專利名稱：鴨疫里默氏桿菌抗體間接elisa方法檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及鴨的一種細菌抗體的快速診斷方法和器具，更具體的講是一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌病(Riemerelllaanatipestifer infection, RAI)是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。目前該病呈世界范圍分布，已在所有的集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國家發(fā)現(xiàn)。該病主要侵害1 8周齡(尤其2 8周齡)雛鴨、雛鵝及雛火雞。該病常呈急性或慢性敗血癥過程，主要以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。 該病的發(fā)病率可達9 %以上，致死率可高達75 %以上，耐過病鴨常常長成殘次鴨或僵鴨，飼料轉(zhuǎn)化率降低，生長發(fā)育遲緩。此外，由該病所引起的輸卵管炎也是影響鴨成年后產(chǎn)蛋率低下的最重要原因之一。鴨疫里默氏桿菌的血清型復雜，目前公認有21種血清型，在我國血清型發(fā)展越來越復雜，藥物預防是我國控制該病的主要措施之一，但目前很多研究報告表明鴨疫里默氏桿菌已對生產(chǎn)上的大多常用藥物產(chǎn)生耐藥性，同時，大量使用藥物也給食品安全造成極大威脅，免疫接種已將逐漸取代藥物預防成為控制該病的安全有效措施之一。若要開展鴨疫里默氏桿菌病的流行情況和感染范圍的調(diào)查，有必要建立一種快速、敏感，特異、便于大規(guī)模應用且不需要撲殺動物的血清學檢測診斷方法。因此研制開發(fā)用于鴨疫里默氏桿菌抗體檢測的特異的、敏感的、生物安全度高的、 適合于基層使用的診斷檢測的器具，對鴨免疫水平進行實時監(jiān)控和建立科學、靈活的鴨疫里默氏桿菌的免疫程序、以及對疫病的預防和控制有重要意義。經(jīng)有關報道表明鴨疫里默氏桿菌的外膜蛋白ompA基因存在于所有的參考菌株中。在不同的血清型中，ompA基因顯示出較小的異源性。OmpA是一個保守的且強的抗原決定簇，因此，不僅可作為亞單位疫苗的候選成分之一，而且還具有很好的血清學檢測價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，通過 pET-28a表達載體構(gòu)建了能表達鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白基因ompA的載體，并將表達的重組蛋白建立檢測相應抗體，可用于鴨疫里默氏桿菌抗體的檢測。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接 ELISA檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有a)抗體檢測板，b)酶結(jié)合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f)10X濃縮洗滌液，g)底物顯色液A，h)底物顯色液 B和i)終止液，其中所述的抗體檢測板為包被鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶標板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體，陽性對照為鴨疫里默氏桿菌標準菌株免疫雛鴨制備高免血清，陰性對照為經(jīng)篩選獲得的未免疫鴨疫里默氏桿菌的雛鴨的陰性血清。
按上述方案，所述的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的制備方法為利用PCR技術(shù)擴增鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的原核表達質(zhì)粒，命名為PET-^a-OmpA ；將質(zhì)粒pETj8a-0mpA轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為BLpET-28a-0mpA，將BLpET-28a_0mpA在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導表達并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中，將重組外膜蛋白通過親和層析進行純化后復性。按上述方案，所述的抗體檢測板的制備方法為將純化復性后的重組外膜蛋白用抗原包被液稀釋為1. 5μ g/mL的終濃度，向可拆96孔酶標板的每個聚苯乙烯微孔中加入 100 μ L，37°C條件下包被2h，用洗滌液洗滌5minX 4次，甩干，每孔加封閉液100 μ L，37°C反應池，用PBST緩沖液洗滌5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護 3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存?zhèn)溆谩?按上述方案，所述的抗原包被液為PBS緩沖液，所述的洗滌液為PBST緩沖液，所述的封閉液為1% (w/v)牛血清白蛋白的PBST緩沖液。按上述方案，所述的辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋。按上述方案，所述的樣品稀釋液為按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST緩沖液；IOX濃縮洗滌液為含0. 5% (ν/ν)吐溫-20的0. IM磷酸鹽緩沖液；底物顯色液A為 0. 2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液，底物顯色液B為含0. 05%( ν/ν)過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2Μ硫酸溶液。所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒的應用方法，其特征在于包括有以下步驟
1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；
2)將待檢血清用樣品稀釋液按體積1 100稀釋，按100 μ 1/孔加入到抗體檢測板中， 設陰性對照、陽性對照，并設只加100 μ 1樣品稀釋液作為空白對照，37°C孵育20-45分鐘， 甩干；
3)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
4)每孔加100μ 1的酶結(jié)合物工作液，空白對照不加，37°C孵育20-45分鐘，甩干；
5)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
6)依次每孔加入50μ 1底物顯色液A和50 μ 1底物顯色液B，37°C避光孵育5_15分
鐘；
7)每孔加50μ 1終止液，用酶標儀在630nm波長下讀取每孔光吸收值。鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其檢測樣本的判定標準為在最佳工作條件下，對收集的30份無鴨疫里默氏桿菌抗體的鴨血清進行間接ELISA測定，求得OD 平均值(Average)X為0. 099，標準差(Standard Difference)SD為0. 022，并設定陰陽性臨界值為X+3SD為0. 166，大于該值定為陽性，小于為陰性。本發(fā)明有益的積極效果是試劑盒操作簡單，所需儀器要求不高，人人都可操作， 能較好滿足不同層次的需要，如疫病監(jiān)測、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景，具有下列優(yōu)點
1)特異性強，敏感性高，安全性好。鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒以基因工程表達的重組外膜蛋白為基礎制備而成；有關報道表明鴨疫里默氏桿菌的外膜蛋白基因存在于所有的鴨疫里默氏桿菌的參考菌株中。重組外膜蛋白安全性好，不含無關雜蛋白，能與鴨疫里默氏桿菌陽性血清特異結(jié)合，不與鴨其它疫病陽性血清發(fā)生交叉反應。具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性；
2)操作簡便快速。使用鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒檢測鴨疫里默氏桿菌抗體時，無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在1-2小時內(nèi)即可判定檢測結(jié)果；
3)結(jié)果判定形象、準確、可靠。鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒可根據(jù)顯色的深淺初步判定檢測結(jié)果，檢測孔出現(xiàn)藍色即為陽性，無色即為陰性，結(jié)果判定形象。再采用酶標儀機讀數(shù)，可更精確檢測結(jié)果，減少主觀性，準確可靠；
4)成本低、投資少。該試劑盒可大批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。


圖1為鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA基因的PCR擴增產(chǎn)物；
其中泳道M為DL2000 DNA Marker ；泳道1為鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA的PCR 產(chǎn)物；
圖2重組質(zhì)粒pET28a(+)-0mpA雙酶切鑒定；
其中泳道 Ml 為 DL2000 DNA Marker ；泳道 M2 為 DL15000 DNA Marker ；泳道 1 為重組質(zhì)粒pET28a (+) -ompA雙酶切鑒定；
圖3重組蛋白ompA表達和純化后的SDS-PAGE分析；
其中泳道M為高分子量蛋白質(zhì)Marker ；泳道1為超聲破碎的菌液沉淀蛋白；泳道2為經(jīng)親和層析純化后的目的蛋白ompA ；
圖4重組ompA蛋白用免疫印跡試驗(SDS-PAGE)分析；
其中泳道M為高分子量蛋白質(zhì)Marker ；泳道1為鴨疫里默氏桿菌標準陽性血清檢測到的重組外膜蛋白ompA。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳細的說明，但是此說明不會構(gòu)成對本發(fā)明的限制。一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，該試劑盒包括有a)抗體檢測板，b)酶結(jié)合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f) 10X濃縮洗滌液，g) 底物顯色液A，h)底物顯色液B和i)終止液，其中所述的抗體檢測板為包被鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白(ompA)的可拆96孔聚苯乙烯酶標板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體，陽性對照為鴨疫里默氏桿菌標準菌株免疫雛鴨制備高免血清，陰性對照為經(jīng)篩選獲得的未免疫鴨疫里默氏桿菌的雛鴨的陰性血清。所述的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的制備方法為利用PCR技術(shù)擴增鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的原核表達質(zhì)粒，命名為pETj8a-0mpA ；將質(zhì)粒pETj8a-0mpA轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為BLpET-28a-0mpA，將BLpET-28a_0mpA在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導表達并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中，將重組外膜蛋白通過親和層析進行純化后復性。所述的抗體檢測板的制備方法為將純化復性后的重組外膜蛋白用抗原包被液稀釋為1. 5 μ g/mL的終濃度，向可拆96孔酶標板的每個聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C條件下包被池，用洗滌液洗滌5minX4次，甩干，每孔加封閉液100 μ L，37°C反應池，用PBST 緩沖液洗滌5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存?zhèn)溆?。所述的抗原包被液為PBS緩沖液，所述的洗滌液為PBST緩沖液，所述的封閉液為 1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液。所述的辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體用磷酸鹽緩沖液按1:5000比例稀釋。所述的樣品稀釋液為按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST緩沖液；IOX濃縮洗滌液為含0. 5% (ν/ν)吐溫-20的0. IM磷酸鹽緩沖液；底物顯色液A為0. 2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液，底物顯色液B為含0. 05% (ν/ν)過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2Μ硫酸溶液。所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒的應用方法，其特征在于包括有以下步驟
1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；
2)將待檢血清用樣品稀釋液按體積1 100稀釋，按100 μ 1/孔加入到抗體檢測板中， 設陰性對照、陽性對照，并設只加100μ 1樣品稀釋液作為空白對照，37°C孵育20-45分鐘， 甩干；
3)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
4)每孔加100μ 1的酶結(jié)合物工作液，空白對照不加，37°C孵育20-45分鐘，甩干；
5)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
6)依次每孔加入50μ 1底物顯色液A和50 μ 1底物顯色液B，37°C避光孵育5_15分
鐘；
7)每孔加50μ 1終止液，用酶標儀在630nm波長下讀取每孔光吸收值。本發(fā)明的發(fā)明要點是利用pET18a Prokaryotic Expression Systems構(gòu)建ompA 基因的原核表達載體，并將表達后的重組蛋白進行純化，在此基礎上建立ELISA方法組裝診斷試劑盒，并初步運用于臨床。本發(fā)明的具體制備方法如下
一、鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA基因的克隆、表達和純化 (1)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA基因擴增及表達載體的構(gòu)建根據(jù)NCBI Genbank中發(fā)表的ompA基因序列，自行設計一對表達引物(OmpAF 上游引物 5，-CCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATG-3，；0mpAR 下游引物 5，-CGCCTCGAGTTATTTTCTT TTCTTTTTTAC-3’)。以鴨疫里默氏桿菌標準菌株為模板，采用PCR技術(shù)擴增出ompA的目的基因，大小約為1200bp，如圖1所示。用BamHIAhoI雙酶切目的片段，獲得ompA基因，克隆入 pET-28a載體，用BamHIAhoI酶切鑒定，陽性克隆命名為pETj8a-0mpA，如圖2所示，并送上海生物工程有限公司測序，見SEQl。
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(2)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA基因的誘導表達和分析
將質(zhì)粒pET18a-0mpA轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為 BLpET-28a-0mpA，挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，待A600值達到0. 4 0. 6時， 加入 Isopropylthio-β -D-galactosi de (IPTG)至終濃度為 1. Ommol/L，進行誘導表達。收集誘導后lh、ai、3h、4h表達的菌體，于冰浴上進行超聲破碎，4°C 15000 Xg離心lOmin，取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在沉淀中可見有明顯的重組外膜蛋白表達，且重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中。(3)重組外膜蛋白的純化、復性和分析
按照鎳親和層析柱純化試劑盒的說明書通過親和層析進行蛋白的純化，再用透析的方法使其復性，結(jié)果可見一條42KDa的目的蛋白條帶，表明親和層析能獲得較純的目的蛋白。 Western blot分析表明復性后的重組外膜蛋白具有良好的免疫學活性。該蛋白可用于鴨疫里默氏桿菌陽性血清的檢測。二、以鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白為包被抗原制備ELISA的抗體檢測板，檢測鴨血清中鴨疫里默氏桿菌的抗體水平，并對影響試驗的各種條件進行選擇。1.抗原包被濃度與血清最佳稀釋度的選擇
采用方陣滴定，橫排作抗原倍比稀釋(12" g/mL、6/z g/mL、3/z g/mL、1. 5// g/mL、 0. 75// g/mL、0. 375// g/mL、0. 188// g/mL、0. 099// g/mL),縱排將陽性血清和陰性血清經(jīng)大腸桿菌裂解液處理后也分別進行倍比稀釋(1 50、1 100、1 200、1 400、1 800、做了 12個倍比稀釋)，每個稀釋度重復1次，取其平均值。結(jié)果，當抗原濃度為1. 5 μ g/mL,待檢血清以 1 100稀釋時，P/N值(陽性OD值與陰性OD值得比值)最大，非特異性較低。因此每孔150ng 的抗原包被量和1 100稀釋的血清濃度為最佳反應濃度。2.抗原包被條件的確定
用最適濃度抗原包被酶標板，包被條件分別為37°C條件下!3h，4°C過夜，37°C條件下 2h再4°C過夜，37°C 3h再4°C過夜。用0. 5% BSA溶液封閉，加入1:100稀釋的陽性血清進行ELISA測定，綜合結(jié)果4°C過夜包被最好。3.最佳封閉條件的確定
分別加入0. 5%BSA、1%BSA、0. 5%脫脂奶粉和1%脫脂奶粉，在37°C溫箱中作用 30Min、60Min、90Min、120Min。加入1 100稀釋的陽性血清進行ELISA測定結(jié)果1%BSA封閉60Min為最佳。4.血清最佳反應時間的確定
加入血清后，分別在37°C溫箱中作用30Min、60Min、90Min、120Min。用0. 5% BSA溶液封閉，加入1:100稀釋的陽性血清進行ELISA測定，結(jié)果待檢血清作用30Min為最佳。5. 二抗最佳反應時間的確定
加入1 5000稀釋的二抗后，分別在在37°C溫箱中作用30Min、60Min、90Min、120Min。用加入1:100稀釋的陽性血清進行ELISA測定，結(jié)果二抗作用60Min為最佳。6.底物最佳反應時間的確定
加入底物液后，避光條件下作用5Min、10Min、12Min、15Min，結(jié)果顯示避光條件下5Min 最佳。7.間接ELISA臨界值的確定在最佳工作條件下，對收集的30份無鴨疫里默氏桿菌抗體的鴨血清100倍稀釋后進行間接 ELISA 測定，求得 OD 平均值(Average) X 為 0. 099，標準差(Standard Difference) SD 為0. 022，并設定陰陽性臨界值為X+3SD為0. 166，大于該值定為陽性，小于為陰性。三、鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA試劑盒的制備 1.抗體檢測板的制備
將純化復性后的外膜蛋白用抗原包被液(PBS，0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液)稀釋為1. 5 μ g/mL的終濃度，向可拆96孔酶標板的每個聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C條件下包被2h，用洗滌液(PBST，含0. 05%Tween-20的PBS緩沖液)洗滌5minX4次，甩干，每孔加封閉液1%牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液100 μ L，37°C作用3h，PBST緩沖液洗滌 5minX4次，甩干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。2.酶結(jié)合工作液的制備
pH7. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)按1:5000比例稀釋HRP標記的兔抗鴨IgY。3.樣品洗滌液、稀釋液、終止液的配制
IOX濃縮洗滌液為含0. 5%吐溫-20的0. IM磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 2g，Na2HPO4 · 12H20 29g，NaCI 80g，定容至1000ml, pH7. 4，再加5ml吐溫_20);樣品稀釋液為含0. 1%BSA的IX 樣品洗滌液即量取0. Ig的BSA加入到IOOml的IX樣品洗滌液(PBST)中即可；終止液為 2M硫酸溶液，即量取111. 2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。4.陽性對照和陰性對照的制備
按常規(guī)方法制備陽性血清和陰性血清。選7日齡健康麻鴨10羽，用1型鴨疫里默氏桿菌滅活油乳劑疫苗三次免疫，每次免疫間隔14d。收集血清備用。陰性血清則直接采未免疫的15日齡雛鴨血清經(jīng)篩選后備用。將陰性血清、陽性血清用樣品稀釋液1 800倍稀釋(陽性血清0D630nm ^ 1.00, 陰性血清< 0. 10)按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾，作為鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白抗體間接ELISA檢測試劑盒的陰性對照和陽性對照。5.底物顯色液的配制
稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用IOOml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配底物顯色液A ；稱取21g—水檸檬酸，28. 2g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4), 6. 4ml0. 75%過氧化氫尿素，雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH值到4. 5-5. 0，配制底物顯色液B。6.試劑盒檢測操作程序其檢測程序為
1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；
2)將待檢血清用樣品稀釋液作1 100稀釋，將 οομ /孔加入抗體檢測板中，同時設空白(只加100 μ 1樣品稀釋液)、陰性對照(鴨標準陰性血清)、陽性對照(鴨疫里默氏桿菌標準陽性血清)，37°C孵育20-45分鐘，甩干；
3)每孔加洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
4)每孔加100μ 1酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37°C孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200 μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；
6)依次加50 μ 1底物顯色液A和50 μ 1底物顯色液B，混勻，37°C避光孵育5_15分鐘；7)每孔加50 μ 1終止液，用酶標儀在630nm波長下讀取每孔光吸收值(0D630nm值)。7.結(jié)果判定標準陰陽性臨界值為0.166，大于該值定為陽性，小于為陰性。四)鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒的鑒定 1.間接ELISA方法檢測試劑盒的特異性和重復性試驗
利用鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白ompA建立的間接ELISA方法檢測試劑盒檢測鴨源大腸桿菌、鴨多殺性巴氏桿菌、鴨鏈球菌、鴨源呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒感染鴨血清等陽性血清，結(jié)果OD值均小于0. 166，為陰性，表明該方法與上述病毒及細菌無交叉反應； 對效價高、中、低的三份血清進行了測定，計算本試驗的板間、板內(nèi)的變異系數(shù)(CV，是個體參數(shù)的標準差與平均數(shù)的比率)，結(jié)果分別在5%和9%以內(nèi)，表明該方法具有較好的重復性， 該檢測試劑盒具有很好的臨床應用價值。2.間接ELISA方法檢測試劑盒的阻斷試驗
將各4份陽性血清與陰性血清分別與濃度為1.5mg/ml的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白溶液按1:10(V/V)的比例混勻，37°C作用lh，IOOOOrpm離心20min取上清。用此處理過的陰、 陽性血清1 100稀釋后，與未加抗原處理的陰、陽性血清按已建立的間接ELISA方法檢測試劑盒進行測定，比較阻斷前后血清的0D630nm值變化。結(jié)果表明用重組外膜蛋白處理的陽性血清的OD值明顯小于未加抗原處理的陽性血清OD值，且差異顯著(P <0. 05),而用重組外膜蛋白處理的陰性血清OD值也明顯小于未加抗原的陰性血清的OD值，說明該蛋白能很好的阻斷血清中的抗體。3.間接ELISA方法檢測試劑盒的重復性試驗 (1)批內(nèi)重復
用同一批制備的抗原包被酶標板，取待檢血清4份，已知的陽性血清1份、陰性血清1 份，每份血清重復3孔。結(jié)果見表2，經(jīng)過SSPS統(tǒng)計分析軟件分析表明，批內(nèi)重復性試驗結(jié)果無顯著差異，說明該ELISA檢測方法的重復性良好。操作步驟同上。表1批內(nèi)重復結(jié)果
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(2)批間重復
用不同批次的抗原包被酶標板，取待檢血清4份，已知的陽性血清1份、陰性血清1份進行檢測，每份血清檢測3孔，重復檢測3次。比較0D630nm值和S/N,計算各樣品標準差和變異系數(shù)。結(jié)果見表3，經(jīng)過SSPS統(tǒng)計分析軟件分析表明，批間重復試驗變異系數(shù)小于 8. 8%，表明建立的間接ELISA方法具有很好的重復性，能快速、準確的檢測鴨疫里默氏桿菌的抗體水平。 表2批間重復結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有a) 抗體檢測板，b)酶結(jié)合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f)10X濃縮洗滌液，g)底物顯色液A，h)底物顯色液B和i)終止液，其中所述的抗體檢測板為包被鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶標板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體，陽性對照為鴨疫里默氏桿菌標準菌株免疫雛鴨制備高免血清，陰性對照為經(jīng)篩選獲得的未免疫鴨疫里默氏桿菌的雛鴨的陰性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于 所述的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的制備方法為利用PCR技術(shù)擴增鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的原核表達質(zhì)粒，命名為pETj8a-0mpA ；將質(zhì)粒pETj8a-0mpA轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為 BLpET-28a-0mpA,將BLpETj8a-0mpA在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導表達并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中，將重組外膜蛋白通過親和層析進行純化后復性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述的抗體檢測板的制備方法為將純化復性后的重組外膜蛋白用抗原包被液稀釋為 1. 5 μ g/mL的終濃度，向可拆96孔酶標板的每個聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C條件下包被池，用洗滌液洗滌5minX4次，甩干，每孔加封閉液100 μ L，37°C反應池，用PBST緩沖液洗滌5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存?zhèn)溆谩?br> 4.按權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述的抗原包被液為PBS緩沖液，所述的洗滌液為PBST緩沖液，所述的封閉液為1% (w/v)牛血清白蛋白的PBST緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于 所述的辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于 所述的樣品稀釋液為按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST緩沖液；IOX濃縮洗滌液為含0. 5% (ν/ν)吐溫-20的0. IM磷酸鹽緩沖液；底物顯色液A為0. 2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液，底物顯色液B為含0. 05%(ν/ν)過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2Μ 硫酸溶液。
7.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒的應用方法，其特征在于包括有以下步驟1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液按體積1 100稀釋，按100 μ 1/孔加入到抗體檢測板中， 設陰性對照、陽性對照，并設只加100 μ 1樣品稀釋液作為空白對照，37°C孵育20-45分鐘， 甩干；3)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μ 1的酶結(jié)合物工作液，空白對照不加，37°C孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加步驟1)的洗滌液200μ 1，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次每孔加入50μ 1底物顯色液A和50 μ 1底物顯色液B，37°C避光孵育5_15分鐘；7)每孔加50 μ 1終止液，用酶標儀在630nm波長下讀取每孔光吸收值。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨的一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒及其應用，包括有a)抗體檢測板，b)酶結(jié)合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f)10×濃縮洗滌液，g)底物顯色液A，h)底物顯色液B和i)終止液，本發(fā)明有益的積極效果是試劑盒操作簡單，所需儀器要求不高，人人都可操作，能較好滿足不同層次的需要，如疫病監(jiān)測、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景。
文檔編號G01N33/68GK102323428SQ20111023529
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者張蓉蓉, 楊依霏, 楊峻, 溫國元, 王紅琳, 羅玲, 羅青平, 艾地云, 邵華斌 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所