大腸桿菌噬菌體ms2標準樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析測試、臨床醫(yī)學檢驗和食源性RNA病毒檢測的技術(shù)領(lǐng)域，具 體設(shè)及一種大腸桿菌瞻菌體MS2標準樣品。
【背景技術(shù)】：
[0002] 瞻菌體MS2屬于非細胞原生物的細菌病毒，專性感染和寄生于相應(yīng)的活細菌體 內(nèi)，具有作為水體中腸道病毒指示物的基本條件；對人沒有致病性，且在有腸道病毒污染的 水環(huán)境中普遍存在；可W進行高濃度接種和現(xiàn)場試驗；數(shù)量高于腸道病毒。在形態(tài)特征、理 化特性、對自然環(huán)境條件和消毒劑的抗性等方面與腸道病毒類似；檢測操作具有簡便快速、 安全可靠、受環(huán)境影響小和設(shè)備簡單等優(yōu)點。
[0003]與其他病毒的宿主如人類、動物和植物等相比，瞻菌體MS2具有如下優(yōu)勢；（1)在 實驗室里，瞻菌體MS2易于快速培養(yǎng)，對實驗室的空間、設(shè)施和設(shè)備沒有特別要求，并且能 夠高濃度制備（可達1〇1°~10叩即/mL)。（2)與腸道病毒的傳統(tǒng)指示生物如大腸菌群、糞 鏈球菌等相比，瞻菌體MS2的生物結(jié)構(gòu)、組成成分、復制方式和消毒抗性等與腸道病毒更加 相似。B.Benoit等對不同類型水樣的檢測表明，可培養(yǎng)的腸道病毒和瞻菌體MS2在數(shù)量上 存在很好的對應(yīng)關(guān)系。（3)瞻菌體在有腸道病毒污染的水體中普遍存在，且數(shù)量甚多，對水 體凈化和消毒處理的抵抗力至少與腸道病毒相當；同時其不會在水中繁殖，不具有致病性， 可W通過簡單、快速、低廉的方法檢測。
[0004] 隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，W聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerasechain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的各種分子生物學診斷技術(shù)，因其具有特異性強、靈敏度高、線性范 圍廣、重復性好、定量準確、方便快捷等優(yōu)點，成為生物醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)最有價值的研究手段，已 經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床標本的檢測。在核酸檢測過程中，分子生物學檢測方法的準確性容易 受到W下多種因素的影響；（1)儀器控溫程序不正確，或不能精確控溫；（2)逆轉(zhuǎn)錄酶和化q 酶活性低、反應(yīng)液質(zhì)量差，引物、探針設(shè)計不合理；（3)核酸模板提取量少，檢測的目的片段 降解，殘留的己醇和酪量過大，樣品雜質(zhì)去除不干凈，如糞便標本中的膽鹽，血液中的血紅 素及尿中的尿素會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；(4)病毒核酸序列發(fā)生變異；（5)實驗操作人 員的操作失誤。因此，在做核酸特別是RNA擴增實驗時，需要有嚴格的質(zhì)量控制措施，即需 要有特定的質(zhì)控物，同時，要對核酸進行定量測定，通常還須有核酸標準物。質(zhì)控物和標準 物須具有W下特點；（1)容易制備；（2)在貶存和使用過程中具有足夠的穩(wěn)定性；（3)無生 物傳染性；(4)能監(jiān)測檢測的全過程，結(jié)果可靠。目前RNA病毒質(zhì)控物主要有裸露的RNA片 段、病毒顆粒和盎甲R(armoredRNA)。大腸桿菌瞻菌體MS2是包膜蛋白包裹結(jié)構(gòu)RNA結(jié)構(gòu)， 與RNA病毒結(jié)構(gòu)相似，且MS2無致病性；在食源性RNA病毒檢測體系中加入大腸桿菌瞻菌體 MS2作為內(nèi)部質(zhì)控物，是RNA病毒檢測較為理想的內(nèi)部質(zhì)控物質(zhì)。因而此類生物質(zhì)可作為的 質(zhì)控物來監(jiān)控病毒顆粒裂解效率和核酸提取等整個檢測過程，彌補了裸露RNA片段作為質(zhì) 控物和標準物的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌瞻菌體MS2標準物質(zhì)，濃度為 1. 57Xl〇iip化/mL;該標準物質(zhì)在食源性RNA病毒檢測過程中可被用作為檢測過程質(zhì)控物 質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明為解決其技術(shù)問題采用W下的技術(shù)方案：
[0007] 一種大腸桿菌瞻菌體MS2標準物質(zhì)的制備，包括下列步驟：
[000引（一）宿主菌的制備
[0009] 先用接種環(huán)挑出一點ATCC15597大腸桿菌菌種接種在TSA-YE平板上過夜培養(yǎng)； 挑取1移菌環(huán)細菌至lOmLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
[0010] (二）大量瞻菌體MS2制備
[0011] 1、將（一）制備的宿主菌培養(yǎng)液按照0. 5% (體積比）接種到LB液體培養(yǎng)基中， 36 +rc，150巧m振蕩培養(yǎng)4-化后，按0.5-1 % (體積比）的比例將瞻菌體（108~10 9p化/ mL)接種到上述細菌培養(yǎng)液中，確保瞻菌體個數(shù)與細菌個數(shù)之比在0. 1~2. 0。
[001引 2、將接種后細菌培養(yǎng)液在36+rC，150巧m振蕩培養(yǎng)化或過夜，取培養(yǎng)液在10 OOOg下離屯、lOmin，收集上清液；用孔徑為0. 22 y m的膜過濾即得純化的瞻菌體懸液。
[0013] 3、測定瞻菌體的效價
[0014] 采用雙層瓊脂法。具體操作如下：
[0015] 將待測瞻菌體懸液做10倍系列稀釋至1〇1°倍，取宿主菌培養(yǎng)液0. 2mL分別加至 各平皿的底層營養(yǎng)瓊脂，吸取適當稀釋度的瞻菌體懸液0.ImL分別加至各平皿與宿主菌混 合，倒入2~3血冷至50°C的上層瓊脂，混勻，凝固后37°C倒置培養(yǎng)18~2化，每一稀釋梯 度做3個重復，計算瞻菌斑數(shù)。取瞻斑數(shù)在30~300個之間的平皿的平均值計算效價：
[0016] 效價（P化/血）=平均瞻斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X 10
[0017] 4、瞻菌體的稀釋
[0018] 采用懸浮培養(yǎng)基（SM)對瞻菌體溶液進行稀釋，并分裝于2mL細胞凍存管中保存。
[0019] (S)穩(wěn)定性測試
[0020] 不同時間點分別取25°C、4°C、-80°C保存的樣品3管進行瞻菌體效價測定，并進行 統(tǒng)計分析各保存條件的穩(wěn)定性；25°C、4°C取樣時間持續(xù)6個月，每1個月取樣一次；-80°C 取樣時間持續(xù)24個月，每2個月取樣一次。
[0021] (四）均勻性測試
[0022] 取-8(TC保存的樣品15管進行瞻菌體效價測定，并進行統(tǒng)計分析，評估標準樣品 的均勻性。
[0023](五）標準樣品定值
[0024] 根據(jù)均勻性測試的結(jié)果進行不確定度評估，并進行標準樣品的定值，該大腸桿菌 瞻菌體MS2標準樣品濃度為1. 57Xl〇iip化/mL。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：
[0026] 本發(fā)明制備的瞻菌體MS2可W作為食源性RNA病毒檢測過程中可被用作為檢測過 程質(zhì)控物質(zhì)，均勻性和穩(wěn)定性好，效價高。
【附圖說明】：
[0027] 圖1為本發(fā)明實施例1大腸桿菌瞻菌體MS2效價測試圖。
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例2大腸桿菌瞻菌體MS2實時巧光RT-PCR標準曲線.縱坐標 為Ct值，橫坐標為大腸桿菌瞻菌體MS2濃度（P化/mL)。
【具體實施方式】：
[0029] 下面通過具體實施例并結(jié)合附圖進一步闡述本發(fā)明。
[0030] 實施例1 ;大腸桿菌瞻菌體MS2標準樣品制備
[0031] (一）宿主菌的制備
[0032] 先用接種環(huán)挑出一點ATCC15597大腸桿菌菌種接種在TSA-YE平板上過夜培養(yǎng)； 挑取1移菌環(huán)細菌至lOmLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
[0033] (二）大量瞻菌體MS2制備
[0034] 1、將（一）制備的宿主菌培養(yǎng)液按照0. 5% (體積比）接種到LB液體培養(yǎng)基中， 36 +rc，150巧m振蕩培養(yǎng)4-化后，按0.5-1 % (體積比）的比例將瞻菌體（108~10 9p化/ mL)接種到上述細菌培養(yǎng)液中，確保瞻菌體個數(shù)與細菌個數(shù)之比在0. 1~2. 0。
[0035] 2、將接種后細菌培養(yǎng)液在36 +rC，150巧m振蕩培養(yǎng)化或過夜，取培養(yǎng)液在10 OOOg下離屯、lOmin，收集上清液；用孔徑為0. 22ym的膜過濾即得純化的瞻菌體懸液。
[0036] 3、測定瞻菌體的效價
[0037] 采用雙層瓊脂法。具體操作如下：
[0038] 將待測瞻菌體懸液做1