專(zhuān)利名稱(chēng)：一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株lt3及其選育方法和產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3及其選育方、法和 產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化。
背景技術(shù)：
纖維素材料是自然界中最豐富的可再生資源。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇 等液體燃料，不僅可以作為新資源新能源為人類(lèi)造福，緩解或解決化石能源對(duì)環(huán)境污染的問(wèn) 題，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)業(yè)剩余資源的高效利用，現(xiàn)已受到世界各國(guó)的普遍重視。采用微生 物技術(shù)處理秸稈是當(dāng)前研究最多的一種秸稈處理方法，纖維素酶能將天然纖維素降解，生成 纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖，然而目前主要制約纖維素材料轉(zhuǎn)化乙醇產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因 素之一是纖維素酶效率低下，造成生產(chǎn)成本過(guò)高。因此，篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降 解微生物菌株以及相關(guān)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前研究較多的是霉菌，其中木霉、 曲霉、根霉和青霉均具有較強(qiáng)的酶活力，尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型。而對(duì) 細(xì)菌的研究很少有報(bào)道。由細(xì)菌所產(chǎn)生的纖維素酶一般最適pH為中性至偏堿性，近20年來(lái)， 隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，細(xì)菌 纖維素酶制劑已顯示出良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3及其選育方法和產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化， 對(duì)研究纖維素酶作用機(jī)理及纖維素酶制劑的生產(chǎn)具有潛在理論和應(yīng)用價(jià)值；該纖維素酶菌株 LT3能產(chǎn)生單一組份的纖維素酶，便于分離純化，是纖維素酶基因克隆的理想材料，對(duì)于構(gòu) 建纖維素分解工程菌株以及探索纖維素酶作用機(jī)制有著潛在的理論和實(shí)踐意義，方法簡(jiǎn)單快 速，易于實(shí)施。
本發(fā)明的產(chǎn)堿性纖維素酶菌株為蠟狀芽孢桿菌(泡"77iAS cerei/s) LT3:所述產(chǎn)堿性纖 維素酶菌株LT3的16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌(few77"s cerews) LT3，已經(jīng)于2009年1月16日保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2879。
本發(fā)明的菌株LT3形態(tài)學(xué)鑒定使用革蘭氏染色法對(duì)Z7^進(jìn)行染色，結(jié)果表明該菌株 為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，菌體呈桿狀，有芽孢，呈橢圓形，位于中央或近中央。周生鞭毛。其繁 殖體不耐熱，12(TC滅菌20分鐘可被殺死。該菌株適宜pH發(fā)酵條件為7.0-8.5，與其他蠟狀 芽孢桿菌相比，該菌株具有產(chǎn)堿性纖維素酶特征。
本發(fā)明的通過(guò)對(duì)從腐爛朽木及其附近土壤中得到的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離純化得到16
4株纖維素分解菌，經(jīng)剛果紅染色鑒定和液體發(fā)酵獲得一株纖維素酶分泌量較高的細(xì)菌LT3， 并對(duì)其進(jìn)行菌種初歩鑒定，再通過(guò)克隆其16srDNA序列，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為蠟 狀芽孢桿菌。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明蠟狀芽孢桿菌(泡^7A^cere^) LT3分離自朽木的特殊環(huán) 境中，具有較寬的適應(yīng)pH范圍，能產(chǎn)生胞外纖維素酶，并且所產(chǎn)的纖維素酶具有耐受堿性環(huán) 境的特性。除了便于分離純化之外，該菌還是纖維素酶基因克隆的理想材料，對(duì)于構(gòu)建纖維 素分解工程菌株以及探索纖維素酶作用機(jī)制有著潛在的理論和實(shí)踐意義。本發(fā)明通過(guò)剛果紅鑒定板來(lái)鑒定產(chǎn)纖維素酶菌是一種快速簡(jiǎn)便的篩選方法，透明圈直徑 和鑒定板孔徑大小的比值能夠直接的反映該菌產(chǎn)纖維素酶的能力，其原理是剛果紅是一種能 夠和大分子多糖相結(jié)合的染色劑，染色之后能和纖維素結(jié)合形成紅色，產(chǎn)纖維素酶菌在CMC 平板上培養(yǎng)后產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素水解成小分子的還原糖，在用剛果紅染色之后沒(méi)有被 水解的纖維素能夠和剛果紅結(jié)合顯紅色，而水解的部位則不能和剛果紅結(jié)合而出現(xiàn)透明圈。本發(fā)明應(yīng)用16S rDNA序列分析的分子生物學(xué)技術(shù)，總DNA提取、PCR擴(kuò)增、16S rDNA測(cè) 序及序列分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定該降解纖維素菌，能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)微生物種屬進(jìn) 行鑒定。


圖1是使用革蘭氏染色法對(duì)本發(fā)明的菌株ZW進(jìn)行染色后菌株顯微圖。 圖2是本發(fā)明部分芽孢桿菌以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 圖3為本發(fā)明菌株ZW PH優(yōu)化水解圈大小圖。 圖4為本發(fā)明菌株Z"基因組DNA。 圖5是本發(fā)明菌株Z" PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
以下是本發(fā)明的具體選育方法，并結(jié)合實(shí)施例充分說(shuō)明本發(fā)明。選育實(shí)施例1材料與方法 1.1材料主要試劑羧甲基纖維素鈉、硝基水楊酸試劑(稱(chēng)取酒石酸鉀鈉91g，溶于500mL蒸餾水中，加熱至50 。C，再依次加入3， 5-二硝基水楊酸(DNS) 3. 5g， NaOH20g，苯酚2. 5g，無(wú)水亞硫酸鈉2. 5g， 攪拌完全溶解。冷卻后用蒸餾水定容至1L。儲(chǔ)于棕色瓶中4'C保存，放置一周后使用，使用 前過(guò)濾。)、PH4.6醋酸緩沖液；所述醋酸緩沖液由冰醋酸與醋酸鈉配置、剛果紅、無(wú)水葡萄 糖，PCRmix酶(購(gòu)自北京天根公司)，膠回收試劑盒(購(gòu)自大連TaKaRa公司)，化學(xué)試劑均為分析純；培養(yǎng)基(滅菌條件均為120°C 20min):富集培養(yǎng)基，1L中含CMC-Na 10g黃豆餅粉5g ( H4) 2S04 2.5g pH 8. 5。 初篩培養(yǎng)基，1L中含CMC-NalOg黃豆餅粉5g (Mi)2Sa'2. 5g pH 8. 5瓊脂1. 5%。 斜面保藏培養(yǎng)基，1L中含麩皮70g黃豆餅粉30g (NH4)2S042.5g pH 6.0 瓊脂條2%。液體發(fā)酵培養(yǎng)基，1L中含CMC-NalOg麩皮10g (NH》2S04 3gMgS04 0. 4g酵母膏0. 5gCaCl20.4g KH2P04 lg蛋白胨2g pH8.5。1.2方法樣品采集來(lái)自福州市閩侯縣銀雕村木屑廠，采集腐爛的朽木屑及其附近土壤。共9樣，用 于分離選育纖維素降解菌。(1) 富集初篩取lg樣品粉末置于無(wú)菌三角瓶(含30ml富集培養(yǎng)基)中，25。C和220rpm 下，搖床培養(yǎng)48h。取富集后的培養(yǎng)液按10—2 、 10—3 、 10 —4、 10 —6、 l(T配制不同梯 度稀釋液，分別涂布于初篩培養(yǎng)基中，倒置恒溫培養(yǎng)箱28'C,培養(yǎng)65h。往平板中加入 lmg/mL剛果紅溶液，染色lh，棄去染液后，加入10-12ml的1 mol/L的NaCl溶液，洗 滌lh。分離能夠旺盛生長(zhǎng)，并在剛果紅染色、NaCl脫色后可以觀察到菌落周?chē)忻黠@ 透明水解圈的菌株，接種于斜面培養(yǎng)基中25"C培養(yǎng)48h后，4'C低溫保存。(2) 發(fā)酵復(fù)篩將初篩得到的產(chǎn)纖維素酶菌株以1環(huán)/30ml培養(yǎng)基的接種量接種到液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，于30'C， 180r/min下，振蕩培養(yǎng)5天后，測(cè)定初酶液的CMC酶活和濾紙酶 活，最終以酶活值作為篩選纖維素酶高產(chǎn)菌的標(biāo)準(zhǔn)，篩選CMC酶活和濾紙酶活高的菌株。 采用3， 5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定CMC酶活和濾紙酶活(FPA)。酶活測(cè)定方法采用 魏雅琴、李紅玉.纖維素高產(chǎn)菌選育研究進(jìn)展及未來(lái)趨勢(shì)[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2008， Vol. 44記載的方法。(3) 菌種鑒定經(jīng)初篩、復(fù)篩得到CMC酶活及濾紙酶活都較高的菌株，觀察其菌落的形態(tài)特 征顏色，形狀，菌落質(zhì)地等；通過(guò)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌的形態(tài)以及孢子形 態(tài)；依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)資料，初步鑒定菌屬。(4) 16s rDNA序列克隆細(xì)菌基因組DNA的提取按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(馬學(xué)軍， 舒躍龍.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].第四版.科學(xué)出版社2005 .1-1109 .)中的方法 進(jìn)行。使用上游引物5， AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'，下游引物5， MG GAG GTG ATC CACCC3'進(jìn)行16s rDNA序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性3min， (94。C45s, 53 °C45s, 72。C2min) X 30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min， 4。C終止。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。將PCR產(chǎn)物割膠回收純化后送上海生工公司測(cè)序。(5)序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將16s rDNA序列克隆結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov)。用Blast軟件在GenBank網(wǎng)站上進(jìn)行相似性搜索， 獲取相近典型菌株的基因序列。利用Clustalw2 (LarkinMA， Blackshields G， Brown NP, et al. Clustal W and Clustal X version 2. 0. [J]. Bioinformatics， 2007， 23: 2947-2948.)在線(xiàn)工具將序列及其相似性序列進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，并用鄰接法構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖，如圖2中所示。2.結(jié)果與分析菌株的初篩將9種土樣制備的菌懸液涂布于初篩平板上，待生長(zhǎng)出單菌落后，用剛果紅染色。結(jié)果表 明，其中100余個(gè)菌落周?chē)a(chǎn)生清晰水解圈，這些菌落多為霉菌和細(xì)菌。挑取其中16個(gè)菌落 生長(zhǎng)旺盛且水解圈較大的菌種進(jìn)入復(fù)篩。 Z7^菌株的分離將16株產(chǎn)纖維素酶的菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)得其初酶液的CMC酶活和濾紙酶活，選出酶 活均較高的菌株Zn。初步鑒定得ZW菌株生長(zhǎng)較快具有較高纖維素分解能力的細(xì)菌，其初 酶液的CMC酶活為12. 35. u/ml,濾紙酶活為9. 12 u/ml。 培養(yǎng)條件優(yōu)化 PH條件對(duì)產(chǎn)酶活性的影響將iT難株于發(fā)酵培養(yǎng)基中3(TC 180r/min培養(yǎng)72h (接種量l接種環(huán)/30ml培養(yǎng)基)，測(cè) 定培養(yǎng)基pH分別為5.5、 7.0、 8.5時(shí)發(fā)酵液CMC酶的活力，如表l，并取發(fā)酵液40u l于酶活鑒 定板中觀察其水解圈大小，如圖3所示表l PH條件對(duì)Z7滴株纖維素酶活力的影響pH5.57.08.5CMC酶活(u/mL)12. 3013. 4912.36pH條件優(yōu)化結(jié)果表明，Z"菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基最優(yōu)起始ra為7. 0，但是在pH8. 5時(shí)仍然保 留有較高的活性。 菌株形態(tài)學(xué)鑒定使用革蘭氏染色法對(duì)丄W進(jìn)行染色，結(jié)果表明該菌株為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，菌體呈桿狀，如 圖1所示。16s rDNA序列克隆結(jié)果PCR擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，獲得1條約1500bp大小的特異DNA帶，如圖4、 5所示，7基因組DNA的條帶清晰，無(wú)降解。 序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析以及Blast比對(duì)，與之相似度達(dá)99%得菌株大部分為芽孢桿 菌，主要有蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus )、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、 炭疽桿菌(Bacillus anthracis),選取相似度達(dá)99%的14株芽孢桿菌16S rDNA序列，經(jīng) Clustalw2軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-Joining-method)進(jìn)行聚類(lèi)分析和 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，如圖2顯示相關(guān)芽孢桿菌的進(jìn)化地位，從14序列中劃分出3大類(lèi)群， 所處類(lèi)群中16S rDNA基因序列兩兩之間的相似值達(dá)98y。以上，其中Z"菌株與以蠟狀芽孢桿 菌為主的的亞群處在同一分枝上，與Bacillus cereus isolate HKS 2-1株距離最近。16srDNA 測(cè)序結(jié)果表明乙"菌株與蠟狀芽孢桿菌有很高的同源性。 功能用途實(shí)驗(yàn)將LT3菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中3(TC 180r/min培養(yǎng)72h (接種量1接種環(huán)/30ml培養(yǎng)基)， 測(cè)定培養(yǎng)基pH分別為5.5、 7.0、 8.5時(shí)發(fā)酵液的CMC酶活力，并取發(fā)酵液40 u 1于酶活鑒定 板中觀察其水解圈大小(如圖3所示)pH5.57.08.5CMC酶活12. 3013. 4912. 36結(jié)果表明，LT3能夠產(chǎn)生胞外纖維素酶，直接將酶分泌到培養(yǎng)基中，運(yùn)用在工業(yè)上能節(jié)省細(xì) 胞破碎這一步驟，便于提取和純化。并且該酶在較寬的培養(yǎng)基pH環(huán)境下都具有活性，尤其是 能在pH8.5的堿性條件下具有較高的活性，在工業(yè)上，該特性具有很好的應(yīng)用前景，比如洗 滌劑行業(yè)，紡織業(yè)等等。而普通的蠟狀芽孢桿菌， 一般不具有產(chǎn)生胞外纖維素酶的能力。 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)采集不同的地區(qū)的腐爛朽木及其附近土壤作為樣品，按照以上實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟。 在初篩平板中得到一株變色圈較大的菌株，編號(hào)為33，從形態(tài)上觀察，初步判斷該微生物為 細(xì)菌，將33接種于LB培養(yǎng)基平板上，劃線(xiàn)培養(yǎng)，挑取形態(tài)上相同的單菌落數(shù)個(gè)，同時(shí)分別 接種于初篩培養(yǎng)基和斜面保藏培養(yǎng)基中，對(duì)初篩培養(yǎng)基進(jìn)行剛果紅染色，在初篩培養(yǎng)基中這 些菌均能產(chǎn)生透明圈，可證明這些菌均能產(chǎn)生胞外纖維素酶。同時(shí)，將這些菌分別使用革蘭 氏染色法制片，于顯微鏡下觀察，可見(jiàn)菌體顯微形態(tài)一致，并且均為革蘭氏陽(yáng)性菌，可判斷 這些菌為同一種菌。取出接種有其中一株的斜面保藏培養(yǎng)基置于4度冷藏，并命名為L(zhǎng)T3。之后，對(duì)LT3進(jìn) 行分子分類(lèi)學(xué)的鑒定。由此可見(jiàn)，本發(fā)明具有高度重復(fù)性。核苷酸序列表 〈110〉福州大學(xué)〈120〉一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3及其選育方法和產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化 〈160〉 1 〈210〉 1 <211> 1093 〈212〉 DNA〈213〉蠟狀芽孢桿菌(泡w77〃s cere〃s) LT3 <220〉〈223〉該蠟狀芽孢桿菌(yfew77zA9 LT3 16S rDNA總長(zhǎng)1093。<400〉 1ggttattgggccgcgtgctataatgcaagtCg3gCg33tggattaag3gcttgctcttat60g鄉(xiāng)ttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgCCC3t33g3ctgggataac120tccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcg180gcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaac240ggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactg300agacacggcccag6ictcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaag360tctgacggagcaacgccgcgtg3gtg3tg3aggctttcgggtcgtaaaactctgttgtta420ggg3卿acaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggteiccteieic■cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatEicgtaggtggcaagcgttatccggaatta540ttgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgsaagcccacggctcaac600cgtgg鄉(xiāng)gtcattggaaactggg卿cttg3gtgc卿3gagga^3gtggaattccatg660tgtagcggtg朋atgcgt3g卿tatggaggaacaccagtggcg犯ggcgactttctggt720ctgtaactgacactgaggcgCg3朋gCgtggggagca縦aggattagataccctggtag780tccacgccgtaa3cg3tgsgtgct朋gtgtt卿gggtttccgccctttagtgctg犯gt840taacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgc肪ggctgaaactcaaggei3ttga900cgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcga^gaacctt3960ccaggtcttgacatcctctgacaccctagagatagggcttctccttcggg3gcagagtga1020caggtggtgcEltggttgtCgtcagctcgtgtcgtgagatgtggttagtcccgcacgagcg1080caacccttgatct10939
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3，其特征在于所述產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3的16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)堿性纖維素酶菌株Z7^，其特征在于所述產(chǎn)堿性纖維素酶菌株 丄W為蠟狀芽孢桿菌，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2879。
3. —種如權(quán)利要求1或2所述的堿性纖維素酶菌株的選育方法，其特征在于通過(guò)對(duì)從腐 爛朽木及其附近土壤中得到的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離純化得到16株纖維素分解菌，經(jīng) 剛果紅染色鑒定和液體發(fā)酵獲得一株纖維素酶分泌量較高的細(xì)菌LT3，并對(duì)其進(jìn)行菌種 初步鑒定，再通過(guò)克隆其16s rDNA序列，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為蠟狀芽孢桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的堿性纖維素酶菌株A"的選育方法，其特征在于所述選育方法 的具體如下主要試劑羧甲基纖維素鈉、硝基水楊酸試劑、PH4.6醋酸緩沖液；所述醋 酸緩沖液由冰醋酸與醋酸鈉配置、剛果紅、無(wú)水葡萄糖，PCRmix酶，膠回收試劑盒，化 學(xué)試劑均為分析純；培養(yǎng)基培養(yǎng)基的滅菌條件均為120°C 20min:富集培養(yǎng)基，1L中含CMC-Na 10g黃豆餅粉5g (NH4)2S04 2.5g pH 8.5 初篩培養(yǎng)基，1L中含CMC-Nal0g黃豆餅粉5g (NH4) 2S04 2. 5g pH 8. 5瓊脂1. 5% 斜面保藏培養(yǎng)基，1L中含麩皮70g黃豆餅粉30g (NH4)2S042.5g pH 6.0 瓊 脂條2%液體發(fā)酵培養(yǎng)基，1L中含CMC-Nal0g麩皮10g (NH4)2S04 3gMgS04 0. 4g酵 母膏0.5g CaCl20.4g KH2P04 lg蛋白胨2g pH8.5方法步驟(1) 樣品采集采集腐爛的朽木屑及其附近土壤，共9樣，用于分離選育纖維素降解菌；(2) 富集初篩取lg樣品粉末置于無(wú)菌三角瓶中，所述無(wú)菌三角瓶中含30ml富集培養(yǎng) 基，在25'C和220rpm下，搖床培養(yǎng)48h;取富集后的培養(yǎng)液按10—2 、 10」、10 — 4、 10—6、 10—8配制不同梯度稀釋液，分別涂布于初篩培養(yǎng)基中，倒置恒溫培養(yǎng)箱 28°C,培養(yǎng)65h，往平板中加入lmg/tnL剛果紅溶液10ml，染色lh，棄去染液后， 加入10-12ml的1 mol/L的NaCl溶液，洗滌lh，分離能夠旺盛生長(zhǎng)，并在剛果紅 染色、NaCl脫色后能觀察到菌落周?chē)忻黠@透明水解圈的菌株，接種于斜面保藏培 養(yǎng)基中25"培養(yǎng)48h后，4'C低溫保存；(3) 發(fā)酵復(fù)篩將初篩得到的產(chǎn)纖維素酶菌株以1環(huán)/30ml培養(yǎng)基的接種量接種到液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3(TC， 180r/min下，振蕩培養(yǎng)5天后，測(cè)定初酶液的CMC酶活 和濾紙酶活，最終以酶活值作為篩選纖維素酶高產(chǎn)菌的標(biāo)準(zhǔn)，篩選CMC酶活和濾紙酶活高的菌株，采用3， 5-二硝基水楊酸法測(cè)定CMC酶活和濾紙酶活，酶活測(cè)定方 法采用魏雅琴、李紅玉.纖維素高產(chǎn)菌選育研究進(jìn)展及未來(lái)趨勢(shì)[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， Vol.44記載的方法;(4) 菌種初步鑒定經(jīng)初篩、復(fù)篩得到CMC酶活及濾紙酶活都較高的菌株，觀察其菌落 的形態(tài)特征；通過(guò)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌的形態(tài)以及孢子形態(tài)；依據(jù)現(xiàn)有 技術(shù)文獻(xiàn)資料，初步鑒定菌屬；(5) 16s rDNA序列克隆細(xì)菌基因組DNA的提取按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中的 方法進(jìn)行使用上游引物5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'，下游引物5' MG GAG GTG ATC CAC CC 3'進(jìn)行16s rDNA序列擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:95。C預(yù)變性3min， 按照94。C45s， 53。C45s， 72。C2min做30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min， 4。C終止；1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；將PCR產(chǎn)物割膠回收純化后測(cè)序；(6) 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將16s rDNA序列克隆結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)； 用Blast軟件在GenBank網(wǎng)站上進(jìn)行相似性搜索，獲取相近典型菌株的基因序列； 利用Clustalw2在線(xiàn)工具將序列及其相似性序列進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，并用鄰接法構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖；(7) 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析以及Blast比對(duì)，與之相似度達(dá)99%得菌株大部分為芽 孢桿菌，選取相似度達(dá)99%的14株芽孢桿菌16S rDNA序列，經(jīng)Clustalw2軟件進(jìn) 行多序列比對(duì)，采用鄰接法進(jìn)行聚類(lèi)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，顯示相關(guān)芽孢桿菌 的進(jìn)化地位，從14序列中劃分出3大類(lèi)群，Z"所處類(lèi)群中16S rDNA基因序列兩 兩之間的相似值達(dá)98%以上，其中Z"菌株與以蠟狀芽孢桿菌為主的的亞群處在同 一分枝上，與Bacillus cereus isolate服S 2-1株距離最近；16srDNA測(cè)序結(jié)果 表明A7^菌株與蠟狀芽孢桿菌有很高的同源性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的堿性纖維素酶菌株Z"的選育方法，其特征在于所述硝基水楊 酸試劑的配置為稱(chēng)取酒石酸鉀鈉91g，溶于500mL蒸餾水中，'加熱至5CTC，再依次加 入3， 5-二硝基水楊酸(DNS) 3.5g，NaOH 20g,苯酚2. 5g，無(wú)水亞硫酸鈉2. 5g，攪拌完 全溶解；冷卻后用蒸餾水定容至1L;儲(chǔ)于棕色瓶中4'C保存，放置一周后使用，使用前 過(guò)濾。
6. —種如權(quán)利要求1或2所述的堿性纖維素酶菌株Z"的產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化，其特征在于所述LT3菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基起始PH為7.0-8.5。
全文摘要
本發(fā)明提供一株產(chǎn)堿性纖維素酶菌株LT3及其選育方法和產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化，通過(guò)對(duì)從腐爛朽木及其附近土壤中得到的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離純化、經(jīng)剛果紅染色鑒定和液體發(fā)酵獲得一株纖維素酶分泌量較高的細(xì)菌LT3、經(jīng)初步鑒定、克隆序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為蠟狀芽孢桿菌；16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明對(duì)研究纖維素酶作用機(jī)理及纖維素酶制劑的生產(chǎn)具有潛在理論和應(yīng)用價(jià)值；該纖維素酶菌株LT3能產(chǎn)生單一組份的纖維素酶，便于分離純化，是纖維素酶基因克隆的理想材料，對(duì)于構(gòu)建纖維素分解工程菌株以及探索纖維素酶作用機(jī)制有著潛在的理論和實(shí)踐意義，方法簡(jiǎn)單快速，易于實(shí)施。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101555461SQ20091011142
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者暾 呂, 呂靜琳, 李殿殿, 蓉 鄭, 黃愛(ài)玲 申請(qǐng)人:福州大學(xué)