹中的8 抹(見(jiàn)表1 )。
表1噬菌體RAP37的噬菌譜
細(xì)菌名稱菌抹序列號(hào)噬菌斑檢測(cè)
RAf40EF641574+
RAf63EF641578+
血清1型RAf39EF641577—
鴨疫里氏桿RA傷OEF641573—
菌RAf67 RAf68EF641571 EUO16551—
血清2型RA。2E簡(jiǎn)6550+
鴨疫里氏桿RAf71EF641576+
菌RAf75EF641572+
RAfl06EU715013+
RA。EU715000—
RAf4DQ995225_
RAf9EF641568一RAf54EUO16547—
RAf72DQ995230-
RAfl16DQ995232_
RAfl13EU715015+
RAfl36EU715016+
未知血清RAfl2EU715004—
型鴨疫里氏RAf25EU715006一
桿菌RAf50 RAfl15EU715008 DQ995231—
Ef4 Efl7
大腸桿菌 Ef21
Ef28 Ef55
C48-l -
Pmf3 -
禽多殺性
Pmfl5 -
巴氏桿菌
Pmf22 -
Pmf36 -
"+"為形成噬菌斑；"-"為無(wú)噬菌斑
從上表中看到，分離到的鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體RAP37，能在 22林臨床分離的鴨疫里氏桿菌中的8林的培養(yǎng)皿上形成透亮空斑，即能裂解 22林臨床分離的鴨疫里氏桿菌中的8抹，寬噬率達(dá)36.4%。該噬菌體不能裂 解禽大腸桿菌和禽多殺性巴氏桿菌。說(shuō)明鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體 RAP37可用于對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌所導(dǎo)致的鴨疫里氏 桿菌病采用生物療法。5 噬菌體的治療試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果，IO羽對(duì)照組鴨全部死亡，剖檢見(jiàn)典型的鴨疫里氏桿菌病病變。 24羽試驗(yàn)組鴨僅死亡3羽，剖檢見(jiàn)典型的鴨疫里氏桿菌病病變，存活21羽。 結(jié)果表明噬菌體RAP37對(duì)敏感的鴨疫里氏桿菌RAf71感染的治愈率達(dá) 87.5%。具有良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1、一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用，其特征在于鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，屬于細(xì)菌病毒雙股DNA病毒群尾病毒目(Caudovirales)長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏日2009年3月2日保藏號(hào)CGMCC NO.2908。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用， 其特征在于該噬菌體由l個(gè)多面體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成，頭部平面輪 廓為六角形，直徑約為60nm，尾部長(zhǎng)約200nm,寬約8nm,其基因組為雙 鏈DNA。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng) 用，其特征在于鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體是先培養(yǎng)該噬菌體能裂解 的鴨疫里氏桿菌RAf71，培養(yǎng)基為添加10 mL/L新生牛血清的胰酶大豆瓊 脂，培養(yǎng)條件為37。C蠟燭缸中24h，將菌泥用無(wú)菌10mM硫酸鎂溶液洗下， 調(diào)OD525nm值為0.4,取100微升與適量RAP37混勻，37。C水浴15min，力口 入45。C 7g/L瓊脂，立即均勻鋪在添加10mL/L新生牛血清的胰酶大豆瓊 脂上，待瓊脂凝固后置37。C蠟燭缸中培養(yǎng)24h，可見(jiàn)透亮的噬菌空斑，其直 徑約為l-2mm，周圍無(wú)暈環(huán)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng) 用，其特征在于鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，能對(duì)鴨疫 里氏桿菌發(fā)生裂解作用，可用于對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌 所導(dǎo)致的鴨疫里氏桿菌病采用生物療法治療和預(yù)防。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用， 其特征在于鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，能對(duì)鴨疫里氏 桿菌發(fā)生裂解作用，可用于對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌所導(dǎo) 致的鴨疫里氏桿菌病采用生物療法治療和預(yù)防。
全文摘要
一種鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體及應(yīng)用，該鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2009年3月2日，保藏號(hào)CGMCC No.2908，其直徑約為1-2mm，周圍無(wú)暈環(huán)，該噬菌體由1個(gè)多面體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成，頭部平面輪廓為六角形，直徑約為60nm，尾部長(zhǎng)約200nm，寬約8nm，其基因組為雙鏈DNA。鴨疫里氏桿菌敏感的烈性噬菌體命名為RAP37，能對(duì)鴨疫里氏桿菌發(fā)生裂解作用，可用于對(duì)危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要的致病菌鴨疫里氏桿菌所導(dǎo)致的鴨疫里氏桿菌病采用生物療法治療和預(yù)防。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101575592SQ200910111568
公開(kāi)日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日 公開(kāi)號(hào)200910111568.X
發(fā)明者萬(wàn)春和, 傅光華, 彭春香, 施少華, 程龍飛, 騰 鄭, 陳紅梅, 瑜 黃 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所