專利名稱：：一種乙醇脫氫酶及其基因和重組酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種乙醇脫氫酶及其基因，以及含有該基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及一種重組乙醇脫氫酶及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙醇脫氫酶(E.C丄l.l.l.)，國(guó)外稱為alcoholdehydrogenase或keto-reductase，即乙醇脫氫酶(醇脫氫酶，ADH)或酮基還原酶，國(guó)內(nèi)也叫乙醛乙醇脫氫酶。乙醇脫氫酶具有立體專一性地還原前手性羰基化合物的能力，是氧化還原酶類中很重要的一個(gè)類別。乙醇脫氫酶可用于高效合成具有光學(xué)活性的醇，后者往往是精細(xì)化工業(yè)生產(chǎn)用關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元。從實(shí)際應(yīng)用的角度看，利用NADH作為輔因子的乙醇脫氫酶尤其具有重要應(yīng)用價(jià)值，原因是在NADH再生方面已經(jīng)建立起了一種有效的甲酸鹽/甲酸脫氫酶系統(tǒng)；而相比之下對(duì)于NADPH依賴的乙醇脫氫酶，其現(xiàn)有的輔因子再生循環(huán)體系的有效性就低很多?，F(xiàn)已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)多種可用于有機(jī)合成的乙醇脫氫酶，其中使用最多的是可從商業(yè)途徑購(gòu)買得到的來(lái)自酵母、馬肝和7T2ermoa"aeraW"w6racM的三種乙醇脫氫酶。這三種酶的底物專一性和立體選擇性都有顯著區(qū)別，但它們都能夠還原廣泛的酮基化合物。這三種酶也均有著一些局限，例如長(zhǎng)期使用的穩(wěn)定性不足或者接受的底物有限，這些限制了它們?cè)诩夹g(shù)上的應(yīng)用。到目前為止，已報(bào)道的乙醇脫氫酶中能夠還原例如苯乙酮及其衍生物這類帶有龐大側(cè)鏈的酮類化合物不多。Hummd等在篩選新的生物催化劑時(shí)從高加索乳桿菌丄"co6fl"7/wfeyrDSM20587中分離到一種NADPH依賴的乙3醇脫氫酶，能夠?qū)⒈揭彝捌溲苌镛D(zhuǎn)化成(/)-醇(HummelW.Newalcoholdehydrogenasesforthesynthesisofchiralcompounds.AdvBiochemEngBiotechnol,.1997;58:145-84);除此之外，在紅串紅球菌//2c^ococc^e^^ra/ofc中發(fā)現(xiàn)一種新的NADH依賴的乙醇脫氫酶(RE-ADH)。與丄.^/r的NADPH依賴的乙醇脫氫酶相比，該乙醇脫氫酶能夠催化還原相似的酮為相應(yīng)的(5)-醇。Hummel等研究了該NADH依賴的醇脫氫酶的純化及生化性質(zhì)，并將其成功應(yīng)用于生物有機(jī)合成。綜上所述，尋找并克隆具有潛在應(yīng)用價(jià)值的乙醇脫氫酶基因，尤其是以NADH作為輔因子的乙醇脫氫酶無(wú)論是從擴(kuò)大基因資源還是實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的角度都具有重要意義。高加索乳桿菌丄acto^cz'〃"sDSM20587是目前報(bào)道的唯--株能通過(guò)自身所攜帶的S)-ADH和(R)-ADH偶聯(lián)的兩步還原反應(yīng)，高效、高對(duì)映選擇性地催化生成6-氯-(3凡55)-二羥基己酸叔丁酯的菌株(AmidjojoM，F(xiàn)ranco-LaraE,NowakA，LinkH,"^^euster-BotzD.Asymmetricsynthesisoftert-butyl(3R，5S)6-chloro-dihydroxyhexanoatewithLactobacilluskefir.ApplMicrobiolBiotechnol.，2005,69(l):9-15)，后者是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)抗膽固醇藥物HMG-CoA還原酶抑制劑的重要手性結(jié)構(gòu)單元。目前只有其(R)-ADH基因得到了克隆，尚無(wú)關(guān)于(S)-ADH基因和酶的相關(guān)研究報(bào)道(PfruenderH，AmidjojoM，HangF,Weuster-BotzD.ProductionofLactobacilluskefircellsforasymmetricsynthesisofa3，5-dihydroxycarboxylate.ApplMicrobiolBiotechnol.，2005，67(5):619-22.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的乙醇脫氫酶在生物有機(jī)合成手性化合物中均存在的底物及輔酶依賴類型的局限，提供一種新的優(yōu)良的乙醇脫氫酶及其基因，含有該基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體，以及該乙醇脫氫酶的重組酶及其制備方法和應(yīng)用，該新的乙醇脫氫酶能夠依賴NADH,催化還原帶有龐大側(cè)鏈的酮類化合物為相應(yīng)的醇。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQIDNo.l所示的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種乙醇脫氫酶，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。較佳的該乙醇脫氫酶為來(lái)源于丄"cto6ac/〃wDSM20587菌株的NADH依賴的乙醇脫氫酶。根據(jù)本發(fā)明，所述的乙醇脫氫酶基因是以能夠生物催化產(chǎn)生6-氯-(3及，55>二羥基己酸叔丁酯的高加索乳桿菌丄""06""'〃">5fe刀rDSM20587菌株總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的。具體可包括如下步驟(1)比對(duì)分析現(xiàn)有的己知的細(xì)菌乙醇脫氫酶氨基酸序列，找出2塊高度保守的氨基酸序列區(qū)(BlockS)，兩塊保守區(qū)域分別對(duì)應(yīng)乙醇脫氫酶高度保守的鋅離子結(jié)合域和輔因子結(jié)合域。把這兩個(gè)保守區(qū)域的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)并核苷酸序列，并計(jì)算簡(jiǎn)并度，根據(jù)該簡(jiǎn)并核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物。以丄flcto6acz7/ws&y^DSM20587菌株總DNA為模板，用該簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一段DNA序列。測(cè)定該P(yáng)CR產(chǎn)物的DNA序列。(2)在步驟(1)中測(cè)得的DNA序列的5，端和3'端各自設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異引物SPl,SP2，SP3和SP1'，SP2',SP3'，分別與13種簡(jiǎn)并引物(AP1-AP13)配對(duì)，以lflcto^"7/w^/^DSM20587菌株總DNA為模板，進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，得到步驟(1)中測(cè)得的DNA序列兩端的側(cè)翼序列。(3)將步驟(1)中測(cè)得的DNA序列與步驟(2)中測(cè)得的各TAIL-PCR擴(kuò)增而得的兩端側(cè)翼序列拼接，得到如序列表中SEQIDNo.l所示的帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG的基因全長(zhǎng)序列。根據(jù)本發(fā)明，所述的乙醇脫氫酶基因""/2全長(zhǎng)1044bp，其中A、C、G、T四種核苷酸數(shù)目及百分比分別為273(26.1%)、254(24.3%)、260(24.9%)、257(24.6%)。起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AG。該序列無(wú)內(nèi)含子，具有完整的開(kāi)放讀碼框，編碼347個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物，即本發(fā)明乙醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示，分子量為37.07kD，等電點(diǎn)pl為5.70。通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心序列相似性搜索程序(NCBIBlast)的蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析，表明與已登記的乙醇脫氫酶同源性最高為72%，其中與盧特氏乳酸桿菌wwfen'100-23禾DZacto^c,7/wjm^7'F275的乙醇脫氫酶氨基酸序列同源性最高，為72%。由此也證明了本發(fā)明的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)新的乙醇脫氫酶基因。當(dāng)然，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，本發(fā)明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的其它任何核苷酸序列。而本發(fā)明乙醇脫氫酶不僅限于序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；還可以是SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有相同的乙醇脫氫酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，這些氨基酸殘基的取代、缺失或添加的情況包括在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、不影響序列修飾形式上的差異等情況。相應(yīng)地，本發(fā)明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼這些本發(fā)明乙醇脫氫酶衍生物或類似物的核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種重組表達(dá)載體，包含上述的本發(fā)明的乙醇脫氫酶基因的核苷酸序列。該重組表達(dá)載體的載體骨架優(yōu)選原核表達(dá)載體，更優(yōu)選pET-28a(+)。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，包含上述的任何一種本發(fā)明的核苷酸序列或重組表達(dá)載體。該重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體優(yōu)選細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌￡.<^//81^21.DE3。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供一種重組乙醇脫氫酶的制備方法，培養(yǎng)上6述本發(fā)明的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲取重組的乙醇脫氫酶。本發(fā)明的大腸桿菌￡.co//BL21.DE3重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出約44kD的目的蛋白，證實(shí)了本發(fā)明的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供所述方法所制備而得的重組乙醇脫氫酶。本發(fā)明的技術(shù)方案之七是提供所述的乙醇脫氫酶或重組乙醇脫氫酶在生物有機(jī)合成中將羰基化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇的應(yīng)用。較佳的，該酶在生物有機(jī)合成中將醛類化合物或帶有較大的側(cè)鏈基團(tuán)的酮類化合物如苯乙酮及其衍生物如對(duì)氯苯乙酮轉(zhuǎn)化還原為相應(yīng)的(S)-醇。所述的醛類化合物較佳的選自正丙醛、正丁醛、異丁醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、苯甲醛、苯乙醛、水楊醛、鄰氯苯甲醛、檸檬醛和肉桂醛。所述的酮類化合物較佳的選自環(huán)戊酮、3-戊酮、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、苯乙酮和對(duì)氯苯乙酮。該酶在生物有機(jī)合成中還可以將酯類化合物轉(zhuǎn)化還原為相應(yīng)的(S)-醇。所述的酯類化合物較佳的是乙酰乙酸乙酯。本發(fā)明提供的乙醇脫氫酶基因還可用于研究的生物代謝途徑或構(gòu)建基因工程菌。所述的生物優(yōu)選為丄actoto"7/wA:g/rDSM20587菌株。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明從Lacto&"7/w^/^DSM20587基因組中分離出了新的乙醇脫氫酶基因，擴(kuò)大了乙醇脫氫酶基因的資源，同時(shí)為高加索乳桿菌Z^"ok^7/w&y^DSM20587的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的分離自丄actok^〃"s&/rDSM20587的醇脫氫酶(LK-ADH)能夠高對(duì)映選擇性地轉(zhuǎn)化苯乙酮為(5)-苯乙醇，對(duì)映體過(guò)量值達(dá)到99.4%，同時(shí)輔酶依賴類型為NADH型，表明該酶是一種NADH依賴的(5)-醇脫氫酶。因此本發(fā)明為生物有機(jī)合成生產(chǎn)中立體選擇性的將羰基化合物、特別是帶有龐大側(cè)鏈的酮基化合物轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的醇，如(5)-苯乙醇提供了優(yōu)良的醇脫氫酶。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。圖1為本發(fā)明擴(kuò)增乙醇脫氫酶基因部分片段的兩端側(cè)翼序列的TAIL-PCR反應(yīng)流程圖。圖2為本發(fā)明乙醇脫氫酶基因全長(zhǎng)序列的拼接及TAIL-PCR設(shè)計(jì)圖。圖3為本發(fā)明乙醇脫氫酶包涵體透析復(fù)性純化電泳分析圖，其中1、2泳道是包涵體洗滌液I和II的洗脫餾分，3泳道顯示的是包涵體溶解液蛋白組分，4泳道即是經(jīng)過(guò)透析復(fù)性的重組酶液，第5泳道顯示的是破壁后得到的上清液中的蛋白。圖4為本發(fā)明pET-28a(+)-W/2質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖5為L(zhǎng)K-ADH不對(duì)稱還原苯乙酮產(chǎn)物的GC分析。a:(S)-苯乙醇和(R)-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich);b:反應(yīng)液樣品.苯乙酮，(R)-苯乙醇and(S)國(guó)苯乙醇保留時(shí)間分別為5.623,7.634，and7.884min。圖6-1為pH對(duì)氧化反應(yīng)酶活力的影響。圖6-2為pH對(duì)還原反應(yīng)酶活力的影響。圖7-1為溫度對(duì)氧化反應(yīng)酶活力的影響。圖7-2為溫度對(duì)還原反應(yīng)酶活力的影響。圖8-1為苯乙酮濃度和反應(yīng)速度的雙倒數(shù)曲線。圖8-2為異丙醇濃度和反應(yīng)速度的雙倒數(shù)曲線。圖9-1為重組酶在-2(TC下的穩(wěn)定性。圖9-2為重組酶25t:下的穩(wěn)定性。圖9-3為重組酶的熱穩(wěn)定性。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例lPCR簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中收錄的細(xì)菌乙醇脫氫酶蛋白質(zhì)序列，具體菌種見(jiàn)表1，經(jīng)VectorNTIAdvance10軟件包的AlignX多序列比對(duì)程序分析，找出2塊高度保守的氨基酸序列區(qū)(BlockS)，這兩塊保守區(qū)域分別對(duì)應(yīng)乙醇脫氫酶高度保守的鋅離子結(jié)合域和輔因子結(jié)合域。把這兩個(gè)保守區(qū)域的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)并核苷酸序列，并計(jì)算簡(jiǎn)并度，根據(jù)該簡(jiǎn)并核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，該引物的序列參見(jiàn)表2及序列表中SEQIDNo.3和4。表1.設(shè)計(jì)乙醇脫氫酶基因簡(jiǎn)并引物所參考的乙醇脫氫酶蛋白的菌種蛋白酶種類菌禾中乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶爿7UC柳0乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶表2.擴(kuò)增乙醇脫氫酶的簡(jiǎn)并引物引物名稱引物序列簡(jiǎn)并度^Z/z—5'端引物5，畫(huà)GGHCAYGAAGSHDYHGGMAWBGT-3'7796^Z/—3'端引物5，國(guó)VCCRASSSCRCCRKYMCC國(guó)3'1536注Y二C或T;W二A或T;S=C或G;K=G或T;R=A或G;M=A或C;B=G或C或T;H-A或C或T;D=A或G或T;V=A或G或C。實(shí)施例2ZactoM"7/wfe/rDSM20587菌株基因組總DNA的提取1)培養(yǎng)￡acto6a"7/wsfe/rDSM20587細(xì)胞300ml(購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心，ATCCNumber:35411)。2)3,000g離心10min，重懸于5mlSET溶液。加入溶菌酶(終濃度lmg/ml)，37"C培養(yǎng)1小時(shí)。3)加入1/10體積10%(w/v)SDS及蛋白酶K(終濃度0.5mg/ml)，55""C培養(yǎng)2小時(shí)(間或顛倒混勻)。加入l/3體積5MNaCl，1倍體積氯仿，室溫培養(yǎng)0.5小時(shí)，經(jīng)常顛倒混勻。4)4，500g離心15min,將上層水相移入新管。5)加入1倍體積異丙醇，輕輕顛倒管子混勻，離心后DNA沉淀用70M乙醇洗漆，真空干燥，溶于TE溶液。實(shí)施例3乙醇脫氫酶基因部分片段的PCR擴(kuò)增以實(shí)施例2所得的丄"cto^c/〃wsyfe力rDSM20587菌株基因組總DNA為模板，用實(shí)施例l所設(shè)計(jì)的引物(由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增反應(yīng)使用購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司的DR001APCR試劑盒)反應(yīng)體系見(jiàn)表3，反應(yīng)程序如下表3.PCR反應(yīng)體系組成成分終濃度體積(W)10x反應(yīng)緩沖液(含Mg21lx2.05'-端引物(2pmol/L)1.0(xmol/L4.03，-端引物(2iimol/L)1.0|Limol/L4.0模板DNA(100ixg/ml)lOOng1.0dNTP混合液(各2.5mmol/L)0.2mmol/L1.6TaqDNA聚合酶(5U/(xl)1.5U0.5d線O/6.9總體積/20.0PCR反應(yīng)程序:Step195。C預(yù)變性3min，Step295。C變性30sec，Step360。C退火30sec，10Step472。C延伸30sec，Step5重復(fù)Step2至Step4,總共循環(huán)運(yùn)行30次，Step672。C延伸10min，Step74'C保持。實(shí)施例4PCR產(chǎn)物的測(cè)序回收實(shí)施例3所得的PCR產(chǎn)物，按下列步驟操作(1)取實(shí)施例3所得的PCR反應(yīng)液5|iil，加入liul6xloadingbuffer,使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。(2)將DNA電泳凝膠置于長(zhǎng)波紫外燈下，切出含擴(kuò)增出的DNA片段的凝膠，裝入一個(gè)預(yù)先稱重的塑料離心管(購(gòu)自Eppendorf公司)，稱出凝膠的重量。(3)加入三倍凝膠重量的6mol/LNal(0.1g凝膠加300pl)，于45°C水浴保溫至凝膠完全融化。(4)加入5(al玻璃奶，旋渦混和器混勻(該玻璃奶由如下步驟制備10g硅膠(SigmaS5631)懸浮于100mlPBS緩沖液中，靜置2h后傾去懸浮物，離心(BeckmanAvantiJ-25，轉(zhuǎn)子JA17，2000g，2min)棄去上清液，沉淀重新懸浮于3mol/LNal溶液中，將該溶液分裝后在4'C保存)。(5)置于冰浴中保持10min，并每隔l-2min振蕩一次離心管。(6)離心(臺(tái)式離心機(jī)，13,000r/min，30sec)沉淀玻璃奶，棄去上清液。(7)加入200jnl冷凍保存(-20。C)的NewWash洗脫緩沖液(NaCl50畫(huà)ol/L;EDTA(pH7.5)2.5mmol/L;Tris(pH7.5)10mmol/L;乙醇50%)，于旋渦混和器懸浮玻璃奶，離心(臺(tái)式離心機(jī)，13,000r/min，30sec)洗漆。此過(guò)程需重復(fù)三次，最后一次洗滌應(yīng)盡可能吸干殘余在管底的洗脫緩沖液。(8)加入5pl無(wú)菌蒸餾水，振蕩使玻璃奶懸浮，放置45。C水浴保溫10min，使吸附的DNA被解吸，離心(臺(tái)式離心機(jī)，13,000r/min，30sec)，將上清移入一個(gè)新離心管。此過(guò)程需重復(fù)三次，合并上清。(9)離心去除可能帶入的玻璃奶(臺(tái)式離心機(jī)，13,000r/min，30sec)，將上清移入一個(gè)新離心管，即為回收產(chǎn)物。回收產(chǎn)物與pMD19-T克隆載體連接，連接按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用的pMD19-T是一種常用的克隆載體，大小為2692bp，具有Amp抗性基因購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)4Um"DH5a感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR以鑒定陽(yáng)性重組子。其中￡^//011501感受態(tài)細(xì)胞的制備步驟如下(1)用甘油冷凍保存菌液￡"http://011501(購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司)接種2mlLB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%;NaCl0.5%;酵母抽提物1%;pH7.4)，于37"C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(2)以1%的接種量接種裝有20mlLB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶，于37。C振蕩培養(yǎng)2h左右，控制OD6oq在0.30.5。(3)將菌液移入50ml的無(wú)菌塑料離心管(購(gòu)自Beckman公司)，在冰浴中放置10min。(4)離心6,000r/min，4°C，10min，回收菌體。(5)傾去培養(yǎng)液，并將離心管倒置以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。(6)將菌體沉淀懸浮于10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，菌體經(jīng)洗滌后離心回收。(7)將菌體重新懸浮于10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，在冰浴中保持30min。(8)離心回收菌體細(xì)胞，傾去上層溶液并將離心管倒置以使最后殘留的溶液流盡。(9)將菌體懸浮于800|il用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，置于4°C或-7(TC冰箱保存，即為感受態(tài)細(xì)胞。12用CaCl2法轉(zhuǎn)化五co"DH5a感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下(1)將上述連接到pMD19-T克隆載體的DNA連接產(chǎn)物用冷卻的無(wú)菌吸頭加入含有上述制備的100pl感受態(tài)細(xì)胞、置于預(yù)先冰浴的塑料離心管(購(gòu)自Eppendorf公司)中，用手指輕叩離心管底部，小心混勻，在冰浴中保持30min。(2)將含有DNA連接產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞的離心管在42t:恒溫水浴中熱激90sec，其間不要搖動(dòng)離心管。(3)快速將離心管置于冰浴中保持2min。(4)加入800ialLB液體培養(yǎng)基，顛倒混勻，37°C，120r/min振蕩溫育lh使細(xì)胞繁殖。(5)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的瓊脂平板表面。(6)將平板置于室溫直至液體被吸收。(7)倒置平板，于37'C培養(yǎng)16h。陽(yáng)性重組子的篩選及鑒定(1)藍(lán)白斑反應(yīng)篩選陽(yáng)性重組子根據(jù)a-互補(bǔ)反應(yīng)的原理，在附加氨芐青霉素、x-gal和IPTG的瓊脂平板上產(chǎn)生的白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的菌落，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的菌落，因此白色菌落可初步鑒定為陽(yáng)性重組子。(2)陽(yáng)性重組子的菌落PCR鑒定挑取白斑菌落，利用通用引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)程序同上不變，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳顯示出與目的DNA大小一致的條帶，證明質(zhì)粒重組正確，是陽(yáng)性重組子。DNA序列測(cè)定與分析陽(yáng)性重組子由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，即得/^"O6"c///^^^/^DSM20587菌株的乙醇脫氫酶基因部分片段的DNA序列，即乙醇脫氫酶基因的兩塊保守區(qū)域之間的DNA序列，這兩塊保守區(qū)域分別對(duì)應(yīng)乙醇脫氫酶高度保守的鋅離子結(jié)合域和輔因子結(jié)合域。實(shí)施例5采用TAIL-PCR擴(kuò)增上述乙醇脫氫酶基因部分片段的兩端側(cè)翼序列根據(jù)TAIL-PCR原理，以實(shí)施例4最后測(cè)定的DNA序列為基礎(chǔ)，在其5，端和3'端各自設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異引物SP1、SP2、SP3和SP1'、SP2'、SP3'，分別與13種簡(jiǎn)并引物(AP1-AP13)配對(duì)，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到其兩端的側(cè)翼序列。具體引物序列見(jiàn)表4及序列表中SEQIDNo.523。表4.TAIL-PCR擴(kuò)增乙醇脫氫酶基因部分片段兩端的側(cè)翼序列所用引物引物名稱引物序列SP15，-TTCGGCTTGATAACCAGCACTAA國(guó)3'SP25，國(guó)AACCAGCACTAAAGTTGTCGCTATGA-3,SP35,國(guó)TGGTGCGATTACAAAGTCTCCCG-3'SP1，5，-CGTTACCAGCATGCCGAGTG-3'SP2'5，畫(huà)CATGCCGAGTGGTCACTGGTTAA-3'SP3'5，-ATGCTGCCCGTGTCGCCAAC曙3'API5，陽(yáng)NGTCGASWGANAWGAA-3，AP25，-TGWGNAGWANCASAGA-3'AP35，國(guó)AGWGNAGWANCAWAGG-3'AP45，-STTGNTASTNCTNTGC誦3'AP55，畫(huà)NTCGASTWTSGWGTT-3'AP65，-WGTGNAGWANCANAGA-3'AP75，畫(huà)CAWCGNCNGANASGAA畫(huà)3'AP85，-TCSTNCGNACNTWGGA-3，AP95,國(guó)WCAGNTGWTNGTNCTG-3'AP105，-TCTTNCGNACNTNGGA-3'AP115，-TTGNAGNACNANAGG-3，API25，-GTNCGASWCANAWGTT-3，AP13_5，-NTCAGSTWTSGWGWT-3，_注N-A或G或C或T;W二A或T;S二C或G。其中TAIL-PCR原理；本發(fā)明表4中所用的引物的設(shè)計(jì)原則及TAIL-PCR具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下①TAIL-PCR原理TAIL-PCR全稱為熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR)是一種用來(lái)分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。TAIL-PCR基本原理是利用目標(biāo)序列旁的己知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprime,簡(jiǎn)稱SP1，SP2，SP3,約20bp)，用它們分別和多個(gè)具有低rm值的短的(14bp左右)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerateprime簡(jiǎn)稱AP)相組合，以基因組DNA作為模板，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。通常情況下至少有一種簡(jiǎn)并引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)，通過(guò)三次巢式PCR反應(yīng)即可獲得已知序列的側(cè)翼序列。TAIL-PCR具體反應(yīng)流程如圖1所示。②本發(fā)明TAIL-PCR特異性引物及隨機(jī)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，SP2的位置在SP1的內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離一般以60-100bp為宜。引物設(shè)計(jì)原則引物的長(zhǎng)度為22—26nt，GC含量45-55%，rm值60-7(TC。隨機(jī)簡(jiǎn)并引物按照物種普遍存在的蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度為14bp左右，rm值為3048。C。為了增加簡(jiǎn)并引物與目標(biāo)序列間退火的可能性，除了3'端的3個(gè)堿基以外，其它位置的堿基包含簡(jiǎn)并核苷酸。③本發(fā)明TAIL-PCR具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下1)基因組DNA的獲取。^^o&"7/mfe刀rDSM20587菌株基因組總DNA的提取同實(shí)施例2。2)已知序列的確認(rèn)。在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)之前對(duì)實(shí)施例4測(cè)得的DNA序列進(jìn)行3次測(cè)序，以確保測(cè)序結(jié)果的可靠性。3)lstPCR反應(yīng)。基因組DNA經(jīng)OD測(cè)定準(zhǔn)確定量后，取適量作為模板，以AP引物(13種中的任意一種，以下以API引物為例)作為上游引物，SP1或SP1'弓|物為下游引物，進(jìn)行l(wèi)stPCR反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)使用購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司的DRR002APCR試劑盒。*按下列組份配制lstPCR反應(yīng)液。模板(基因組DNA)dNTP混合液(各2.5mM)10XLAPCR緩沖液II(含Mg2+)TaKaRaLATaqDNA聚合酶(5U/ixl)API引物(勵(lì)pmo,)SP1引物(lOpmol/^l)_dH20*lstPCR反應(yīng)條件如下94°Clmin98。Clmin94。C30sec—60~68°Clmin72°C2~4min"194。C30sec;25°C94。C30sec;6068。Clminj72°C2'-4min—94°C30secj6068°Clminj72°C2'15個(gè)循環(huán)94°C30sec;44°C72°C2--4min~110ng0.5(il加至50^1木循環(huán)3min;72°C2~4min1672°C10min4)2ndPCR反應(yīng)。將1stPCR反應(yīng)液稀釋50倍后，取作為2ndPCR反應(yīng)的模板，以AP1引物為上游引物，SP2或SP2'引物為下游引物，進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)。*按下列組份配制2ndPCR反應(yīng)液。模板(lstPCR反應(yīng)液)ljLlldNTP混合液(各2.5mM)8|ul10XLAPCR緩沖液II(含Mg2+)5^1TaKaRaLATaqDNA聚合酶(5U/inl)0.5^1API引物(100pmol/iul)1^1SP1引物(10pmol/fxl)dH2Q加至50|li1*2ndPCR反應(yīng)條件如下:94°C30sec;60~68°Clminj72°C2-~4min—94°C30sec;6068°Clminj72°C2'~4min15個(gè)循環(huán)94°C30secj44。C72°C2-■4min-72°C10min5)3rdPCR反應(yīng)。將2ndPCR反應(yīng)液稀釋50倍后，取lpl作為3rdPCR反應(yīng)的模板，以AP1引物為上游引物，SP3或SP3'引物為下游引物，進(jìn)行3rdPCR反應(yīng)。參按下列組份配制3rdPCR反應(yīng)液。模板(2ndPCR反應(yīng)液)dNTP混合液(各2.5mM)10XLAPCR緩沖液II(含Mg2+)5^1TaKaRaLATaqDNA聚合酶(5U/)il)0.5^1API引物(100pmol/jil)SP1引物(10pmol/pl)1^1_dH20_加至50^1*3rdPCR反應(yīng)條件如下94°C30sec;60~68°Clminj72°C2--4min一94°C30secj60~68°Clmin;72°C2--4min15個(gè)循環(huán)94°C30secj44°Clminj72°C2-■4min—72°ClOmin6)取1st，2nd，3rdPCR反應(yīng)液各5pl，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。7)切膠回收清晰的電泳條帶，以SP3和SP3'為引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。實(shí)施例6乙醇脫氫酶基因全長(zhǎng)序列的拼接、PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序在實(shí)施例4中測(cè)得的DNA序列和實(shí)施例5中測(cè)得的各TAIL-PCR擴(kuò)增而得的兩端側(cè)翼序列的基礎(chǔ)上，結(jié)合Blastn、PrimerPremier5.0軟件及VectorNTIORF分析，拼接出帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG的基因全長(zhǎng)序列(見(jiàn)圖2)。根據(jù)拼接而得的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)驗(yàn)證引物ADH-正向和ADH-反向(見(jiàn)表5及序列表中SEQIDNo.24和25)，以丄acto^c/〃wsDSM20587菌株基因組總DNA為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)乙醇脫氫酶基因。PCR反應(yīng)條件為95°C3min，95。C30sec，56°Clmin，72°Clmin30sec，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體進(jìn)行序列驗(yàn)證。通過(guò)測(cè)定該P(yáng)CR產(chǎn)物的序列，與拼接所得的序列進(jìn)行比對(duì)后表明兩者的核苷酸序列完全一致。表5.擴(kuò)增乙醇脫氫酶基因全長(zhǎng)序列所用弓1物引物名稱引物序列ADH-正向5，-ATGAAATCAACCATTTTTGTAAAACC-3'ADH-反向5，-CTATTTTTGAGCGACAACCAAC畫(huà)3'上述所得的基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.l所示?；蛉L(zhǎng)181044bp，其中A、C、G、T四種核苷酸數(shù)目及百分比分別為273(26.1%)、254(24.3%)、260(24.9%)、257(24.6%)。該序列無(wú)內(nèi)含子，具有完整的開(kāi)放讀碼框，編碼347個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示，分子量為37.07kD，等電點(diǎn)pl為5.70。將所得的基因的序列上傳到http://www.ncbi.nlm.gov網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較和打分。通過(guò)NCBIBlastn和Blastp核酸及蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里找不到完全相同的序列。在已登記的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，LK-ADH與所有序列的同源性均不超過(guò)78y。，其中與短乳桿菌Z^"WsATCC367編碼的鋅依賴醇脫氫酶(LB-ADH)同源性為78°%(GenBank登錄號(hào)YP—795041);與盧特氏乳酸桿菌丄a"o&"'〃w100-23編碼的含鋅醇脫氫酶(LR-ADH)的同源性為72%(GenBank登錄號(hào)ZP_01273263)。LK-ADH與上述同源性最高的兩種蛋白的序列，在保守域位置(鋅離子結(jié)合位點(diǎn)和輔因子的結(jié)合區(qū)域)呈現(xiàn)出高度的同源性，僅在一個(gè)殘基位置有差別。由此也證明了本發(fā)明的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)新的乙醇脫氫酶基因。實(shí)施例7表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建根據(jù)pET-28a(+)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)序列，在乙醇脫氫酶基因的起始密碼子ATG處引入BamHI酶切位點(diǎn)，在終止密碼子TAG處引入///"dill酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物(見(jiàn)表6及序列表中SEQIDNo.26和27)。以Zacto6ac說(shuō)wfe刀rDSM20587菌株基因組總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min，95。C變性30sec,58。C退火30sec，72。C延伸lmin10sec，總共循環(huán)運(yùn)行30次，最后72。C延伸10min。回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)5amHI和歷mini雙酶切，再經(jīng)過(guò)膠回收，與同樣用^^111和歷>^111雙酶切且膠回收的pET-28a(+)質(zhì)粒(購(gòu)于Novagen公司)于16。C連接16h，制得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-"W，質(zhì)粒構(gòu)建圖見(jiàn)圖4。將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡co//DH5a感受態(tài)細(xì)胞。連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化Eco/z'DH5a感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含50pg/mL的卡那霉素抗性平板上。提取抗性平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒(具體步驟見(jiàn)下文)，用A3mHI與/f/"din進(jìn)行酶切驗(yàn)證。表6.乙醇脫氫酶基因表達(dá)用引物引物名稱引物序列pET-28a-adh-正向5，-GCGGGATCCATGAAATCAACCATTTTTGT誦3'pET-28a-adh-反向5，-GCGAAGCTTCTATTTTTGAGCGACAACC畫(huà)3'下劃線處為酶切位點(diǎn)^^m(正向)和歷'"dni(反向)。重組轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的提取步驟1)從生長(zhǎng)過(guò)夜的轉(zhuǎn)化平板上挑單菌落接種含5mlLB和5(Vg/ml的卡那霉素的試管，37"C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2)吸取lml菌液于eppendorf離心管，離心(Eppendorf5415R型，13000r/min，lmin，下同)，棄上清液，真空吸干殘余液體；3)將沉淀重新懸浮于SolutionI溶液，于旋渦混和器上振蕩使菌體分散，置于冰??；4)加入200pl新鮮配制的SolutionII溶液，蓋緊蓋子后，顛倒管子數(shù)次使SolutionII溶液與菌體充分接觸，以便細(xì)胞裂解，冰浴3—5min;5)加入150iil預(yù)先冰浴的SolutionIII溶液，劇烈振動(dòng)管子使之充分混和，置于冰浴35min;6)離心10min，將上清液移至另一離心管，加入2倍體積乙醇，-20°C放置30min;7)離心10min，棄上清液。沉淀用70°/。乙醇洗滌一次，于真空干燥器中干燥，加入25^1TE緩沖液溶解沉淀得到重組轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。SolutionI溶液(mmol/L):葡萄糖50,EDTA10,Tris-Cl25，pH8.0。SolutionII溶液NaOH0.2mol/L，SDS1(w/v)%。SolutionIII溶液5mol/L醋酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，TE緩沖液(mmol/L):Tris誦HCl10，EDTA1，pH8.0。經(jīng)驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒再采用CaCl2法轉(zhuǎn)化Eco//BL21.DE3(美國(guó)Novagen公司)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得陽(yáng)性克隆并進(jìn)行酶切分析鑒定，證明含有正確的插入片段，得到用于基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化菌株E②//BL21(DE3)/pET-28a(+)—"W(上述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及CaCb法轉(zhuǎn)化的具體的步驟參見(jiàn)實(shí)施例4)。實(shí)施例8重組乙醇脫氫酶的表達(dá)(重組乙醇脫氫酶粗酶液的提取)(1)接種實(shí)施例7制得的基因工程菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)—于含有卡那霉素(50pg/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)液以1%的接種量轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)至OD^為0.6后，加入IPTG至終濃度為lmM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h。(2)吸取lml誘導(dǎo)后的菌液于eppendorf離心管4°C，13，200rpm離心10min棄上清液；(3)加入0.5mlpH6.0磷酸鈉緩沖液(含MgCl2lmM)重懸，重復(fù)步驟(2)對(duì)菌體洗滌一次后再次加入0.5mlpH6.0磷酸鈉緩沖液(含MgCl2lmM)重懸；(4)置于冰浴中超聲波破壁3min(250W，工作5s，間歇5s)。細(xì)胞破碎液4°C，13,200rpm離心20min。(5)超聲波破壁后得到的沉淀加入lml包涵體洗滌液I，反復(fù)吹吸后于16,100g4。C離心20min(Eppendorf5415R小型冷凍高速離心機(jī))，去上清后加入lml包涵體洗滌液II同法進(jìn)行第二次洗滌。(6)洗滌后的包涵體沉淀加入5ml包涵體溶解液，室溫放置約2h并不時(shí)攪動(dòng)幫助溶解直至全溶。4°C16，100g離心20min，吸出上清得到較純的包涵體蛋白液。(7)包涵體蛋白液裝入處理過(guò)的透析袋于4'C進(jìn)行逐級(jí)透析，透析液分別含尿素4M，2M，1M和0M。各級(jí)透析分別持續(xù)816h。最后一輪為不含尿素的透析，透析液根據(jù)需要選擇不同pH值的緩沖液。包涵體洗滌液洗滌液I:TrispH8.0TritonX-100洗滌液II:TrispH8.0包涵體溶解液磷酸鉀緩沖液pH6.0MgCl250mmol/L0.5%50mmol/Llmol/L0,lmol/Llmmol/LEDTAEDTAlmmol/L2mol/L0.5mmol/L8mol/L通過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)只需經(jīng)過(guò)透析復(fù)性，目的蛋白就已經(jīng)達(dá)到足夠的純度。將分離純化各步驟的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4-4所示。第5泳道顯示的是破壁得到的上清蛋白，1、2泳道是包涵體洗滌液I和II的洗脫餾分，3泳道顯示的是包涵體溶解液蛋白組分，4泳道即是經(jīng)過(guò)透析復(fù)性的重組酶液。純化后的重組蛋白在SDS-PAGE電泳膠上呈一條帶，灰度掃描顯示純度在95%以上，用Bradford法測(cè)得濃度0.84mg/ml。本發(fā)明以下的實(shí)施例中所用的酶液都是該酶液。實(shí)施例9輔酶依賴類型的測(cè)定方法以苯乙酮為底物，分光光度計(jì)340nm(s340=6.22mmol/L-lcm-l)下檢測(cè)醇脫氫酶催化還原反應(yīng)活性?；钚詸z測(cè)條件為30°C，反應(yīng)體系總體積lml，含有10mmol/L苯乙酮；100mmol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液；0.25mmol/LNADH(或NADPH);以及0.2ml的酶液。加入酶液后反應(yīng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)定340nm吸光值在lmin內(nèi)的變化。酶活力定義在3(TC下，每分鐘催化轉(zhuǎn)化1pmol的NADH(或NADPH)的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。酶活的計(jì)算公式為酶活(U)-EWxV/6.22(EW為lmin內(nèi)340nm吸光度的變化；V為反應(yīng)液的體積，ml;6.22，摩爾消光系數(shù))結(jié)果為了確定醇脫氫酶LK-ADH的輔酶依賴類型，分別以NADH和NADPH為輔酶按照上述方法分別測(cè)得LK-ADH對(duì)于苯乙酮的活性為7.23xl(T2U/ml酶液和0.90xl(T2U/ml酶液，前者是后者的8倍。該結(jié)果表明克隆到的高加索乳桿菌L.kefirDSM20587的LK-ADH是一種NADH依賴型醇脫氫酶。本發(fā)明以下的實(shí)施例中測(cè)定酶活采用的都是實(shí)施例9中的方法。實(shí)施例IO對(duì)映選擇性的測(cè)定方法以苯乙酮為底物測(cè)定醇脫氫酶LK-ADH在不對(duì)稱還原反應(yīng)中的對(duì)映選擇性。反應(yīng)體系總體積lml，含有0.20mmol/LNADH;7.7|til異丙醇(0.1mol/L);1.2^1苯乙酮(10mmol/L);176^1100mmol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液(含lmmol/LMgCl2);800|il純化的醇脫氫酶LK-ADH(5.6U/ml)?；靹蚝笥?0°C振蕩反應(yīng)4h，4，000rpm離心20min,取上清液用1倍體積氯仿抽提。得到的氯仿層萃取液用于氣相色譜分析，根據(jù)峰面積計(jì)算產(chǎn)物光學(xué)純度(對(duì)映體過(guò)量值，e.e值)，并由此確定醇脫氫酶LK-ADH的對(duì)映選擇性。氣相色譜分析方法氣相色譜儀Agilent6890色譜工作站手性色譜柱CP-Chirasil-DEXCBcolumn(25m;diameter:25|xm)柱溫程序5minat60°C，5°C/minto195°C載氣流速1.3ml/min載氣氦氣進(jìn)樣量檢測(cè)器FID按照上述方法，醇脫氫酶LK-ADH氣相色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5。反應(yīng)4h后，苯乙酮(保留時(shí)間5.623min)峰面積=23.88;(R)-苯乙醇(Sigma-Aldrich)(保留時(shí)間7.634min)峰面積=1.42;(S)-苯乙醇(Sigma-Aldrich)(保留時(shí)間7.884min):峰面積=462.28。重組醇脫氫酶LK-ADH在不對(duì)稱還原苯乙酮的反應(yīng)中光學(xué)對(duì)映選擇性為S-構(gòu)型。其中對(duì)映體過(guò)量值(e.e值)=(462.28-1.42)/(462.28+1.42)X100%=99.4%。實(shí)施例ll底物特異性試驗(yàn)方法按照下述方法，分別測(cè)試純化后的醇脫氫酶LK-ADH與一系列醇類化合物的氧化反應(yīng)活性以及與一系列酮、醛類化合物的還原反應(yīng)活性。氧化反應(yīng)以對(duì)異丙醇的酶活為100%計(jì)算相對(duì)活性；還原反應(yīng)以對(duì)苯乙酮的酶活為100%計(jì)算相對(duì)活性。所有底物終濃度均為10mmol/L。1.氧化反應(yīng)以異丙醇為底物，分光光度計(jì)340nm(s340-6.22mmol/L-lcm-l)下檢測(cè)醇脫氫酶氧化反應(yīng)活性?；钚詸z測(cè)條件為30°C，反應(yīng)體系總體積lml，含有10mmol/L異丙醇；100mmol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液；0.25mmol/LNAD+;以及0.2ml的酶液。加入酶液后反應(yīng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)定340nm吸光值在lmin內(nèi)的變化2.還原反應(yīng)以苯乙酮為底物，分光光度計(jì)340nm(s340-6.22mmol/L-lcm-l)下檢測(cè)醇脫氫酶還原反應(yīng)活性?；钚詸z測(cè)條件為30°C，反應(yīng)體系總體積lml，含有10mmol/L苯乙酮；100mmol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液；0.25mmol/LNADH;以及0.2ml的酶液。加入酶液后反應(yīng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)定340nm吸光值在lmin內(nèi)的變化結(jié)果按照上述方法，以一系列醇類化合物以及酮、醛類化合物分別測(cè)定了醇脫氫酶LK-ADH在氧化反應(yīng)及還原反應(yīng)中的底物特異性，結(jié)果見(jiàn)表7。_表7.醇脫氫酶LK-ADH的底物特異性_還原反應(yīng)底物相對(duì)活性(％)氧化反應(yīng)底物相對(duì)活性(％)苯乙酮100異丙醇100甲醛0乙醇0乙醛0正丙醇0正丙醆20甲醇0正丁醛10正丁醇0異丁醛16異丁醇75正戊醛733叔丁醇54正己醛829正戊醇16正庚醛755異戊醇130苯甲醛421正己醇44苯乙醛334正庚醇56水楊醛120聚乙二醇2000鄰氯苯甲醛3301，2-丙二醇0檸檬醛1801.4-丁二醇0肉桂醛928丙三醇0乙酰乙酸乙酯309苯甲醇0丙酮0P-苯乙醇19乙酰丙酮0環(huán)戊醇13丁酮0環(huán)己醇03-戊酮17對(duì)氯苯乙酮440環(huán)戊酮12環(huán)己酮-夢(mèng)圣基-4-甲基-2-戊酮0120通過(guò)底物特異性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶LK-ADH普遍對(duì)所測(cè)酸類化合物表現(xiàn)出相對(duì)較高的活性，另外帶有較大的側(cè)鏈基團(tuán)的酮類化合物如苯乙酮及其衍生物如對(duì)氯苯乙酮也能夠被該酶有效的轉(zhuǎn)化還原為相應(yīng)的醇。實(shí)施例12酶的最適反應(yīng)pH值方法(1)將酶液配制成不同的pH體系，分別為3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6和8.0。其中pH值為3.6到5.6的酶液用100mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，pH值為6.0到8.0的酶液用100mmol/L的磷酸鉀緩沖液配制。(2)分別測(cè)定氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)中純化的重組酶于不同pH條件下對(duì)應(yīng)的剩余酶活力。(3)以最高酶活為100%，計(jì)算并繪制酶在不同pH值下的活力變化曲線，研究酶促反應(yīng)的最適pH。結(jié)果按照上述方法進(jìn)行氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)時(shí)酶的最適反應(yīng)pH值的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6-l和6-2所示。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出氧化反應(yīng)時(shí)該酶的最適反應(yīng)pH值在5.6左右，當(dāng)反應(yīng)pH降低到4.0以下或調(diào)節(jié)到6.6以上，酶活力迅速下降。還原反應(yīng)時(shí)酶的最適反應(yīng)pH值為5.0左右，同樣當(dāng)反應(yīng)pH降低到4.0以下或調(diào)節(jié)到中性7.0以上，酶活力迅速下降。實(shí)施例13酶的最適反應(yīng)溫度方法(1)使用4。C冰浴及不同的水浴溫度20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C、60。C、70°C。(2)將酶液在100mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中置于上述不同溫度保溫10min，取樣測(cè)定還原反應(yīng)中其對(duì)應(yīng)的剩余酶活力。(3)將酶液在100mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.6)中置于上述不同溫度保溫10min，取樣測(cè)定氧化反應(yīng)中其對(duì)應(yīng)的剩余酶活力。(4)以最高酶活值為100%，計(jì)算并繪制酶在不同溫度下的活力變化曲線，考察酶的最適反應(yīng)溫度。結(jié)果按照上述方法進(jìn)行酶的最適反應(yīng)溫度的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7-l、7-2所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)時(shí)該酶均在35T:左右表現(xiàn)的活力最高。在3(TC50'C范圍內(nèi)，LK-ADH的活性無(wú)論是在氧化反應(yīng)還是還原反應(yīng)中都較穩(wěn)定，溫度超過(guò)5(TC酶活性顯著降低。實(shí)施例14不同類型添加劑對(duì)酶活力的影響方法分別測(cè)定了幾種常用金屬離子、金屬離子螯合劑、表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑、巰基還原劑對(duì)酶活性的影響。測(cè)試條件按照實(shí)施例9的方法，在pH5.0的100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液反應(yīng)體系中加入終濃度為1Ommol/L的添加劑與酶液在35"C保溫10min后加入底物苯乙酮，考察不同添加物質(zhì)對(duì)酶活力的影響。以不含添加物的反應(yīng)體系為100%酶活對(duì)照計(jì)算相對(duì)活性。所測(cè)試物質(zhì)為(1)金屬離子對(duì)酶活的影響K+、Na+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Mn2+(1mmol/L)、Fe3+、Zn2+，Cu2+(10|imol/L)。(2)其他添加劑對(duì)酶活力的影響尿素、吐溫-80(Tween-80)、二甲亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)、P-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基磺酸鈉(SDS)。結(jié)果按照上述方法測(cè)定了幾種金屬離子、金屬離子螯合劑、表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑、巰基還原劑對(duì)酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。表8.不同類型添加劑對(duì)酶活力的影響添加物質(zhì)(10mmol/L)相對(duì)活性大小(％)添加物質(zhì)GOmmol/L)相對(duì)活性大4(%)KC1100(10|Limol/L)CuCl228NaCl100尿素97MgCl2127Tween-80100NiCl2脂DMSO85CaCl2111EDTA72(1mmol/L)MnCl252卩-巰基乙醇35<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>實(shí)施例15動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km的測(cè)定方法在pH5.0的100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液體系中，將酶液與不同濃度的底物苯乙酮(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L)作用，測(cè)定酶還原反應(yīng)的初速度；在pH5.6的100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液體系中，將酶液與不同濃度的底物異丙醇(0.2、0.5、1、2、5、lOmmol/L)作用，測(cè)定酶氧化反應(yīng)的初速度，分別用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖。得方程式Y(jié)=BX+C其中B^Km/V,;C=l/Vmax以此求出以苯乙酮為底物的還原反應(yīng)Km值和以異丙醇為底物的氧化反應(yīng)Km值。結(jié)果(1)還原反應(yīng)Km以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L苯乙酮作為底物，測(cè)定底物反應(yīng)速率(表9-l)，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法以最大反應(yīng)速率的倒數(shù)和底物濃度的倒數(shù)作圖(見(jiàn)圖8-l)，得方程式y(tǒng)=80.49x+1.4537;計(jì)算得到還原反應(yīng)Km=55.37mmol/L。表9-1.測(cè)定還原反應(yīng)Km值的最大反應(yīng)速度<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>(2)氧化反應(yīng)Km以0.2、0.5、1、2、5、10mmol/L異丙醇作為底物，測(cè)定底物反應(yīng)速率(表9-2)，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法以最大反應(yīng)速率的倒數(shù)和底物濃度的倒數(shù)作圖(見(jiàn)圖8-2)，得方程式y(tǒng)=103.18x+1.1646;計(jì)算得到氧化反應(yīng)Km=88.60mmol/L表9-2.測(cè)定氧化反應(yīng)Km值的最大反應(yīng)速度底物濃度(mmol/L)0.20.512510Vmax(xlO-3U/mg.min)1.9235.3197.35325.64150.01283.333實(shí)施例16酶的穩(wěn)定性方法(1)-20°<:冷凍保藏酶活力的變化將酶液置于-2(TC冰箱冷凍保藏，每周取樣一次，于35°C，100mmol/LpH5.0檸檬酸-擰檬酸鈉緩沖液體系中測(cè)定酶活力。以酶活最高者為100%，考察酶在-20°0下的穩(wěn)定性。(2)25'C常溫保溫對(duì)酶活力的影響將酶液置于25"C水浴中保溫，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)量酶活力。以酶活最高者為100%，考察酶在25"C時(shí)的穩(wěn)定性。(3)酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性將酶液在100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中分別在25'C、30°C、35°C、40°C、50°C、6(TC保溫lh，取樣測(cè)量酶的剩余活力。以酶活最高者為100%，考察酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果(1)-20°0冷凍保藏酶活力的變化按照上述方法-20"C冷凍保藏下酶活隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖9-1所示。在冷凍的情況下該酶在保藏2周時(shí)間內(nèi)活性能保持90%以上，保藏4周后剩余約70%活力，保藏5周后仍剩余50%活力，說(shuō)明該酶可以在冷凍情況下短期存儲(chǔ)。(2)25'C常溫保溫對(duì)酶活力的影響按照上述方法進(jìn)行25。C保溫對(duì)酶活力影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9-2所示。29該酶在25-C保溫的前4h內(nèi)活性下降較少，4h時(shí)剩余96%的活力；在24h后，酶活力仍有90%剩余，保溫2d后，酶的剩余活力減少為原來(lái)的約50%，之后酶活繼續(xù)下降。(3)酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性對(duì)重組醇脫氫酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖9-3所示。酶在20、25、30、35"保溫lh后活力均沒(méi)有明顯的降低，35*€保溫lh后剩余活力為原來(lái)的95%，溫度達(dá)到45'C后保溫lh酶活驟降為原來(lái)的11%，表明354(TC是該酶耐受溫度的極限范圍。序歹!J表<110〉上海醫(yī)藥工業(yè)研究院<120>—種乙醇脫氫酶及其基因和重組酶<130>P4-091325C〈150〉CN200810038752.1〈151〉2008-06-10<160〉27<170>Patentlnversion3.4<210>1〈211〉1044〈212〉腿<213>高加索乳桿菌(Lactobacilluskefir)<220>〈221>CDS〈222>(l)..(1041)<400>1atgaaateaaccatttttgtaaaacctggcaaagttgaaattcaa肪c48MetLysSerThrliePheValLysProGlyLysValGlulieGinAsn151015attgacaagccaaccattcaagetgatgatgacgcaattttacacatt96lieAspLysProThrlieGinAlaAspAspAspAlalieLeuHislie202530gttcgagettgtgtctgtggateagacttatgggettatcgtgattta144ValArgAlaCysValCysGlySerAspUuT卬AlaTyrArgAspLeu354045gaagataaggagccgaattctgagaataccggccacgaagcaategca192GluAspLysGluProAsnSerGluAsnThrGlyHisGluAlalieAla505560attgtcgaccaagtcggtaaaaatattacaactgtcaagccgggagac240lieValAspGinValGlyLysAsnlieThrThrValLysProGlyAsp65707580tUgtaategcaccatttacecacggctgcggtcattgtgetgcctgc288PheVallieAlaProPheThrHisGlyCysGlyHisCysAlaAlaCys859095cgtgccggttacgaaggaagetgtcagagtcatagegacaactttagt336ArgAlaGlyTyrGluGlySerCysGinSerHisSerAspAsnPheSer100105110getggttatcaagccgaatacgttcgttaccagcatgccgagtggtea384AlaGlyTyrGinAlaGluTyrValArgTyrGinHisAlaGluTrpSer115120125ctggtt肌gattccaggcaaacctgaagactatagtgacggcatgtta432LeuValLyslieProGlyLysProGluAspTyrSerAspGlyMetLeu130135140aattcgttactgactetcgcagacgtcatggcaaccggctatcatget480AsnSerLeuLeuThrLeuAlaAspValMetAlaThrGlyTyrHisAla145150155160gcccgtgtcgccaacgttaagcccggtgatacagtcgtcgttgtcggt528AlaArgValAlaAsnValLysProGlyAspThrValValValValGly165170175gacggtgetgtcggcctttgcggtgtaategccteacagatgcgtggc576AspGlyAlaValGlyLeuCysGlyVallieAlaSerGinMetArgGly180185190gcaagecgaateattgcaatgagecgccatgaggaccgtcaaaagctg624AlaSerArglielieAlaMetSerArgHisGluAspArgGinLysLeu195200205gcaaccgaatttggggcaaccgatattgtccctgaacgtggtgacgaa672AlaThrGluPheGlyAlaThrAsplieValProGluArgGlyAspGlu210215220gccgtcgetaaggttatggetttaaccaacggcgccggcgccgatget720AlaValAlaLysValMetAlaLeuThrAsnGlyAlaGlyAlaAspAla225230235240gttcttgagtgtgttggctctgaattateaaccgataccgcaatgaaa768ValLeuGluCysValGlySerGluLeuSerThrAspThrAlaMetLys245250255gttgcccgtccaggtgcaaccgtcggccgagttggcctgcctcataca816ValAlaArgProGlyAlaThrValGlyArgValGlyLeuProHisThr260265270aaaaagaccgatttaacgaacteattttacagtaacctggcaattgcc864LysLysThrAspLeuThrAsnSerPheTyrSerAsnLeuAlalieAla275280285ggtggtcccgettctgtaaccacctatgacaaateagttctgetaaag912GlyGlyProAlaSerValThrThrTyrAspLysSerValLeuUuLys290295300gcggtcttggatggcgatattcacccaggcaaggtcUtaccaagcgc960AlaValLeuAspGlyAsplieHisProGlyLysValPheThrLysArg32305tttacgetcPheThrLeugaagcaateGluAlalie310315gatgaaattgatgatgcctaccaggccAspGlulieAspAspAlaTyrGinAla325330aaategttggttgtcgetcaaaaatagLysSerLeuValValAlaGinLys340345atgMetgccAlaLys335320cgtArg10081044〈210〉2<211>347〈212〉PRT<213〉高加索乳桿菌(Lactobacilluskefir)〈400>2MetLysSerThrliePheValLysProGlyLysValGlulieGinAsn151015lieAspLysProThrlieGinAlaAspAspAspAlalieLeuHislie202530ValArgAlaCysValCysGlySerAspLeuTrpAlaTyrArgAspLeu354045GluAspLysGluProAsnSerGluAsnThrGlyHisGluAlalieAla505560lieValAspGinValGlyLysAsnlieThrThrValLysProGlyAsp65707580PheVallieAlaProPheThrHisGlyCysGlyHisCysAlaAlaCys859095ArgAlaGlyTyrGluGlySerCysGinSerHisSerAspAsnPheSer100105110AlaGlyTyrGinAlaGluTyrValArgTyrGinHisAlaGluTrpSer115120125LeuValLyslieProGlyLysProGluAspTyrSerAspGlyMetLeu130135140AsnSerLeuThrLeuAlaAspValMetAlaThrGlyTyrHisAla145150155160AlaArgValAlaAsnValLysProGlyAspThrValValValValGly165170175AspGlyAlaValGlyLeuCysGlyVallieAlaSerGinMetArgGly180185190AlaSerArglielieAlaMetSerArgHisGluAspArgGinLysLeu195200205AlaThrGluPheGlyAlaThrAsplieValProGluArgGlyAspGlu210215220AlaValAlaLysVal225ValLeuGluCysVal245ValAlaArgProGly260LysLysThrAspLeu275GlyGlyProAlaSer290AlaValLeuAspGly305PheThrLeuAspGlu325GluAlalieLysSer340<210>3〈211〉23〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>a必一5，端引物<220>〈221〉misc—feature<222>(3,6，11，12,13,14，15,18，20,21)〈223>h二a或c或t;y:c或t;s:c或g;m:a或c;w:a或t;b=g或c或〈400>3gghcaygaagshdyhggmawbgt<210>4〈211〉18<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223>a必一3，端引物MetAla230GlySerAlaThrThrAsnValThr295Asplie310lieAspLeuValLeuThrGluLeuValGly265SerPhe280ThrTyrHisProAspAlaValAla345AsnGly235SerThr250ArgValTyrSerAspLysGlyLys315TyrGin330GinLysAlaGlyAspThrGlyLeuAsnLeu285SerVal300ValPheAlaAlaPro270AlaLeuThrAlaMetAlaAspAla240MetLys255HisThrlieAlaLeuLysLysArg320LysArg33534〈220〉<221〉misc_feature〈222〉(1,4，6，7，8,10，13，14,15,16)<223〉v二a或g或c;r-a或g;s=c或g;k:g或t;y=c或t;m:a或c〈400>4vccrassscrccrkymcc18〈210〉5〈211>23〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<223〉引物SP1〈400〉5ttcggcttgataaccagcactaa23<210>6<211>26<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物SP2<400>633CC3gC3Ct3犯gttgtCgCt3tg326〈210>7<211〉23〈212〉腿〈213>人工序列〈220〉<223>引物SP3<400>7tggtgcgattacaaagtctcccg23〈210>8〈211〉20〈212〉腿<213>人工序列<220><223>引物SP1'<400>8Cgtt3CC3gC3tgCCg3gtg〈210>9<211〉23〈212>腿〈213〉人工序列<220〉〈223>引物SP2，〈400〉9catgccgagtggtcactggttaa〈210>10〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>引物SP3，<400>10atgctgcccgtgtcgccaac<210〉11〈211〉16<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物AP1〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(1,7,8,11,13)〈223〉n二a或g或c或t;s=c或g;w:a或t<400〉11ngtcgaswganawgaa16〈210〉12<211>16〈212〉畫(huà)〈213〉人工序列〈220><223>引物AP2<220〉<221〉misc—feature<222>(3,5，8，10,13)<223>w-a或t;n二a或g或c或t;si或g〈400〉12tgwgnagwancasaga16<210>13〈211〉16<212〉腿<213〉人工序列<220><223>引物AP3<220〉<221>misc一feature〈222〉(3,5,8,10,13)<223>w-a或t;『a或g或c或t<400>13agwgnagwancawagg16<210〉〈211>〈212>〈213>1416DNA人工序列<220>〈223〉引物AP4〈220><221〉〈222><223>misc—feature(1,5，8,10，13)s:c或g;n二a或g或c或t<400〉14sttgntastnctntgc16〈210〉〈211〉<212>〈213>1515DNA人工序列〈220>〈223〉引物AP5<220><221><222〉〈223>misc—feature(1,6,8,10'12)n二a或g或c或t;s二c或g;\￥=8或〈400>15ntcgastwtsgwgtt15<210>16〈211>16<212>■<213〉人工序列<220〉<223〉引物AP6〈220〉〈221〉misc—feature〈222>(1,5,8,10,13)〈223〉w:a或t;n二a或g或c或t<400〉16wgtgnagwancanaga16<210〉17<211>16〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223>引物AP7〈220><221〉misc—feature〈222>(3，6，8,11，13)<223〉w:a或t;n二a或g或c或t;s:c或g<400>17cawcgncnganasgaa〈210〉18<211>16<212〉腿〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物AP8<220>〈221〉misc一feature〈222〉(3,5,8,11,13)〈223〉『a或g或c或t;w-a或t;s-c或g<400>18tcstncgnacntwgga3<210〉19<211>16〈212〉腿〈213〉人工序列<220〉<223〉引物AP9<220〉<221>misc—feature<222>(1，5，8,10,13)〈223〉Fa或t;n二a或g或c或t<■>19wcagntgwtngtnctg16<210>20<211>16〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物APIO〈220〉<221>misc—feature<222〉(5,8,11,13)〈223〉n=a或g或c或t〈400>20tcttncgnacntngga<210〉21<211〉15<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>引物APll<220〉<221〉misc—feature〈222〉(4，7,10，12)〈223〉n=a或g或c或t〈400〉21ttgnagnacnanagg15<210>22<211〉16〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉引物AP12<220>〈221〉misc—feature〈222〉(3，7，8，10，13)<223〉n二a或g或c或t;s:c或g;w-a或t〈400〉22gtncgsswcein柳gtt16<210〉23〈211〉15<212>腿<213>人工序列<220>〈223〉引物AP13<220〉<221>misc一feature〈222>(1,6，8,10,12,14)<223〉rFa或g或c或t;s:c或g;w=a或t<400〉23ntcagstwtsgwgwt41〈210〉24<211〉26〈212〉匪〈213〉人工序列〈220>〈223〉A(chǔ)DH-正向引物〈400〉24atgaaatc83ccstttttgt3犯3cc〈210〉25〈211〉22〈212〉腿〈213〉人工序列〈220><223>ADH-反向引物〈400〉25ctatttttgagcgac肪ccaac〈210>26<211〉29<212>腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉pET-28a-adh-正向引物2622<400>26gcgggatccatgaaatcaaccatttttgt29〈210〉27〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>pET-28a-adh-反向引物<400>27gcgaagcttctatttttgagcgacaeicc28權(quán)利要求1、一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQIDNo.1所示的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。2、一種乙醇脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙醇脫氫酶，其特征在于，其為來(lái)源于高加索乳桿菌Z^cto^z"7/ws^/^DSM20587菌株的NADH依賴的乙醇脫氫酶。4、一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的乙醇脫氫酶基因的核苷酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，載體骨架為原核表達(dá)載體。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，載體骨架為pET國(guó)28a(+)。7、一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的任何一種核苷酸序列或權(quán)利要求46任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其為細(xì)菌。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其為大腸桿菌五.co"BL21.DE3。10、一種重組乙醇脫氫酶的制備方法，其特征在于，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7~9任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的乙醇脫氫酶。11、一種由權(quán)利要求IO的制備方法所制得的重組乙醇脫氫酶。12、一種如權(quán)利要求2或3所述的乙醇脫氫酶或權(quán)利要求11所述的重組乙醇脫氫酶在生物有機(jī)合成中將羰基化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種乙醇脫氫酶及其基因。該基因是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQIDNo.1所示的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開(kāi)了含有該基因的重組表達(dá)載體和表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及重組乙醇脫氫酶及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明從高加索乳桿菌(Lactobacilluskefir)DSM20587基因組中分離出了新的乙醇脫氫酶基因，擴(kuò)大了乙醇脫氫酶基因的資源，同時(shí)為L(zhǎng)actobacilluskefirDSM20587的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)，也為生物有機(jī)合成生產(chǎn)中立體選擇性的將帶有龐大側(cè)鏈的酮基化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇提供了優(yōu)良的乙醇脫氫酶。文檔編號(hào)C12N15/63GK101603044SQ20091014587公開(kāi)日2009年12月16日申請(qǐng)日期2009年6月10日優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日發(fā)明者珂尚,朱春寶,胡又佳,謝麗萍,陳祈磊申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院