專利名稱：：重組牛腸激酶、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明公開了重組牛腸激酶突變體和重組牛腸激酶融合蛋白、其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腸激酶(Enterokinase，EK或Enter叩eptidase，EP，EC3.4.21.9)是存在于哺乳動物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚休(heterodimeric)絲氨酸蛋白酶。分了-質(zhì)量為150kDa,由l條115kDa的重鏈和1條35kDa的輕鏈組成，在pH值4.5-9.5，溫度4-45。C范圍內(nèi)特異性水解蛋白底物。由于EK裂解融合蛋白所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列，因而可作為蛋白表達(dá)休系中融合蛋白的切割試劑。但是天然的腸激酶來源畢竟有限，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易為其它蛋白酶污染，造成切割融合蛋白的同時又降解了目的產(chǎn)物。而基因工程的方法正可以彌補(bǔ)這些不足，因而運(yùn)用基因工程的方法生產(chǎn)腸激酶廣為應(yīng)用。商品化的腸激酶主要有兩種天然提純的牛腸激酶和基因工程重組牛腸激酶。腸激酶具有以下特點(diǎn)-結(jié)構(gòu)特點(diǎn)天然腸激酶由1條結(jié)構(gòu)亞基(重鏈)和1條催化亞基(輕鏈)構(gòu)成，兩者通過1個分了間二硫鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)亞基負(fù)責(zé)將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導(dǎo)它向腸腔移動，催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶，從而啟動各種酶原活化的級聯(lián)。重組腸激酶(recombinantEnterokinase,rEK)的分子質(zhì)量通常為26.3kDa，具有3個糖基化位點(diǎn)，其糖基化分子質(zhì)量大約為43kDa。Vozza等發(fā)現(xiàn)，rEK體外實(shí)驗證明有全酶酶切特異性并且相較于天然腸激酶表現(xiàn)出對基因工程融合蛋白底物的酶切活性增強(qiáng)，因而現(xiàn)多采用基因工程的方法生產(chǎn)腸激酶。近年來所做的嘗試多是克隆與表達(dá)235個氨基酸的輕鏈(recombinantEnterokinaselightchain,rEKL)。Janska等研究氨基，末端殘基發(fā)現(xiàn)了EK輕鏈的二維結(jié)構(gòu)3與類胰蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)同源性。Seong等則發(fā)現(xiàn)將輕鏈氨基末端的Ile突變?yōu)閂al其酶活性幾乎不發(fā)生改變。另外，有研究發(fā)現(xiàn)EK的重鏈強(qiáng)烈影響腸激酶對大分子底物的識別而對合成的融合蛋白或小分子底物的識別沒有影響。酶學(xué)特點(diǎn)腸激酶在休內(nèi)激活胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶，由于腸激酶的輕鏈結(jié)構(gòu)在人、牛和豬中保守，其識別序列A印-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強(qiáng)的保守性，且?guī)缀跛斜欢ㄐ虻囊鹊鞍酌冈季哂?個天冬酰胺相連的特征，此序列在其它的天然蛋白質(zhì)上又非常罕見，而腸激酶的活性中心有l(wèi)個特殊的陽離子位點(diǎn)，使得有強(qiáng)大負(fù)電的Asp-A印-Asp-Asp可以與此陽離子位點(diǎn)結(jié)合，因此，牛腸激酶的底物酶切位點(diǎn)序列具有高度的特異性，這種特點(diǎn)使得EK成為基因工程融合蛋白表達(dá)后修飾過程中l(wèi)個極其有用的工具而被廣泛應(yīng)用。對于EK酶切的高度特異性，Rumsh認(rèn)為是由于酶中鈣離子的喪失使得酶自切割，從而具備了激活其它酶的高度特異性。但是在實(shí)際的酶切反應(yīng)中也可能產(chǎn)生一些非特異性的切割，在基因工程研究中應(yīng)認(rèn)真對待。分離純化特點(diǎn)與大多蛋白的分離純化方法類似，rEK可通過硫酸銨沉淀、DEAE柱、凝膠層析和透析等方法得到純品，另外，運(yùn)用組氨酸(Histidine，His)在蛋白末端進(jìn)行標(biāo)記，Nickel金屬螯合柱親和純化這種低成本高效率一步分離蛋白的方法，也正廣泛地運(yùn)用到rEK的分離純化，其收率可達(dá)50%以上。對于His-tag的位點(diǎn)，Choi等研究發(fā)現(xiàn)在rEK,的C末端進(jìn)行His標(biāo)記，用Nickel金屬螯合柱親和純化后其酶活性不發(fā)生改變，而在N端進(jìn)行His標(biāo)記后通過Nickel金屬螯合柱則酶活性喪失。生理特點(diǎn)1939年Kunitz證實(shí)腸激酶是胰蛋白酶原的生理激活劑，而胰蛋白酶是消化系統(tǒng)其它許多酶原的激活劑，因此腸激酶被認(rèn)為是消化系統(tǒng)重要的起始酶之一。一般認(rèn)為EK存在于小腸刷狀緣細(xì)胞膜上，Zamolodchikova等認(rèn)為pro-EK是由十二指腸酶激活的。病理研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸與胰腺的回流液中富集EK會激活過多的胰蛋白酶原從而導(dǎo)致急性胰腺炎，而EK缺陷的機(jī)休將會有腹瀉、嘔吐、浮腫等癥狀，造成發(fā)育不良，導(dǎo)致血蛋白不足癥和貧血。EK的基因工程研究進(jìn)展在原核生物中的表達(dá)在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的基因工程大多是采用大腸桿菌Escherichiacoli來作為宿主菌。但是對于表達(dá)含二硫鍵的蛋白應(yīng)該考慮到表達(dá)的蛋白二硫鍵的正確性及蛋白的活性，因而為保證腸激酶二硫鍵的正確形成，學(xué)者們采用融合DsbA、thioredoxin等方法使得表達(dá)的腸激酶有活性。LaVallie等采用了融合表達(dá)伴侶DsbAprotein在Escherichiacoli中分泌表達(dá):將牛EK"DNA序列融合在DsbA序列的3'末端，融合蛋白間通過編碼EK的特異性識別位點(diǎn)的序列相連，通過自切割加工就可以得到有活性的rEK,，并且其切割含Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的融合蛋白的能力要優(yōu)于天然腸激酶。黃鶴等是通過提取牛組織總RNA，以RT-PCR方法闊增得到牛EKLcDNA，將該基因插入pET39b中構(gòu)建牛EKL融合表達(dá)載體pET39b-E&，在EscherichiacoliBL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，通過Nickel金屬螯合柱一步分離，得到了有活性的腸激酶。Yuan等是將牛EK,.cDNA序列融合在融合表達(dá)伴侶thioredoxin(Trx)下游，在EscherichiacoliBL21(DE3)表達(dá)，在體內(nèi)自催化切割融合蛋白Trx-EK「后，有完整生物活性的rEKt被釋放出來，經(jīng)DEAE等方法純化，測其比活為720Aus/rag，Km=0.17mM，K(cat)=20.8s/L,100ml搖瓶得到4.3mgEK,純品。與之相似，Gasparian等是將人EK,.cDNA序列融合在Trx下游，克隆到pET32a上，在EscherichiacoliBL2J(DE3)表達(dá)，可溶性的產(chǎn)物無自切割活性，通過增溶和復(fù)性從包涵體中獲得了有活性的重組人腸激酶催化亞基(L-HEP)，用純化的L-服P切割Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-beta-卿hthylamide，其Km=0.16Mm，K(cat)=115s/L。在相同條件下，L-服P消化硫氧還蛋白-人表皮生長因子Trx-hEGF(thioredoxinhuman印idemalgrowthfator)的速度比相同活性單位的牛EK,.快5倍。在真核生物中的表達(dá)包括在真菌、哺乳動物細(xì)胞和酵母中表達(dá)，對于在其中真菌中表達(dá)Svetina等將插入了KEX-2蛋白酶酶切為點(diǎn)的牛EK,.的cDNA融合在葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)基因下游，在黑曲霉(filamentousfungusAspergillusnigerAB1.13)中進(jìn)行分泌表達(dá)，融合蛋白在向細(xì)胞周質(zhì)分泌途中被核酸內(nèi)切酶KEX-2加工成成熟的EKL,運(yùn)用離子交換層析和親和層析分離純化培養(yǎng)液上清可得到有活性的EKL1.9mg/L，在大豆牛奶培養(yǎng)基的最高產(chǎn)量可達(dá)5mg/L(高于在E.coli中的產(chǎn)量)，雖然低于在甲醇酵母中的表達(dá)量，但是在濕菌體中EKL的得率32ug,/g卻遠(yuǎn)大于在甲醇酵母中的12ug/g。對于動物細(xì)胞表達(dá)，1993年，LaVallieER等以哺乳動物絲氨酸蛋白酶PACE的前肽作為分泌引導(dǎo)序列融合到EK,.的N末端，將此融合基因PACE-E&構(gòu)建到pMT3表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)染猴腎COS-1細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得了有低活性的EKL，同時研究發(fā)現(xiàn)由PACE-EKL/KEX2共表達(dá)得到的EKL，其切割熒光底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-beta-naphthylamide的活性有增強(qiáng)的趨勢。對于利用酵母細(xì)胞表達(dá)，常用于外源蛋白的功能性表達(dá)的酵母是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和甲醇酵母(Pichiapastoris)，這兩個系統(tǒng)都具有翻譯后修飾的功能二硫鍵的形成、蛋白的糖基化等，這些翻譯后加工方式比較類似于哺乳動物細(xì)胞。由于酵母不能利用外源基因的信號序列引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達(dá)，因而Saccharomycescerevisiae和Pichiapastoris利用由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號-交配因子(-MF)前導(dǎo)序列來引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達(dá)。與其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于強(qiáng)有力的A0X1啟動子嚴(yán)格調(diào)空外源蛋白的表達(dá)，對人是安全的，能在常規(guī)實(shí)驗室中應(yīng)用并且費(fèi)用低廉。牛EKL有4對分子內(nèi)二硫鍵，S-S能否正確形成直接影響El是否有活性，因而國內(nèi)外學(xué)者紛紛利用酵母可以進(jìn)行翻譯后加工的特點(diǎn)在酵母系統(tǒng)表達(dá)E&蛋白。在Saccharomycescerevisiae系統(tǒng)表達(dá)腸激酶所做的嘗試是Choi和Seong等將編碼235個氨基酸的牛EKLcDNA克隆至pIL20Gh，構(gòu)建pIL20Efd分泌表達(dá)載體，-MF為啟動子，以人的-白介素(interleukin-1)N末端24個氨基酸作為分泌增強(qiáng)子，并在interleukin-1與EK,.之間引入了KEX酶切位點(diǎn)，在Saccharomycescerevisiae2805進(jìn)行分泌表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)Nickel金屬螯合分離純化，得到有活性的EK,.(約lmg/L)。Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)自70年代應(yīng)用于單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)以來，經(jīng)過近20年的發(fā)展，已發(fā)展成為一個成功表達(dá)了200余種外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。pA0804、pA0815和pPIC3等為其常用的表達(dá)載體。Pichia系統(tǒng)的最大特點(diǎn)天然蛋白的分泌水平極低，使得外源蛋白表達(dá)后成為培養(yǎng)基中主要成分。因此，利用Pichiapastoris系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白被廣泛應(yīng)用在基函工程領(lǐng)域。孫自勇等用RT-PCR擴(kuò)增EKl的Cdna，構(gòu)建pPICZaA-EK,.表達(dá)載體，在宿主PichapastorisGS115中分泌表達(dá)，發(fā)酵液經(jīng)Zn-S印harose親和純化后可得到EK丄6mg/L(純度大于90%)，得率高于Choi報道的從1L啤酒酵母培養(yǎng)液中純化lmgEKl的收率，其對小分子熒光底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp—Lys—beta—naphthylamide的Km=753±42mM，K(cat)=31.5±3.8s/L。LFang等將牛EKL整合到pA0815質(zhì)粒中，用甲醇誘導(dǎo)在宿主PichiapastorisGS115總分泌表達(dá)，經(jīng)Nickel金屬螯合柱分離純化發(fā)酵上清得到有活性的EK,.5.4nig/L。Vozza等以-MF為前導(dǎo)序列在甲醇酵母中分泌表達(dá)牛EK,.，純化發(fā)酵液上清得到有活性的EK,.6.3mg/L，蛋白表達(dá)量明顯高于在E.coli和COScells中的表達(dá)量。2004年，PengZhong用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)EKL，用甘油/甲醇培養(yǎng)基在pH值6.0，rEI^的產(chǎn)量達(dá)350mg/L，經(jīng)陰離子交換層析后得到EK,.為15mg/L。盡管對重組腸激酶已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，對于目前廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的腸激酶輕鏈包涵體產(chǎn)物存在著包涵體產(chǎn)物復(fù)性困難，蛋白活性低的問題，而且，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，仍需要表達(dá)量高，活性好且適用于生產(chǎn)的重組腸激酶。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量實(shí)驗，參照牛腸激酶輕鏈EKL與其抑制劑VD4K-氯甲的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Codeno:IEKB，ProteinDtabaseBank),觀察以VD4K為中心5A范圍內(nèi)的氨基酸殘基的情況，選擇突變后可能增強(qiáng)EKL與DDDDK結(jié)合活性的殘基，將其突變?yōu)镽，以增強(qiáng)其與VD4K中D的結(jié)合力。共設(shè)計了9個突變體，分別命名為EKLml、EKLm2、EKLm3、EKLm4、EKLm5、EKLm6、EKLm7、EKLm8、EKLm9,活性測定比較表明野生型EKL的米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax與股D同類產(chǎn)品相似，9個突變體中，EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的Km與野生型相比均有不同程度的下降，其中以EKLm6的Km值降低最為顯著，即EKLm6具有與底物最佳的親和力。本發(fā)明的發(fā)明人還采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對EKLm6進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高活性的EKLm6，實(shí)驗結(jié)果表明酵母表達(dá)的EKLm6的活性也同樣高于EKL,酵母表達(dá)的EKLm6活性是大腸桿菌表達(dá)的相同蛋白的2倍。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的腸激酶輕鏈包涵體產(chǎn)物復(fù)性困難，因此活性蛋白的得率極低。為了盡可能提高EKL活性蛋白的產(chǎn)量，分別選取腸激酶重鏈EKH的各結(jié)構(gòu)域與EKL經(jīng)一個10肽的柔性Linker相連構(gòu)成融合蛋白，通過誘導(dǎo)表達(dá)EKL、EKLra6、EKHl-EKLm6、EKH3-EKLm6、EKH4-EKLm6、EKH5-EKLm6，結(jié)果表明每100gEKH5-EKLm6包涵體可復(fù)性純化得到祖L3.8mg蛋白，其得率較EKL(10.4mg)、EKLm6(9.8rag)、EKH1-EKLra6(7.6mg)、EKH3-EKLra6(12.6mg)和EKH4-EKLm6(9.5mg)有顯著提高，更具體地，為了增強(qiáng)復(fù)性效果，提高活性蛋白的得率，在復(fù)性緩沖液中添加了PEG-8000和丙三醇，輔助蛋白的正確折疊以及保持蛋白的活性。另外，采用特異性極高的STI親和層析柱來純化有活性的蛋白，可以有效的將正確折疊的目的蛋白跟未正確折疊的目的蛋白以及雜蛋白分開，得到純度達(dá)98%以上的活性蛋白，極大的提高了蛋白的純度，避免了金屬螯合柱純化蛋白雜質(zhì)較多的弊端?；钚詼y定表明利用大腸桿菌表達(dá)的EKH5-EKLm6融合蛋白和EKLm6的活性相似，與市場現(xiàn)有的腿D公司的產(chǎn)品相比，其活性提高了近10倍，酵母表達(dá)的EKLm6活性與市場現(xiàn)有的股D公司的產(chǎn)品相比活性提高了近20倍。上述結(jié)果表明，本發(fā)明公開的重組牛腸激酶達(dá)到了本發(fā)明的目的。圖1:牛腸激酶輕鏈與其抑制劑VD4K-氯甲的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)圖，其中牛腸激酶輕鏈氨基酸用條帶表示；VD4K-氯甲的氨基酸殘基用淺色標(biāo)識；牛腸激酶輕鏈中與抑制劑緊密接觸的氨基酸殘基用深色標(biāo)識；圖2:重組牛腸激酶輕鏈突變體序列比較圖，短劃線代表突變體中與EKL在相對應(yīng)位置相同的氨7基酸殘基；圖3:重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白基因結(jié)構(gòu)圖；3-1:EKH1-EKLlIl6;3-2:EKH3-EKLra6;3-3:EKH4-EKLm6;3-4:EKH5-EKLm6;圖4:EKL及突變體Km、Vmax測定，Linewaver-Burk作圖結(jié)果；圖4-1:EKLml;圖4-2:EKLm2;圖4-3:C.EKLm3;圖4-4:EKLm4;圖4-5:EKLm5;圖4-6:EKLm6;圖4-7:EKLm7;圖4-8:EKLm8;圖4-9:EKLm9;圖5:溫度對酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的影響結(jié)果；其中1:20°C，2:l(TC，3:30°C;圖6:反應(yīng)時間對酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的影響結(jié)果；其中1:40hr，2:20hr，3:10hr，4:5hr;圖7:不同用量的酶酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的結(jié)果；其中1:1.28ng,2:0.64ng，3:0.32ng，4:0.16ng，5:0.08ng，6:0.04ng，7:0.02ng，8:0;圖8:EKH5-EKLm6的穩(wěn)定性檢測結(jié)果;其中l(wèi):-20。C，保存6個月，2:-2(TC及37'C'反復(fù)3次，3:37。C放置l天.4:37。C放置3天，5:37。C放置5天，6:37。C放置7天，7:37。C放置10天，8:對昭.圖9:底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響曲線；圖10:雙倒數(shù)坐圖結(jié)果。圖11:反應(yīng)溫度對酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影響實(shí)驗結(jié)果圖12:反應(yīng)時間對酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影響實(shí)驗結(jié)果圖13:酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的最適比例實(shí)驗結(jié)果圖14:EKH5-EKLm6的穩(wěn)定性檢測結(jié)果具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制，實(shí)施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基因描入到這樣的載休和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法以及經(jīng)典的細(xì)胞融合和篩選、分離和純化等方法。這樣的方法對于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J".,Fritsch,E.F.andManiais,T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2"'1edition,ColdspringHarborLaboratoryPress-本發(fā)明實(shí)施例中未標(biāo)明來源的原、輔料均為市售。thioredoxin-humaninterleukin-11(Trx/hIL-11)(上海中信國健藥業(yè)有限公司)Trx-MBL-CLR:按《人MBL-CLR表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)》(《細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志》2007No.23(1)Page:25-7，31蔡學(xué)敏、左大明等)中公開的方法制備得到實(shí)施例1牛EKcDNA片段的克隆取150mg新鮮的牛十二指腸，用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取總RNA,取0.5W總RNA，加入3W。ligo(dT)18primer引物，補(bǔ)加水至總體積10.5，混勻。室溫放置10min,高速離心5min。再依次加入4.0W5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，0.5f4腿酶抑制劑，2.(M10mMdNTP，2.0WDTT，1WMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，置37°C反應(yīng)120min。取1.5PlRT產(chǎn)物，加入lOOptnol上游弓l物(5，-aagcttatggggtcaaagcgaagtgt-3，)禾口下游弓l物(5，-gaattctcaatgtaga咖ctttgtatcc-3，，參照CenBank中牛Enterokinase的編碼序列，序列號U09859設(shè)計引物),2.10XPCR緩沖液,2"12.5mMdNTP，2.5DMS0,0.25Taq酶，加水至終體積25W,混勻后迅速加入5Ml的石蠟油進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94'C變性4min;然后進(jìn)行以下30個循環(huán)94。C變性50s，51。C退火50s。72。C3rain;最后在72。C延伸8miin。將cDNA片段電泳，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行膠分離回收。將pMD18-T載體與8W回收的PCR產(chǎn)物在T-4DNA連接酶的作用下16。C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5a。隨機(jī)挑取單一白色菌落5個，37'C搖菌過夜，進(jìn)行質(zhì)粒提取，以HindIII和EcoRI酶切鑒定，對插入的片段進(jìn)行全序列測定，篩選出正確插入者，命名為pMD18-T-EK。實(shí)施例2EKLm的設(shè)計及pET39b-EKL和pET39b-EKLm表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了提高腸激酶的活性，本申請的發(fā)明人參照牛腸激酶輕鏈與其抑制劑VD4K-氯甲的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Codeno:1EKB，ProteinDtabaseBank),觀察以VD4K為中心5A范圍內(nèi)的氨基酸殘基的情況，選擇突變后可能增強(qiáng)EKL與DDDDK結(jié)合活性的殘基，將其突變?yōu)镽,以增強(qiáng)其與VD4K中D的結(jié)合力。共設(shè)計了9個突變體，如圖1所示。以鑒定正確的pMD18-T-EK為模板，PCR再次擴(kuò)增牛腸激酶輕鏈編碼區(qū)cDNA片段，上游引物為5-gaattcggacgacgacgacaagattgtcggaggaag1:gactcc-3，■，F(xiàn)游引物為5，-aagctttcaatgtagaaaactttgtatcc-3'。上游引物帶EcoRI酶切位點(diǎn)和腸激酶識別位點(diǎn)，下游引物帶HindIII酶切位點(diǎn)和終止密碼子。PCR擴(kuò)增條件為94。C變性4min;然后進(jìn)行以下30個循環(huán)94。C變性45s,52。C退火45s。72'C延伸1min;最后在72'C延伸7raim。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行回收(方法同前)，構(gòu)建EKL基因。在此基礎(chǔ)上，為提高其結(jié)合活性，做9個突9變休，突變位點(diǎn)如圖1所示，分別定名為EKLml、EKLm2、EKLra3、EKLra4、EKLm5、EKLm6、EKLm7、EKLm8、EKLm9，將測序正確的突變體基因分別與pET39b質(zhì)粒用HindIII和EcoRI37°C雙酶切2小時。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收酶切產(chǎn)物。目的片段及載體按摩爾比4:l混合，10)4連接體系，T4DNA連接酶，16。C水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切鑒定正確克隆，分別命名為pET39b-EKL和pET39b-EKLml，pET39b-EKLra2，pET39b-EKLm3，pET39b-EKLm4，pET39b-EKLm5,pET39b-EKLm6，pET39b-EKLm7，pET39b-EKLm8，pET39b-EKLm9。實(shí)施例3pET39b-EKL和pET39b-EKLm的誘導(dǎo)表達(dá)pET39b載體上提供的硫氧還蛋白類似物DsbA可以幫助蛋白質(zhì)正常折疊,從而產(chǎn)生有活性的可溶蛋白。將各工程菌接入LB培養(yǎng)基中。放入搖床在37。C，250rpm條件下過夜培養(yǎng)。將過夜f的種了液加入2YT培養(yǎng)基中，放入搖床在37。C，250rpm條件下培養(yǎng)。當(dāng)0Dh。。為0.6時，加入O.lmMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，放入搖床在30。C，250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)2hj^取樣，離心去上清，沉淀放入冰箱，然后每過lh取樣，同樣離心i上清，將沉淀放入冰箱。誘導(dǎo)6h后收瓶，離心去上清。PAGE電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)情況，以誘導(dǎo)4小時時目的蛋白表達(dá)量最高。根據(jù)大腸桿菌搖床表達(dá)的實(shí)驗結(jié)果將活化的工程菌接入LB培養(yǎng)基中，放入搖床，在37'C，250rpm條件下過夜培養(yǎng)。將過夜后的種了液加入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37",氨水調(diào)節(jié)pH為7.4，飽和氧氣休積分?jǐn)?shù)保持>130%。當(dāng)OD為8.0時，取樣做對照，并加入0.3mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，溫度降低至30°C。誘導(dǎo)3h后收罐，離心i上淸。實(shí)施例4EKL及其突變體的復(fù)性和純化將表達(dá)EKL及其突變休的大腸桿菌發(fā)酵液離心(8000rpra，10min，4'C)棄上清，用緩沖液(50mMTris-HC1pH8.5)以1.Og菌體10ml緩沖液懸浮菌體。待完全溶解。然后超聲(800w/30s，4-6次)破菌30min，鏡檢顯示菌體完仝破開后，離心(12000rpm，15min，4。C)棄上清，收集包涵體沉淀，用于進(jìn)一步純化。每克包涵體以8ml溶解液(8M尿素，20mMTrisIO(MI2-MTPH8.0)變性溶解，脫鹽去除0-MT后稀釋復(fù)性(至尿素終濃度1M)16'C過夜。脫鹽至酶切緩沖液(20mMTris50mMNaCllmMCaCl2PH8.75)自切10小時。以STI(特異性胰酶抑制劑，可特異結(jié)合EK)親和層析柱純化EKL及其突變休。每100g包涵休可復(fù)性純化得到約5-15mg蛋白。實(shí)施例5EKL及其突變體的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的測定在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加決，兩者圼正比關(guān)系；當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時，反應(yīng)速度雖然隨著底物濃度的升高而加快，^不再呈正比例加快；當(dāng)?shù)孜餄舛仍龈叩揭欢ǔ潭葧r，如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，說明酶己被底物所飽和。在酶的濃度不變的情況下，底物濃度對反應(yīng)速度影響的作用圼現(xiàn)矩形雙曲線。見圖9。酶促反應(yīng)速度與底物濃度之間的變化關(guān)系，反映了[ES]的形成與生成產(chǎn)物[P]的過程。在[S]很低時，酶的活性中心沒有全部與底物結(jié)合，增加[S]，[ES]的形成與[P]的生成均呈正比關(guān)系增加；當(dāng)[S]增高至一定濃度時，酶全部形成了[ES]，此時再增加[S]也不會增加[ES]，反應(yīng)速度趨于恒定。為了解釋底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系，1913年Michaelis和Menten把上圖歸納為酶促反應(yīng)動力學(xué)最基本的數(shù)學(xué)表達(dá)式---米氏方程Michaelis-Menten:^+問式中v——反應(yīng)速度；Km——米氏常數(shù)；Vmax——酶反應(yīng)最大速度；——底物濃度。在酶學(xué)分析中，Km是酶的一個基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。Km與底物濃度、酶濃度無關(guān)，與pH、溫度、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。對于每一個酶促反應(yīng)，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。米氏常數(shù)(Km)的意義1.當(dāng)反應(yīng)速度為最大速度一半時，米氏方程可以變換如下l/2Vmax=Vmax[S]/(Km+[S])所以Km=[S]。因此，Km值等于酶促反應(yīng)最大速度一半時的底物濃度。2.Km值可判斷酶與底物的親和力(Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；反之亦然)。3.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。酶的種類小同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同。測定Km、Vmax，一般用作圖法求得。作圖法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作圖法，該法是根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式，以1/v對1/[S]作圖，可得到一條直線(見圖)。直線在橫軸上11的截距為-1/Km，縱截距為1/V腿x，可求出Km與V腿x。丄-i丄+丄vL問K皿見圖IO。Enterokinase活性通過其熒光底物Gly-Asp-Asp-Asp_Asp-Lys-naphthylamide(Sigma)測定。多肽底物溶解于含有10。/。DMS0，70mMTris-HC1，pH8.O溶液中。100nLEnterokinase溶液與2.4mL底物溶液混合，室溫(25°C)，測定單位時間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，通過熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)檢測酶活性，激發(fā)波長337nm，檢測波長420nm。Km通過Linewaver-Burk作圖法計算。為i十算方便，Enterokinase酷角軍Gly—Asp—Asp—Asp—Asp—Lys—naphthylamide，反應(yīng)30秒熒光強(qiáng)度增加l，定義為1AU。反應(yīng)中，重組牛EnLerokinase用量為50nM,底物濃度分別為O.05、0.1、0.2、0.4及0.8mM。結(jié)果見表卜4、圖4:表lEKLEKLmlEKLm2EKLm3EKXm4EKLm50.050.7810.5280.4650.9260.6011.2790.11.4120.9490.8271.6031.0752.0120.22.0951.5231.4122.1861.6392.5370.42.6672.1862.0192.9042.3413.1060.83.0042.7242.6473.2712.7303.452表2EKLm6EKLm7EKLm8EKLm9R&D0.0525790.7120.9540.5250.8930.13.251.1401.5770.9831.5150.23.4261.6852.2101.6842.1640.437052.3742.8762.3792.7840.83.7922.7933.3652.7803.129表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)論:野生型EKL的Km及Vmax與R&D同類產(chǎn)品相似，9個突變休中，EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLra8的Km與野生型相比均有不同程度的下降(EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的氨基酸序列經(jīng)過測序分別為SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:2、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16)，其中以EKLm6的Km值降低最為顯著，S卩EKLib6具有與底物最仕的親和力。實(shí)施例6pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的腸激酶輕鏈包涵休產(chǎn)物復(fù)性閑難，因此活性蛋白的得率極低。為了盡可能提高EKL活性蛋白的產(chǎn)量，在采用pET39b表達(dá)載休的基礎(chǔ)上，分別選取腸激酶重鏈EKH的各結(jié)構(gòu)域與EKL經(jīng)一個10肽的柔性Linker(核苷酸序列見SEQIDNO.11，氨基酸序列見SEQIDNO.12)相連構(gòu)成融合蛋白，通過對各融合蛋白的復(fù)性情況及活性測定篩選最優(yōu)化的融合蛋白結(jié)構(gòu)，具體實(shí)驗方法如下。以鑒定正確的pMD18-T-EK為模板，再次PCR擴(kuò)增牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域5及以pET39b-EKLm6(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2分別顯示了EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列)為模板擴(kuò)增輕鏈編碼區(qū)DNA片段，重鏈第5結(jié)構(gòu)域上游引物為5,-gaattcggacgacgacgacaagcgtctcttcaatggcacg-3'，下游弓l物為5'cccaccgcctgagcctccaccgccgtagaaacattgtagcag-3，,輕鏈編碼區(qū)上游弓l物為5-'gaggctcaggcggtgggggttctattgtcggaggaagtgactc-3，，輕鏈下坊引物為5，-aagctttcaatgtagaaaacUtgtatcc-3'。重鏈第5結(jié)構(gòu)域上游引物帶有EcoRI酶切位點(diǎn)和腸激酶識別位點(diǎn)，輕鏈下游引物帶HindIII酶切位點(diǎn)和終止密碼子。重鏈第5結(jié)構(gòu)域下游引物和輕鏈編碼區(qū)上游引物重疊PCR一/增條件為94°C預(yù)變性4rain;然后94°C變性45秒、55'C退火1min、72°C1min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72。C延伸7min。PCR增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，用overlapPCR的方法連接，經(jīng)瓊脂塘凝膠電泳純化回收，與pET39b質(zhì)粒DNA分別用HindlII和EcoRI于37。C酶切2hr。1XTAE，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切產(chǎn)物。處理后的描入片段及載休按摩爾比4:l混合，10化連接休系，1WT4DNA迕接酶，16'C水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.co]iBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切鑒定正確重組克隆，命名為pET39b/EKH5-EKLm6。用同樣的方法構(gòu)建牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域1、3、4(重鏈各結(jié)構(gòu)域引物如下重鏈第1結(jié)構(gòu)域上游引物為5'-gaattcggacgacgacgacaagccacctgattcaaggctgtg-3，，下游弓l物為5'cccaccgcctgagccLccaccgccagctgtggcacaagttttattg-3';重鏈第3結(jié)構(gòu)域上幼爭弓l物為5'-gaattcggacgacgacgacaagtgtggagggcctcatgacc-3，,下游弓l物為5'cccaccgcctgagcctccaccgccatagccagtagtgaaatttgc-3'重鏈第4纟占構(gòu)域上游引物為5，-gaattcggacgacggLcgacaagaaggaagac3attttcagtg-3，，下游引物為5，cccac.cgcctgagcctccaccgccacagtgtgcttcatctgagc-3，。輕鏈弓l物同前)與EKLm6的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pET39b/EKH1-EKLm6、pET39b/EKH3-EKLm6、pET39b/EKH4-EKLm6。SEQIDM.3和SEQIDV0:4分別顯示了EKH1-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:5和SEQIDNO:6分別顯示了EKH3-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:7和SEQIDNO:8分別顯示了EKH4-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:9和SEQIDNO:10分別顯示了EKH5-EKLni6的核苷酸序列和氨基酸序列。實(shí)施例7pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)方法同實(shí)施例3，分別誘導(dǎo)表達(dá)EKH1-EKLra6、EKH3-EKLm6、EKH4-EKLm6、EKH5-EKLm6。實(shí)施例8pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白的復(fù)性和純化方法同實(shí)施例4，結(jié)果如表5所示，每100gEKH5-EKLm6包涵休可復(fù)性純化得到113.8mg蛋白，其得率較EKL、EKLm6、EKH1-EKLm6、EKH3-EKLm6和EKH4-EKLra6有顯著提高。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例9EKL和EKLm蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)將pET39b-肌和pET39b-EKLm(1-9)中的H的基因以BamHI和EcoRI酶切，裝入同酶切的pPICZaA(Invitrogen)質(zhì)粒中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化CaCl法制備的T0P10F感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定正確重組克隆，分別命名為pPICZaA-EKL和pPICZaA-EKLm(1-9)。隨后提取的質(zhì)粒線性化，轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115(Irwitrogen公司)，RDB平板初步篩選，得到陽性重組T。將活化的工程菌分別接種于YPD和BMGY培養(yǎng)基中，放入搖床在3(TC、250rpm條件下過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)后的種子液倒回原BMGY培養(yǎng)基中，旗人搖床，在3(TC、250rpm條件下培養(yǎng)48h。補(bǔ)加無水甲醇誘導(dǎo)，至終濃度為0.5%。甲醇誘導(dǎo)后每隔12h取樣，檢查腸激酶表達(dá)情況，并補(bǔ)加無水甲醇，至終濃度為O.5%。誘導(dǎo)72h后收瓶，對所取樣品進(jìn)行分析。同時在全自動30L發(fā)酵罐中按裝量10L的水平進(jìn)行了探索性培養(yǎng)和發(fā)酵。將工程菌接種于1LYPD(分2瓶裝)培養(yǎng)棊中，放入搖床在30。C、250rpra條件下培養(yǎng)。當(dāng)％。為5.0且鏡檢菌種形態(tài)合格時，轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中。培養(yǎng)溫度30°C,氨水調(diào)節(jié)pH5.0，飽和氧氣體積分?jǐn)?shù)保持不低于20%。發(fā)酵過程中依據(jù)菌休牛長密度添加高壓滅菌后的50%甘油。當(dāng)菌休密度達(dá)OD為200250時加入無水甲醇誘導(dǎo)，控制其終濃度不超過1%，此時pH值控制在3.0。誘導(dǎo)后每12h取樣，測OD和菌休濕重，并測定活性。誘導(dǎo)72h后收罐，離心取上清，準(zhǔn)備純化。實(shí)施例IO畢赤酵母中表達(dá)的EKL和EKLm蛋白的純化收集上清，經(jīng)railipore超濾膜超濾濃縮，將上一步獲得的濃縮液用1M的NaOH調(diào)pH8.0后，經(jīng)ChelatingS印haroseFastFlow柱純化。先用緩沖液(25mmol/LTris-HC1pH8,O，O.3MNaCl)沖洗平衡柱子，將pl18.0的濃縮液上樣，流速為4cm/min,收集穿透液。上樣后用平衡液沖洗至基線，用洗脫A液(25mMTris-HC1p朋.0，50mraol/L咪唑)洗脫蛋白，收集洗脫峰1，再用洗脫B液(25mMTris-HClpH8.0，200mraol/L咪唑)洗脫蛋白，收集洗脫峰2，SDS-PAGE檢測，結(jié)果見表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例llpET39b/EKLm6，pET39b/EKH-EKLm6,pPICZaA-EKLm6的活性測定材料分析緩沖液50raMTris,pH7.5;重組牛Enterokinase:本發(fā)明制備；底物thiobenzylbenzyloxycaxbonyl-L-lysinate(Z-Lys-SBz丄)(BachemCatalog#M-1300);5,5，-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid)(謂B)(SigmaCatalogD-8130);96孔酶標(biāo)板(Costar，Catalog#92592);酶標(biāo)儀(SpectraMaxPlus,MolecularDevices);重組牛腸激酶4139-SE，腿D公司產(chǎn)品方法用分析緩沖液將重組牛Enterokinase稀釋至O.04yg/mL;用含有200tiMDTNB的分析緩沖液將Z-Lys-SBzl稀釋至200uM;96孔板中加入重組牛Enterokinaso稀釋液，50uL/孔，空白對照孔加入分析緩沖液，50iiL/孔；每孔加入50uLZ-Lys-SBzl/DTNB混合液開始反應(yīng)；以動力學(xué)模式讀取A幼5nm，共5分鐘；計算重組牛Enterokinase特異活性96孔板中酶及底物終濃度(量)重組牛Enterokirmse:2ng重組牛腸激酶4139-SE:2ng畫B:100yM底物Z-Lys-SBz:100uMA405/inin=(V媳max-V空白max)(mOD/min)/校正因了'cm/1000活性(畫le/Wyg)=([A405/rain(按上式計算得到)X體積(0.0001L)]/[消光系數(shù)(13260M—'cm')X酶量(yg)]}X109結(jié)果見表7:表7<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>V酸max—V空白max121129623311活性45.2422.3362.0878.641.5結(jié)論野生型EKL活性與R&D同類產(chǎn)品相似，而大腸肝菌表達(dá)的EKLm6、EKH5-EKLm6活性較野生型提高了10倍左右，酵母表達(dá)的EKLm6活性是大腸桿菌表達(dá)的相同蛋白的2倍。實(shí)施例12:反應(yīng)溫度對酶切thioredoxin融合蛋白thioredoxin-h咖aninterleukin-ll(Trx/hlL-ll)的影響實(shí)驗含有enter鄰印tidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin-humaninterleukin-ll(Trx/hIL-11)(以下均稱Trx/hlL-ll)以20ug與2ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)休系為O.lMTris-HC1(pH8.0)，lmMCaCL，及O.1%Tween20，反應(yīng)體積20nL，酶切溫度分別為10'C、20。C及30。C,反應(yīng)20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示，EKH5-EKLm6在2(TC具有最佳的酶切活力(見圖5)實(shí)施例13:反應(yīng)時間對酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hlL-ll的影響實(shí)驗含有enterop印tidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin—humaninterleukin-ll(Trx/hIL-11)以20tig與2ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)體系為O.1MTris-HC1(pH8.0)，lmMCaCL，及O.線Tween20，反應(yīng)休積20uL，反應(yīng)溫度為20。C，反應(yīng)時間分別為5hr、10hr、20hr及40hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯不，EKH5-EKLm6在2(TC酶切Trx/hlL-11，20hr可酶切完全(見圖6)。實(shí)施例14:酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hlL-ll的最適比例含有enterop印tidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin-humaninterleukin-ll(Trx/hIL-11)以20ng與0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32'0.64及1.28ngEKH5-EKLm6反應(yīng),反應(yīng)休系為O.1MTris-HCl(pH8.0)，lmMCaCl2，及O.1%Tween20，反應(yīng)體積20uL，反應(yīng)條件20。CX20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示，EKH5-EKLm6在2(TC酶切Trx/hlL-11，反應(yīng)20hr，在酶底物=1:20000(ra:m)(質(zhì)量比以下同)即可酶切完全(見圖7)。實(shí)施例15:EKH5-EKLm6的穩(wěn)定性檢測EKH5-EKLm6模擬在實(shí)際保存過程中可能遭遇的不利條件，而后檢測其酶切Trx/hIL-11的能力，以20ug與1.28ngEKH5-EKLm6反應(yīng)'反應(yīng)休系為O.1MTris-HC1(pH8.0)，威CaCl"及0.1%Tween20，反應(yīng)休積20yL，反應(yīng)條件2(TCX20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。擬保存條件下留樣考察-20°C，保存6個月；反復(fù)凍融-2(TC及37'C反復(fù)3次；高溫37'C放置1、3、5、7、IO天。SDS-PAGE結(jié)果顯不，EKH5-EKLin6在上述保存條件下，對酶切活性沒有顯著影響(見圖8)。實(shí)驗例16反應(yīng)溫度對酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影響實(shí)驗含有enteropeptidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20昭與2ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)體系為0.1MTris-HCl(pH8.0)，1mMCaCl2及0.1。/。Tween20，反應(yīng)體積20nL，酶切溫度分別為1(TC、20'C及3(TC，反應(yīng)20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖llSDS-PAGE結(jié)果顯不，EKH5-EKLm6在2(TC具有最佳的酶切活力。實(shí)施例17反應(yīng)時間對酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影響實(shí)驗含有enterop印tidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20jig與2ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)體系為0.1MTris-HCl(pH8.0)，lmMCaCl2，及0.1%Tween20，反應(yīng)體積20nL,反應(yīng)溫度為2(TC，反應(yīng)時間分別為5hr、10hr、20hr及40hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖12SDS-PAGE結(jié)果顯示，EKH5-EKLm6在20。C酶切Trx-MBL-CLR，20hr可酶切完全。實(shí)施例18酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的最適比例實(shí)驗含有enteropeptidase酶切位點(diǎn)(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20嗎與0，0.02,0.04，0.08，0.16，0.32，0.64及1.28ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)休系為0.1MTris-HCl(pH8.0)'lmMCaCl2，及0.1%Tween20，反應(yīng)休積20(xL，反應(yīng)條ff2(TCx20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS—PAGE進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖13SDS-PAGE結(jié)果顯示，EKH5-EKLm6在20。C酶切Trx-MBL-CLR，反應(yīng)20hr，在酶:底物=1:20000(m:m)即可酶切完全。實(shí)施例19EKH5-EKLm6的穩(wěn)定性檢測EKH5-EKLm6模擬在實(shí)際保存過程中可能遭遇的不利條件，而后檢測其酶切Trx-MBL-CLR的能力，以20嗎與l,28ngEKH5-EKLm6反應(yīng)，反應(yīng)休系為0.1MTris—HC1(pH8.0)，ImMCaCl"及0.1%Tween20，反應(yīng)休積20^iL，反應(yīng)條件20。Cx20hr。反應(yīng)產(chǎn)物利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。擬保存條件下留樣考察-2(TC，保存6個月；反復(fù)凍融-2(TC及37t;反復(fù)3次；高溫37。C放置l、3、5、7、10天。SDS-PAGE結(jié)果見圖14，結(jié)果顯示，EKH5-EKLm6在上述保存條件下，對酶切活性沒有顯著影響。序列表SEQUENCELISTING〈110〉上海張江生物技術(shù)有限公司〈120>重組牛腸激酶、其制備方法及應(yīng)用〈130〉CN0111370.3<150〉200710040551.0〈151〉2007-05-11〈150〉200710040552.5〈151〉2007-05-11〈歸16〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211〉705<212>腿〈213〉Unknown〈220〉〈223〉輕鏈突變體核苷酸序列〈400〉1attgtcggaggaagtgactcgcctggccttgggtcgUgctctgtatttc60gacgatca^c鄉(xiāng)tctgcggagcttctctggtg鄉(xiāng)agggattggctggtgtcggccgcc120cactgcgtgttatggagccgtctaagtggsaagcagtgctaggcctgcat180a_tggcatcaaatctgacttctcctcagataga^ctsggttgattgaccaaattgtcata240犯ccca^ctgaga^ga^caatgacattgccatgatgcettcttgaaatg300acacagattatatacagcctatttgtttaccagaagaaa^tcaagttttt360CCCCC3gg犯gaatttgttctattgctggctggggggcacttatatatcaaggttctact420gcagscgtactgc犯g肌gctgacgttccccttctatxaaatgaga犯tg1xaac6iacag480atgccagaacgtaacattecgtgtgtgcaggctatgaagc540gattcttgtc3gg鵬3ttC郷cggacc3ctcatgtgccc觀atggctc600ctggctggcgtg3CgtC3tttgg3CgtC朋tgtgcsctgcct朋tcgccc郷ggtgtet660gcccgggtccc犯ggttcaccaaagttttctacat705〈210〉2〈211〉235〈212〉PRT〈213〉unknown〈220><223>輕鏈突變體氨基酸序列〈400>2lieValGlyGlySerAspSerArgGluGlyAlaTrpProTrpValVal151015AlaLeuTyrPheAspAspGinGinValCysGlyAlaSerLeuValSer202530ArgAspTrpLeuValSerAlaAlaHisCysValTyrGlyArgAsnMet354045GluProSerLysTrpLysAlaValLeuGlyLeuHisMetAlaSerAsn505560LeuThrSerProGinlieGluThrArgLeulieAspGinlieVallie65707580AsnProHisTyrAsnLysArgArgLysAsnAsnAsplieAlaMetMet859095HisLeuGluMetLysValAsnTyrThrAspTyrlieGinProlieCys100105110LeuProGluGluAsnGinValPheProProGlyArglieCysSerlie115120125AlaGlyTrpGlyAlaLeulieTyrGinGlySerThrAlaAspValLeu130135140GinGluAlaAspValProLeuLeuSerAsnGluLysCysGinGinGin145150155160MetProGluArgAsnlieThrGluAsnMetValCysAlaGlyTyrGlu165170175AlaGlyGlyValAspSerCysGinGlyAspSerGlyGlyProLeuMet180185CysGinGluAsnAsnArgTrpLeuLeuAlaGlyVal195200ArgGinCysAlaLeuProAsnArgProGlyValTyr210215220ArgPheThrGluTrplieGinSerPheLeuHis225230235〈210〉3〈211〉855〈212〉DNA〈213>Unknown<220〉〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH1-EKLm6核苷酸序列<400>3CC3CCtg3ttc鄉(xiāng)gctgtgtgctgatgcttttattttgt60taaactgtccagatggctctgatgaagacaeitaa^cttgtgccacagct120ggcggtggaggctc鄉(xiāng)cggtgggggttcta^ttgtcgg已gg￡iagtg3CtCc卿g鄉(xiāng)ga180gcctggccttgggtcgttgctctgtatttcgacgatcaacaggtctgcggagcttctctg240gtgagcagggattggctggtgtcggccgcccactgcgtgtacggg卿犯tatgg郞ccg300tct3￡lgtgga犯gcsgtgctaggcctgcatatctgacttctcctcagata360gaaactaggttgattgaccaa^cccacactacaataaacg420CC3tg3tgC￡Ltcttg3幼tg480atttgtttacC3gaag犯aatcaagtttttcccccaggaagaatttgttctattgctggc540tggggggcacttatatatcaaggttctactgcagacgtsctgacgttccc600cttctatcaaaLtgcca_ga_￡LCgg肪aatatg660gtgtgtgc已ggctatgaagcgWtcttgtc郷鵬attc鄉(xiāng)cggacca720ctcatgtgccC3gStggCtCctggctggcgtgacgtcatttggacgtc幼780tgtgcactgcctaatcgcccaggggtgtatgcccgggtcccaaggttcac卿gtggsta840caaagttttc855190ThrSerPheGly205AlaArgValPro〈210〉4〈211〉285〈212〉PRT<213>Unknown〈220〉〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKHl-EKLm6氨基酸序列〈400〉4SerArgLeuCysAlaAspAlaLeuLysCyslieAlalieProPro1AspLeuAspAsnGlySer50ValVal65ValSerAspPheLys35lieCys20Thr5AspGlyGluLeuCysAlaThrValGlyGlyAlaLeuTyrArgAspAsnMetGluSerAsnVallie130MetMet145lieCysLeu115AsnPro100ThrTrp85SerPhe70LeuSer55AspAla40AspAsn25Gly10CysProAspGlyGlyGlyGlySerArgGluSer45AlaSer30Gly15AspGluGlyGlyTrpProTrpGly60AspGinGinValCysGlyAlaSer75ValSerAlaAlaHisCysValTyrlysTrpLysSerProGinProHisTyrHisLeuGluLeuProGlu165Met150GluAsn135Lyslie120LysAla105Glu90ValLeuGlyLeuThrArgLeuArgArgLyslie125AsnHis110AspGly95MetLeu80AlaGinlieAsplieAlaAsn140ValAsnTyrThrAspTyrlieGinAsnGinValPhe170155ProProGlyArglie175Pro160CysSerlieAlaGlyTrpGlyAlaLeulieTyrGinGlySerThrAlaA印180185190ValLeuGinGluAlaAspValProLeuLeuSerAsnGluLysCysGin195200205GinGinMetProGluArgAsnlieThrGluAsnMetValCysAlaGly210215220TyrGluAlaGlyGlyValAspSerCysGinGlyAspSerGlyGlyPro225230235240LeuMetCysGinGluAsnAsnArgTrpLeuLeuAlaGlyValThrSer245250255PheGlyArgGinCysAlaLeuProAsnArgProGlyValTyrAlaArg260265270ValProArgPheThrGluTrplieGinSerPheLeuHis275280285〈210>5〈211〉願〈212〉DNA〈213>Unknown<220〉〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH3-EKLm6基因序列〈400〉5tgtggagggcctcatgacctgtgggagccatcacgtctataaetcttcccei60aacagctacccta^txetggctttctgtatttggaatttaaatgcacaaaa120attcagctccatttgeicctggaaaatattgcagatgtsigt180getgatgattccttgttcttagctgtgtacac鄉(xiāng)ccctggtccagtaaac240gatgtgttctcaaccaccaaccgaatgactgtgctttttatC3Ctg3ta3tatgctggca300tttcactactggctatggcggtggaggctc鄉(xiāng)cggtggg360ggttxtattgtcgg鄉(xiāng)犯gtgactccagag肪gggigcctggccttgggtcgttgctctg420tatttcgacgctgcggagcttctctggtgagC3ggg3ttggctggtgtcg■gccgcccactgcgtgtacggg￡Lg￡L￡L￡Lt3tggagccgtctaagtggaaagcagtgctaggc540ctgcatatggcatxa^atctgacttctcctC3g3t3g333ctaggttgattgaccaaatt600taaacggagaacattgccatgatgcatctt660tg犯ctacaccagcctatttgttt3CC3g3720gtttttxcccca^ggaagaatttgttctattgctggctggggggcacttatataAcaaggt780tctactgcagacgtactgcaagaagctgacgttccccttc840caacag3tgccattacggaaMt3tggtgtgtgcaggctatg犯gcagg3900g鵬t卿ttcttgtc鄉(xiāng)gggattcaggcggaccactcatgtgcc肌ga960tggctcctggctggcgtgacgtcatttgga^cgtca^tgtgcactgcctaatcgcccaggg1020gtgtatgcccgggtcccaaggttcacagagtggatacaaagttttctacat1071〈210〉6〈211〉357〈212>PRT〈213>Unknown〈220〉〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH3-EKLra6氨基酸序列;<400>6CysGlyGlyProHisAspLeuT卬GluProAsnThrThrPheThrSer151015lieAsnPheProAsnSerTyrProAsnGinAlaPheCyslieTrpAsn202530LeuAsnAlaGinLysGlyLysAsnlieG丄nLeuHisPheGinGluPhe354045AspLeuGluAsnlieAlaAspValValGlulieArgAspGlyGluGly505560AspAspSerLeuPheLeuAlaValTyrThrGlyProGlyProValAsn65707580AspValPheSerThrThrAsnArgMetThrValLeuPhelieThrAsp859095AsnMetLeuAlaLysGinGlyPheLysAlaAsnPheThrThrGlyTyr100105110GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerlieValGlyGlySerAsp115120SerArgGluGlyAlaTrpProTrpVal130135GinGinValCysGlyAlaSerLeuVal145150AlaAlaHisCysValTyrGlyArgAsn165LeuHisMetAlaValLeuGly180LeulieAspGinGluThrArg195LysAsnAsnAspArgArg210AsnTyrThrAspTyr225ValPheProProAlaSer185lieVal200AlaMetlie215GinProlielie230ArglieCysSerlieTyrGinGly260AsnLeuLeuSer275AsnMetValCysThrGlu290CysGinGlyAspSer305TrpLeuLeuAlaGly245SerThrAlaAspVal265GluLysCysGinGin280GlyTyrAla295GlyGlyProLeu310ValThrSerPheAsnArgProGly340GinSerPheLeuHisGly325ValTyrAlaArgVal345125ValAlaLeuTyrPheAspAsp140SerArgAspTrpLeuValSer155160MetGluProSerLysTrpLys170175AsnLeuThrSerProGinlie190lieAsnProHisTyrAsnLys205MetHisLeuGluMetLysVal220CysLeuProGluGluAsnGin235240lieAlaGlyTrpGlyAlaLeu250255LeuGinGluAlaAspValPro270GinMetProGluArgAsnlie285GluAlaGlyGlyValAspSer300MetCysGinGluAsnAsnArg315320GlyArgGinCysAlaLeuPro330335ProArgPheThrGluTrplie350<210>7<211〉837〈212>腿〈213〉Unknown〈220〉〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH4-EKLm6基因序列<400〉7attttcagtgC鄉(xiāng)g3tgggga^tgt3ttccgctggtgaatctctgtgac60ggttttccacactgtaagg3tggctcagatgtggcggtgg鄉(xiāng)ctcaggc120ggtgggggttCt3ttgtCggtccagagaaggagcctggccttgggtcgU180gctctgtatttcgscgatcaacaggtctgcggagcttctctggtgagcagggattggctg240gtgtcggccgcccactgcgtgt3Cggg卿朋tatggagccgtct犯gtggaa昭cagtg300ctaggcctgcatatggcatcaaatctgacttctcctcagatagaaactaggttgattgac360ctacaataaatgccatgatg420catcttgaaatgaaagtgaactatttgttt480犯tca^gtttttcccccagg犯g認(rèn)tttgttctsttgctggctggggggc540caaggttctactgcagacgtactgcaagaagctgacgttccccttctatca肌tgagaaa600tgtca^c船ctggtgtgtgc3ggCt8tg33660gcaggaggggtsgattcttgtcagggggattc鄉(xiāng)cggaccactcatgtgcca^g犯a^c720肌ca^tggctcctggctggcgtgacgtC3tttggacgtc犯tgtgC3Ctgcct朋tcgc780ccaggggtgtatgcccgggtcccaaggttcetc卿gtggatacaaagttttctacat837〈210〉8<211>279〈212〉PRT〈213〉Unknown<220>〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH4-EKLm6氨基酸序列〈400〉8Val60SerArgAspLysGluAspAsnPheGinCysLysA印GlyGluCyslieProLeuVal151015AsnLeuCysAspGlyPheProHisCysLysAspGlySerAspGluAla202530HisCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerlieValGlyGly354045SerAspSerArgGluGlyAlaTrpProTrpValValAlaLeuTyrPhe5055AspAspGinGinValCysGlyAlaSerLeuVal657075CysValTyrGlyArgAsnMetGluPro90GlyLeuHisMetAlaSerAsnLeu105Leu工leAspGinlieVal120AsnAsnAsplieAlaMet135AspTyrlieGinProlie150155ProGlyArglieCysSerlieAlaGly170GlySerThrAlaAspValLeuGin185AsnGluLysCysGinGin200MetValCysAlaGlyTyr215AspSerGlyGlyProLeu230235ValSerAlaAlaHis85TrpLysAlaValLeu100GinlieGluThrArg115AsnLysArgArgLys130LysValAsnTyrThr145AsnGinValPhePro165AlaHeulieTyrGin180ValProLeuILeuSer195AsnlieThrGluAsn210AspSerCysGinGly225lieMet140CysAsn125HisTrpL>eu80SerLys95ThrSerPro110ProHisTyrLeuGluMetGinLeuProGluGlu160TrpGly175GluAlaAsp190MetProGluArg205AlaGlyGlyValGlu220MetCysGinGluAsn240AsnArgTrpLeuLeuAlaGyVaJ245LeuProAsnArgProGlyValTyr260TrplieGinSerPheLeuHis275〈210〉9〈211〉1008<212〉DNA〈213〉Unknown<220>〈223〉重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白EKH5-EKLm6基因序列〈400〉9cgtctcttcaa_tggC3Cgacggtttggtgc60tggcatgtagcctgtgccgag犯ctggacaacccagatctc觀atg3tgtgtgtc郷tg120ctgggactagggactggaaactcatccgtgccaaccttttc化ctgg鄉(xiāng)tggaccatat180taattggcagccgccaagccaacagtgctta240gaggattcactgattctgctacaatgtaactscggcggtgg郷ctc鄉(xiāng)cggtgggggt300tctsttgtcggsgg卿tga.CtCC3gag￡L￡Lggsgcctggccttgggtcgttgctctgtat360ttcgacgatca^csggtctgcggsgcttctCtggtg3gC3gggattggctggtgtcggcc420gcccactgcgtgtecgggagaa3tatggagccgtctaagtgg,gcagtgct郷cctg■catatggcatc￡iaatctg￡icttctcctcagggttg3Ug3ccaaattgtc540ataaacccacactacaataaaaca^tga^ttgccatgatgcatcttgaa600atggL犯gtgatt￡Lt3t3C￡Lgcctatttgtttaccagaag￡L660tttcccccagttctattgctggctggggggcacttatatatcaaggttct720actgcagacgt3CtgC犯g3agctgacgttccccttctat780cagatgccagatggtgtgtgcaggctatga3gC3gg鄉(xiāng)g840gtagattcttgtC鄉(xiāng)ggg3Ucaggcggaccactcatgtgcc犯ga^a3ca^c觀atgg900ctcctggctggcgtgacgtcatttggacgtC￡L￡ltgtgC￡LCtgcctaatcgccc鄉(xiāng)ggtg960tatgcccgggtcccaag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sSerlieAspValLeuCysGinGinGin160GluMetArgGlyArgGinCysAlaLeuProAsnArgProGlyValTyrAlaArgValPro210215220ArgPheThrGluTrplieGinSerPheLeuHis22523023權(quán)利要求1.重組牛腸激酶輕鏈突變體，其氨基酸序列為SEQIDNO13。全文摘要本發(fā)明公開了重組牛腸激酶輕鏈突變體和重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白，其中重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈突變體通過短肽相連接，本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述突變體和融合蛋白的氨基酸序列、其制備方法和其作為融合蛋白切割劑的用途。本發(fā)明公開的上述重組牛腸激酶輕鏈突變體和重組牛腸激酶重鏈結(jié)構(gòu)域-輕鏈突變體融合蛋白可以通過簡單的分離純化步驟得到，具有活性高的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12N9/64GK101624586SQ200910145250公開日2010年1月13日申請日期2008年5月6日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者盛侯,張大鵬,李博華,皓王,珉談,郭亞軍,錢衛(wèi)珠申請人:上海張江生物技術(shù)有限公司;上海中信國健藥業(yè)有限公司