專(zhuān)利名稱(chēng)：分離的醇脫氫酶酶類(lèi)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案一般地涉及分離的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸，所述多 肽具有脫氫酶活性，例如醇脫氫酶(ADH)活性、糖醛酸，4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸 (DEHU) ((45，5幻-4，5-二羥基-2，6-二氧代己酸)氫化酶活性、2-酮基-3-脫氧-D-葡萄 糖酸脫氫酶活性、D-甘露糖醛酸氫化酶活性和/或D-甘露糖酸脫氫酶活性，還涉及使用包 含這些多核苷酸和多肽的重組微生物、微生物系統(tǒng)和化學(xué)系統(tǒng)，將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大量生產(chǎn) 型化學(xué)品，例如生物燃料。相關(guān)技術(shù)用于將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的現(xiàn)有方法集中在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的使用，并且 存在很多與使用本工藝相關(guān)的問(wèn)題。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的大規(guī)模培育需要大量的耕地，這 只有通過(guò)用能源作物生產(chǎn)替代糧食作物生產(chǎn)、采伐森林和再耕種目前未經(jīng)耕作的土地來(lái)實(shí) 現(xiàn)。其他的問(wèn)題包括水的可利用性和質(zhì)量的降低以及殺蟲(chóng)劑和化肥的使用的增加。由于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)堅(jiān)實(shí)的機(jī)械強(qiáng)度和復(fù)雜的化學(xué)組分，使用生物系統(tǒng)對(duì)其進(jìn) 行降解是非常困難的挑戰(zhàn)。將木質(zhì)纖維素完全轉(zhuǎn)化為單糖需要約三十種不同的酶。該復(fù)雜 的方式的僅有的可用的替代方式需要大量的熱、壓力和強(qiáng)酸。因此，本領(lǐng)域需要用于將生物 質(zhì)轉(zhuǎn)化為作為生物燃料或生物汽油使用的碳?xì)浠衔锏慕?jīng)濟(jì)的和技術(shù)上簡(jiǎn)單的工藝。作為該工藝中的一個(gè)步驟，具有醇脫氫酶活性的酶類(lèi)在將來(lái)自生物質(zhì)的多糖轉(zhuǎn)化 為寡糖或單糖中是有用的，然后所述寡糖或單糖可以轉(zhuǎn)化為各種生物燃料。具有諸如糖醛 酸、4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性的醇脫氫酶 活性的酶類(lèi)先前已經(jīng)從藻酸鹽代謝細(xì)菌中純化，但是編碼DEHU或D-甘露糖醛酸氫化酶的 基因尚未被克隆和表征。本申請(qǐng)?zhí)峁┝司幋a具有DEHU和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性的 醇脫氫酶的基因，并且也提供了在生產(chǎn)例如生物燃料的大量生產(chǎn)型化學(xué)品中與它們的使用 相關(guān)的方法。概述本發(fā)明的實(shí)施方案包括選自以下的分離的多核苷酸，及其片段或變體(a)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80%同一的核苷酸序列；(b)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90%同一的核苷酸序列；(c)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列；(d)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97%同一的核苷酸序列；(e)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ I D NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99%同一的核苷酸序列；和(f)分離的多核苷酸，其包含 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸編碼具有脫氫酶活性的多肽。在其他實(shí)施方案中，所述多 肽具有醇脫氫酶活性。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有DEHU氫化酶活性和/或D-甘露 糖醛酸氫化酶活性。另外的實(shí)施方案包括用于將多糖轉(zhuǎn)化為適合的單糖或寡糖的方法，所述方法包含 使多糖與微生物系統(tǒng)接觸，其中所述微生物系統(tǒng)包含重組微生物，并且其中所述重組微生 物包含本公開(kāi)內(nèi)容的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有氫化酶活性的多肽，所述氫化 酶活性例如醇脫氫酶活性、DEHU氫化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性。另外的實(shí)施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸還原(氫化)的方法，所述方法包含 使D-甘露糖醛酸與微生物系統(tǒng)接觸，其中所述微生物系統(tǒng)包含微生物，并且其中所述微生 物包含本公開(kāi)內(nèi)容的多核苷酸。另外的實(shí)施方案包括用于催化DEHU還原(氫化)的方法，所述方法包含使DEHU 與微生物系統(tǒng)接觸，其中所述微生物系統(tǒng)包含微生物，并且其中所述微生物包含本公開(kāi)內(nèi) 容的多核苷酸。另外的實(shí)施方案包括包含本公開(kāi)內(nèi)容的分離的多核苷酸的載體，并且還可以包括 下述載體，其中所述分離的多核苷酸可操作地連接在表達(dá)調(diào)控區(qū)，并且其中所述多核苷酸 編碼具有氫化酶活性的多肽，所述氫化酶活性例如醇脫氫酶活性、DEHU氫化酶活性和/或 D-甘露糖醛酸氫化酶活性。另外的實(shí)施方案包括重組微生物或包含重組微生物的微生物系統(tǒng)，其中所述重組 微生物包含如本文所述的多核苷酸或多肽。在某些實(shí)施方案中，所述重組微生物選自醋 USlff (Acetobacter aceti) ,^i^iffM (Achromobacter) >Bf SIS' (Acidiphilium) >^ 云力ff (Acinetobacter) ^^iMMM (Actinomadura)、 字云力方(Actinoplanes) > 嗜熱古生菌(Aeropyrum pernix)、土壤桿菌(Agrobacterium)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)、 菠蘿(Ananas comosus) (M)、節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter)、黑曲霉(Aspargillusniger)、米 曲 β (Aspergillus oryze) >(Aspergillus melleus)、曲 β (Aspergllus pulverulentus)、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)、醬油曲霉(Aspergillus sojea)、宇 佐美曲霉(Aspergillus usamii)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽胞桿菌活菌(Bacillus lichiformis)、浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、洋 蔥布克氏菌(Burkholderia c印acia)、柱狀假絲酵母(Cmdida cylindracea)、皺褶假絲 酵母(Candida rugosa)、番木瓜(Carica papaya) (L)、纖維菌(Cellulosimicrobium)、 頭抱霉(Cephalosporium)、毛殼菌(Chaetomiumerraticum)、細(xì) HI3 毛殼菌(Chaetomium gracile)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、丙酮 丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)、 (# M M ) # ^ ff S" (Corynebacterium(glutamicum)) ^ efficiens _ # ff 胃 (Corynebacteriumefficiens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸球菌(Enterococcus)、 菊歐文氏菌(Erwina chrysanthemi)、葡糖桿菌(Gliconobacter)、葡糖醋桿菌 (Gluconacetobacter)、嗜鹽古菌(Haloarcula)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、 Humicola nsolens、西唐北里孢菌(Kitasatospora setae)、克雷桕氏桿菌(Klebsiella)、 產(chǎn)酸克雷桕氏桿菌(Klebsiella oxytoca)、克魯維斯酵母屬(Kluyveromyces)、脆壁克 魯維斯酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyces lactis)、 考克氏菌(Kocuria)、乳酸乳桿菌(Lactlactis)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、發(fā)酵 乳酸桿菌(Lactobacillusfermentum)、清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sake)、乳球菌 屬(Lactococcus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、甲 基孢囊菌屬(methylocysis)、西西里甲烷葉菌(methanolobus siciliae)、嗜器官產(chǎn)甲 焼菌(Methanogenium organophilum)、布氏甲焼桿菌(Methanobacteriumbryantii)、蛾 微桿菌(Microbacterium imperiale)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、小月 菌(Microlunatus)、爪口圭毛霉(Mucor javanicus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、漆斑 M (Myrothecium)、石宵(Nitrobacter) ^^it^MM (Nitrosomonas) λ K (Nocardia)、番木瓜(Papayacarica)、小球菌(Pediococcus)、嗜鹽片球菌(Pediococcus halophilus)、青霉(Penicillium)、沙門(mén)桕干酪青霉(Penicillium camemberti)、桔青霉 (Penicillium citrinum)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、婁地青霉(Penicillium roqueforti)、薄青霉(Penicillium lilactinum)、多色青霉(Penicillium multicolor)、 異養(yǎng)石肖化~好氧反石肖化菌(Paracoccuspantotrophus)、丙酸桿菌(Propionibacterium)、 假單胞菌(Pseudomonas)、熒光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、脫氮假單胞 菌(Pseudomonasdenitrificans)、熱球菌(Pyrococcus)、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱球菌(Pyrococcus horikoshii)、根瘤菌(Rhizobium)、米赫 根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus Lindt)、根霉 (Rhizopus)、戴爾根霉(Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、雪白根 霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、 紅球菌(Rhodococcus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、核盤(pán)菌(Sclerotina libertina)、多食鞘氨酉享?xiàng)U菌(Sphingobacteriummultivorum)、鞘氨酉享?xiàng)U菌 (Sphingobium)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、鏈球菌(Streptococcus)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus Y-1)、鏈霉菌(Streptomyces)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)、鼠鏈霉菌(Streptomyces murinus)、 誘赤鏈霉菌(Streptomyces rubiginosus)、紫紅鏈霉菌(Streptomyces violaceoruber)、 輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium mobaraense)、四聯(lián)球菌(Tetragenococcus)、嗜熱菌(Thermus)、泛養(yǎng)硫球菌(Thiosphaera pantotropha)、栓菌(Trametes)、木霉 (Trichoderma)、長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichoderma viride)、青霉毛抱子菌(Trichosporon penicillatum)、 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黃桿菌(Xmthomonas)、酵母(yeast)、魯氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii)、酵單胞菌(Zymomonas)禾口運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonus mobilis)。另外的實(shí)施方案包括選自以下的分離的多肽，及其變體或片段(a)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；(b)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列； (c)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列；(d)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97%同一的氨基酸序列；(e)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99%同一的氨基酸序列；和(f)分離的多肽，其包含 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列，其中所述分離的多肽具有氫化酶活性，例如醇脫氫酶活性、DEHU氫化酶活性和/ 或D-甘露糖醛酸氫化酶活性。另外的實(shí)施方案包括用于將多糖轉(zhuǎn)化為適合的單糖或寡糖的方法，所述方法包含 使多糖與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含按照本公開(kāi)內(nèi)容的ADH多核苷酸或多 肽。另外的實(shí)施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸還原(氫化)的方法，所述方法包含 使D-甘露糖醛酸與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含按照本公開(kāi)內(nèi)容的ADH多核 苷酸或多肽。另外的實(shí)施方案包括用于催化糖醛酸，4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)還 原(氫化)的方法，所述方法包含使DEHU與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含按 照本公開(kāi)內(nèi)容的ADH多核苷酸或多肽。另外的實(shí)施方案包括用于將多糖轉(zhuǎn)化為適合的單糖或寡糖的微生物系統(tǒng)，其中所 述微生物系統(tǒng)包含重組微生物，并且其中所述重組微生物包含選自以下的分離的多核苷 酸(a)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80%同一的核苷酸序列；(b)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90%同一的核苷酸序列；(c)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列；
(d)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97%同一的核苷酸序列；(e)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99%同一的核苷酸序列；和(f)分離的多核苷酸，其包含 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、
27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列。另外的實(shí)施方案包括用于將多糖轉(zhuǎn)化為適合的單糖或寡糖的微生物系統(tǒng)，其中所 述微生物系統(tǒng)包含重組微生物，并且其中所述重組微生物包含選自以下的分離的多肽(a)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、2 0、22、24、26、
28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；(b)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；(c)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列；(d)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97%同一的氨基酸序列；(e)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99%同一的氨基酸序列；和(f)分離的多肽，其包含 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，如本文公開(kāi)的分離的多核苷酸可以編碼多肽，所述多肽包 含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH 的結(jié)合基序中的至少一個(gè)。其他實(shí)施方案可以包括分離的ADH多肽或者其片段、變體或 衍生物，其中所述多肽包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(NADP+)或NADPH結(jié)合基序中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，NAD+、NADH、NADP+ 或 NADPH 結(jié)合基序選自 Y-X-G-G-X-Y (SEQ IDNO 67)、Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO 68)、 Y-X-X-X-G-G-X-Y (SEQ IDNO 69)、Y-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO 70)、Y-X-X-G-G—X—X—Y (SEQ IDNO 71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO 72),Y-X-G-X-Y(SEQ IDNO 73)、Y-X-X-G-X_Y(SEQ ID NO 74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 75)和 Υ-Χ-Χ-Χ-X-G-X—Y(SEQ ID NO 76)；其中 Y 獨(dú)立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X獨(dú)立地選自基因編碼的 氨基酸。某些實(shí)施方案涉及將多糖轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，所述方法包含將多糖與重組微生物 接觸，其中所述重組微生物能夠在作為唯一碳源的多糖上生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，所述重 組微生物包含至少一種編碼至少一種丙酮酸脫羧酶的多核苷酸和至少一種編碼醇脫氫酶 的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述多糖是藻酸鹽。在某些實(shí)施方案中，所述重組微生物 包含一個(gè)或多個(gè)含有燦爛弧菌(Vibro splendidus)V12B01_24189和V12B01_24249之間 的基因組區(qū)的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，至少一種丙酮酸脫羧酶來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)。在某些實(shí)施方案中，至少一種醇脫氫酶來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在某 些實(shí)施方案中，重組微生物是大腸桿菌。
附圖簡(jiǎn)要描述

圖1顯示按照實(shí)施例2實(shí)施的分離的醇脫氫酶(ADH)酶利用DEHU作為底物的 NADPH消耗。圖2顯示按照實(shí)施例2實(shí)施的分離的ADH酶利用D-甘露糖醛酸作為底物的NADPH消耗。圖3顯示ADHl的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和氨基酸序列(SEQ IDNO 2)圖4顯示ADH2的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)和氨基酸序列(SEQ IDNO 4)圖5顯示ADH3的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)和氨基酸序列(SEQ IDNO 6) 圖6顯示ADH4的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)和氨基酸序列(SEQ IDNO 8)圖7顯示ADH5的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)和氨基酸序列(SEQ IDNO 10)圖8顯示ADH6的核苷酸序列(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQ IDNO 12)圖9顯示ADH7的核苷酸序列(SEQ ID NO 13)和氨基酸序列(SEQ IDNO 14)圖10顯示ADH8的核苷酸序列(SEQ ID NO 15)和氨基酸序列(SEQID NO 16)圖11顯示ADH9的核苷酸序列(SEQ ID NO 17)和氨基酸序列(SEQID NO 18)圖12顯示ADHlO的核苷酸序列(SEQ ID NO 19)和氨基酸序列(SEQID NO 20)圖13顯示ADHll的核苷酸序列(SEQ ID NO 21)和氨基酸序列(SEQID NO 22)圖14顯示ADH12的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)和氨基酸序列(SEQID NO 24)。圖15顯示ADH13的核苷酸序列(SEQ ID NO 25)和氨基酸序列(SEQID NO 26)圖16顯示ADH14的核苷酸序列(SEQ ID NO 27)和氨基酸序列(SEQID NO 28)圖17顯示ADH15的核苷酸序列(SEQ ID NO 29)和氨基酸序列(SEQID NO 30)圖18顯示ADH16的核苷酸序列(SEQ ID NO 31)和氨基酸序列(SEQID NO 32)圖19顯示ADH17的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)和氨基酸序列(SEQID NO 34)圖20顯示ADH18的核苷酸序列(SEQ ID NO 35)和氨基酸序列(SEQID NO 36)圖21顯示ADH19的核苷酸序列(SEQ ID NO 37)和氨基酸序列(SEQID NO 38)圖22顯示如實(shí)施例3所描述的改造的或重組的大腸桿菌在作為唯一碳源的藻酸 鹽上生長(zhǎng)的結(jié)果(見(jiàn)實(shí)線圓圈)，。根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞提供 陽(yáng)性對(duì)照(見(jiàn)陰影線圓圈)。緊靠根瘤土壤桿菌陽(yáng)性對(duì)照左邊的孔含有DHlOB大腸桿菌細(xì) 胞，DHlOB大腸桿菌細(xì)胞提供陰性對(duì)照。圖23顯示如實(shí)施例4所描述的由在作為唯一碳源的藻酸鹽上生長(zhǎng)的大腸桿菌產(chǎn) 生的乙醇。大腸桿菌用pBBRPdc-AdhA/B或pBBRPdc-AdhA/B+1. 5F0S轉(zhuǎn)化，并且允許在含有
藻酸鹽的m9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。圖24顯示ADHll和ADH20的DEHU氫化酶活性。ADH20是從燦爛弧菌12B01中分 離的推定的羥基丙二酸半醛還原酶(TSAR)基因(參見(jiàn)SEQ ID NO :78氨基酸序列)，并且 ADH20展示出顯著的DEHU氫化作用活性，特別是與NADH。詳細(xì)描述定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與在本發(fā)明所屬領(lǐng)域具有普通技 術(shù)的人員所通常理解的具有相同意義。盡管任何與本文所述相近或等同的方法和材料可以 用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但是描述的是優(yōu)選的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，以下術(shù)語(yǔ)定義如下。本文使用的冠詞“一個(gè)(a)”和“一個(gè)(an)”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè)) 該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“一個(gè)元件(an element)”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件?！凹s(about)，，表示與參照數(shù)量(quantity)、水平、值、數(shù)目(number)、頻率、百分 比、尺度、尺寸、量(amount)、重量或長(zhǎng)度相比改變了 30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或
的數(shù)量、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或長(zhǎng)度。“生物質(zhì)(biomass)”的實(shí)例包括水生或海生的生物質(zhì)、基于水果的生物質(zhì)如水果 廢料和基于蔬菜的生物質(zhì)如蔬菜廢料等。水生或海生的生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于海藻、 巨藻、淡水海草、水藻和海生的顯微植物群、微藻、海草等。在某些方面，生物質(zhì)不包括碳的 化石化來(lái)源，例如通常發(fā)現(xiàn)于地殼頂層內(nèi)的碳?xì)浠衔?例如天然氣、幾乎純碳組成的非 揮發(fā)性材料、如無(wú)煙煤等)。 “水生生物質(zhì)(aquatic biomass) ”或“海生生物質(zhì)(marine biomass) ”的實(shí)例包 括但不限于海藻、巨藻、馬尾藻類(lèi)海草、淡水海草、水藻、海生顯微植物群、微藻和海草等。水果和/或蔬菜生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于任何果膠來(lái)源，例如植物外皮和渣， 包括柑橘、橙、葡萄柚、西紅柿、馬鈴薯、葡萄、芒果、醋栗、胡蘿卜、糖用甜菜和蘋(píng)果以及其 他。生物質(zhì)的多糖、寡糖、單糖或其他糖類(lèi)成分的實(shí)例包括但不限于藻酸鹽、瓊脂、角 叉膠、巖藻依聚糖、果膠、葡萄糖酸、甘露糖醛酸、甘露醇、來(lái)蘇糖、纖維素、半纖維素、甘油、 木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯膠素、阿拉伯糖、葡糖醛 酸、半乳糖醛酸(包括二半乳糖醛酸和三半乳糖醛酸)、鼠李糖等。藻酸鹽衍生的多糖的一些實(shí)例包括飽和多糖，例如β -D-甘露糖醛酸、α -L-葡 萄糖醛酸、二藻酸鹽(dialginate)、三藻酸鹽(trialginate)、五藻酸鹽(pentalginate)、 六藻酸鹽(hexalginate)、七藻酸鹽(h印talginate)、八藻酸鹽(octalginate)、九藻酸
鹽(nonalginate)、十藻酸鹽(decalginate)、^--藻酸鹽(undecalginate)、十 二藻酸
鹽(dodecalginate)和多聚藻酸鹽，以及不飽和多糖例如4_脫氧-L-赤_5_己酮糖糖醛 酸、4- (4-脫氧-β -D-mann-4-enuronosyl) _D_甘露糖醛酸或L-古羅糖醛酸、4- (4-脫 氧- β -D-mann-4-enuronosyl) - 二藻酸鹽、4-(4-脫氧- β -D-mann-4-enuronosyl)-三 藻酸鹽、4-(4_ 脫氧-0-D-mann-4-enuronosyl)-四藻酸鹽、4_(4_ 脫 氧- β -D-mann-4-enuronosyl)-五藻酸鹽、4-(4-脫氧- β -D-mann-4-enuronosyl)-六 藻酸鹽、4-(4_ 脫氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-七藻酸鹽、4_(4_ 脫 氧- β -D-mann-4-enuronosyl)-八藻酸鹽、4-(4-脫氧- β -D-mann-4-enuronosyl)-九 藻酸鹽、4-(4-脫氧-0-D-mann-4-enuronosyl)-十一藻酸鹽和 4-(4-脫 氧-β -D-mann-4-enuronosy 1)-十二藻酸鹽。果膠衍生的多糖的一些實(shí)例包括飽和多糖，例如半乳糖醛酸、二半 乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、四半乳糖醛酸、五半乳糖醛酸、六半乳糖醛酸、七 半乳糖醛酸、八半乳糖醛酸、九半乳糖醛酸、十半乳糖醛酸、十二半乳糖醛 酸、多聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸，以及飽和多糖，例如4-脫氧-L-蘇 式-5-己酮糖糖醛酸、4-(4_ 脫氧-a-D-gluc-4-enuronosyl)-D-半 乳糖酸酸、4-(4_ 脫氧一α -D-gluc-4-enuronosyl)-D- 二 半乳糖醛酸、4-(4-脫氧-α -D-gluc-4-enuronosy 1)-D-三半乳 糖醛酸、4-(4_ 脫氧-α -D-gluc-4-enuronosyl)-D-四半乳糖 醛酸、4-(4_ 脫氧-α -D-gluc-4-enuronosyl)-D-五半乳糖醛 酸、4-(4_ 脫氧-α -D-gluc-4-enuronosy 1)-D-六半乳糖醛 酸、4-(4_ 脫氧-α -D-gluc-4-enuronosyl)-D-七半乳糖醛酸、 4_ (4-脫氧-a-D-gluc-4-enuronosyl)-D-八半乳糖醛酸、4_(4_ 脫 氧-α -D-gluc-4-enuronosy1)-D-九半乳糖醛酸、4_(4_ 脫 氧-α -D-gluc-4-enuronosyl)-D-十半乳糖 Sl 酸禾口 4-(4-脫 氧-α -D-gluc-4-enuronosyl) -D-十二半乳糖醛酸。這些多糖或寡糖成分可以通過(guò)本文所述的微生物轉(zhuǎn)化為“適合的單糖”或其他“適 合的糖類(lèi)”，例如“適合的寡糖”，所述微生物能夠在作為碳源(例如唯一的碳源)的這些多 糖或其他糖類(lèi)組分上生長(zhǎng)。“單糖”、“適合的單糖”或“適合的糖類(lèi)”通常指由在作為碳源或唯一碳源的果膠、 藻酸鹽或其他糖類(lèi)(例如半乳糖醛酸、纖維素、半纖維素等)上生長(zhǎng)的重組微生物產(chǎn)生的 任何糖類(lèi)，還通常指可以用來(lái)在本發(fā)明的生物燃料生物合成途徑中產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏娜魏?糖類(lèi)，所述碳?xì)浠衔锢缟锶剂匣蛏锲汀＿m合的單糖或寡糖的實(shí)例包括但不限于 2-酮基-3-脫氧D-葡萄糖酸(KDG)、D-甘露醇、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露醇、來(lái)蘇糖、甘 油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸和鼠李糖等。如 本文所提示，本文使用的“適合的單糖”或“適合的糖類(lèi)”可以由本發(fā)明的改造的或重組的 微生物產(chǎn)生，或者從商業(yè)上可利用的來(lái)源中獲得。本文使用的敘述“大量生產(chǎn)型化學(xué)品(commodity chemical) ”包括可以直接產(chǎn)生 或作為本文提供的方法的副產(chǎn)品產(chǎn)生的任何可供出售的或可銷(xiāo)售的化學(xué)品，包括生物燃料 和/或生物汽油。“大量生產(chǎn)型化學(xué)品”的一般實(shí)例包括但不限于，生物燃料、礦產(chǎn)品、聚合 物前體、脂肪醇、表面活性劑、增塑劑和溶劑。本文使用的敘述“生物燃料(biofuels)”包括 至少部分來(lái)自例如重組微生物的生物來(lái)源的固體、液體或氣體燃料。大量生產(chǎn)型化學(xué)品的實(shí)例包括但不限于甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、正丙烷、
1-丙烯、1-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸酯、正丁烷、1-丁烯、1-丁醇、正丁醛、丁酸乙酯、異丁 醛、異丁醇、2-甲基正丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基正丁醛、3-甲基丁醇、2- 丁烯、2- 丁醇、
2-丁酮、2，3- 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2，3- 丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯基乙醇、苯基乙 醛、1-苯基丁烷、4-苯基-1- 丁烯、4-苯基-2- 丁烯、1-苯基-2- 丁烯、1-苯基-2- 丁醇、 4-苯基-2- 丁醇、1-苯基-2- 丁酮、4-苯基-2- 丁酮、1-苯基-2，3- 丁二醇、1_苯基_3_羥 基-2- 丁酮、4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、1-苯基-2，3- 丁二酮、正戊烷、乙基苯酚、乙烯 基苯酚、2-(4_羥苯基)乙醇、4-羥苯基乙醛、1-(4_羥苯基)丁烷、4-(4_羥苯基)-1_ 丁 烯、4-(4-羥苯基)-2-丁烯、1-(4-羥苯基)-1-丁烯、1-(4-羥苯基)-2-丁醇、4-(4-羥苯 基)-2- 丁醇、1- (4-羥苯基)-2- 丁酮、4- (4-羥苯基)-2- 丁酮、1- (4-羥苯基)-2，3- 丁二 醇、1- (4-羥苯基)-3-羥基-2- 丁酮、4- (4-羥苯基)-3-羥基-2- 丁酮、1_ (4-羥苯基)-2，
3-丁酮二酮、吲哚基乙烷、吲哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、η-戊烷，1-戊烯、1-戊醇、戊 醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3_戊二 醇、2-羥基-3-戊酮、3-羥基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲 基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羥基-3-戊酮、4-甲基-3-羥基-2-戊酮、 4-甲基_2，3-戊二酮、1-苯基戊烷、1-苯基-1-戊烯、1-苯基-2-戊烯、1-苯基-3-戊烯、 1-苯基-2-戊醇、1-苯基-3-戊醇、1-苯基-2-戊酮、1-苯基-3-戊酮、1-苯基_2，3-戊 二醇、1-苯基-2-羥基-3-戊酮、1-苯基-3-羥基-2-戊酮、1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲 基-1-苯基戊烷、4-甲基-1-苯基-1-戊烯、4-甲基-1-苯基-2-戊烯、4-甲基-1-苯 基-3-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊醇、4-甲基-1-苯基-2-戊醇、4-甲基-1-苯基-3-戊 酮、4-甲基-1-苯基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-戊 二酮、4-甲基-1-苯基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-羥基-3-戊酮、1_(4_羥 苯基)戊烷、1-(4_羥苯基)-1_戊烯、1-(4_羥苯基)-2_戊烯、1-(4_羥苯基)-3_戊烯、 1-(4_羥苯基)-2_戊醇、1-(4_羥苯基)-3_戊醇、1-(4_羥苯基)-2_戊酮、1-(4_羥苯 基)-3_戊酮、1-(4_羥苯基)-2，3_戊二醇、1-(4_羥苯基)-2_羥基-3-戊酮、1-(4_羥 苯基)-3_羥基-2-戊酮、1-(4_羥苯基)-2，3_戊二酮、4-甲基-l-(4-羥苯基)戊烷、 4-甲基-l-(4-羥苯基)-2_戊烯、4-甲基-l-(4-羥苯基)-3_戊烯、4-甲基-1-(4_羥苯 基)-1_戊烯、4-甲基-l-(4-羥苯基)-3_戊醇、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2_戊醇、4-甲 基-1- (4-羥苯基)-3-戊酮、4-甲基-1- (4-羥苯基)-2-戊酮、4-甲基-1- (4-羥苯基)-2， 3-戊二醇、4-甲基-1- (4-羥苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1- (4-羥苯基)-3-羥基-2-戊 酮、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2_羥基-3-戊酮、1-吲哚-3-戊烷、1-(吲哚-3)-l-戊烯、 1-(吲哚_3) -2-戊烯、1-(吲哚-3) -3-戊烯、1-(吲哚-3) -2-戊醇、1_ (吲哚_3) -3-戊醇、 1-(吲哚-3) -2-戊酮、1-(吲哚-3) -3-戊酮、1-(吲哚-3) -2，3-戊二醇、1_ (吲哚-3) -2-羥 基-3-戊酮、1-(吲哚_3) -3-羥基-2-戊酮、1-(吲哚-3) -2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲 哚-3_)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基-1-(吲 哚-3)-1-戊烯、4-甲基_2-(吲哚_3)-3-戊醇、4-甲基-1-(吲哚_3)-2-戊醇、4-甲 基-1-(吲哚_3)-3-戊酮、4-甲基-l-( B引哚-3)-2-戊酮、4-甲基_1_( B引哚_3)-2，3_戊 二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羥基-2-戊酮、4-甲 基-1-(吲哚-3)-2-羥基-3-戊酮、正己烷、1-己烯、1-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己 烯、2-己醇、3-己醇、2-己酮、3-己酮、2，3_己二醇、2，3_己二酮、3，4_己二醇、3 ，4_己二 酮、2-羥基-3-己酮、3-羥基-2-己酮、3-羥基-4-己酮、4-羥基-3-己酮、2-甲基己烷、 3-甲基己燒、2-甲基-2-己烯、2-甲基-3-己烯、5-甲基-1-己烯、5-甲基-2-己烯、4-甲 基-1-己烯、4-甲基-2-己烯、3-甲基-3-己烯、3-甲基-2-己烯、3-甲基-1-己烯、2-甲 基-3-己醇、5-甲基-2-己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲 基-3-己酮、2-甲基-3，4-己二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基_2，3_己二醇、5-甲基-2，
3-己二酮、4-甲基-2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-羥基-4-己酮、2-甲 基-4-羥基-3-己酮、5-甲基-2-羥基-3-己酮、5-甲基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-2-羥 基-3-己酮、4-甲基-3-羥基-2-己酮、2，5- 二甲基己烷、2，5- 二甲基-2-己烯、2，5- 二甲 基-3-己烯、2，5-二甲基-3-己醇、2，5-二甲基-3-己酮、2，5-二甲基-3，4-己二醇、2，5-二 甲基-3，4-己二酮、2，5-二甲基-3-羥基-4-己酮、5-甲基-1-苯基己烷、4-甲基-1-苯 基己烷、5-甲基-1-苯基-1-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己烯、5-甲基-1-苯基-3-己烯、
4-甲基-1-苯基-1-己烯、4-甲基-1-苯基-2-己烯、4-甲基-1-苯基-3-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己醇、5-甲基-1-苯基-3-己醇、4-甲基-1-苯基-2-己醇、4-甲基-1-苯 基-3-己醇、5-甲基-1-苯基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-2-己 酮、4-甲基-1-苯基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-己二 醇、5-甲基-1-苯基-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-2-羥基-3-己酮、4-甲基-1-苯 基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-2-羥基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、
4-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥苯基)己烷、5-甲基-1- (4-羥苯基)-1-己 烯、5-甲基-l-(4-羥苯基)-2_己烯、5-甲基-l-(4-羥苯基)-3_己烯、4-甲基_1-(4_羥 苯基)-1_己烯、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2_己烯、4-甲基-l-(4-羥苯基)-3_己烯、
5-甲基-l-(4-羥苯基)-2_己醇、5-甲基-l-(4-羥苯基)-3_己醇、4-甲基_1-(4_羥 苯基)-2_己醇、4-甲基-l-(4-羥苯基)-3_己醇、5-甲基-l-(4-羥苯基)-2_己酮、 5-甲基-l-(4-羥苯基)-3_己酮、4-甲基-1-(4-羥苯基)-2-己酮、4-甲基-1-(4_羥苯 基)-3_己酮、5-甲基-l-(4-羥苯基)-2，3_己二醇、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2，3_己二 醇、5-甲基-l-(4-羥苯基)-3_羥基-2-己酮、5-甲基-l-(4-羥苯基)-2_羥基-3-己 酮、4-甲基-l-(4-羥苯基)-3_羥基-2-己酮、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2_羥基-3-己 酮、5-甲基-l-(4-羥苯基)-2，3_己二酮、4-甲基-l-(4-羥苯基)-2，3_己二酮、4-甲 基-1-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3) -2-己烯、5-甲 基-1-(吲哚-3)-3_己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-l-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2_己烯、 4-甲基-1-(吲哚-3) -3-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3) -2-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3) -3-己 醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基+(吲 哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚_3)-2_己酮、4-甲 基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基(吲哚_3)-2， 3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3) -3-羥基-2- 己酮、5-甲基-1-(吲哚-3) -2-羥基-3-己 酮、4-甲基-1-(吲哚_3)-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚_3)-2-羥基-3-己酮、5-甲 基-1-(吲哚-3) -2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3) -2，3-己二酮、正庚烷、1_庚烯、1_庚 醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3-庚 二醇、2，3_庚二酮、3，4_庚二醇、3，4_庚二酮、2-羥基-3-庚酮、3-羥基-2-庚酮、3-羥 基-4-庚酮、4-羥基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚 烯、2-甲基-3-庚烯、2-甲基-2-庚烯、5-甲基-2-庚烯、5-甲基-3-庚烯、3-甲基-3-庚 烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚 醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚 酮、2-甲基_3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基_3，4-庚二醇、6-甲基_3，4_庚二 酮、5-甲基_3，4-庚二醇、5-甲基_3，4-庚二酮、2-甲基-3-羥基_4_庚酮、2-甲基_4_羥 基-3-庚酮、6-甲基-3-羥基-4-庚酮、6-甲基-4-羥基-3-庚酮、5-甲基-3-羥基-4-庚 酮、5-甲基-4-羥基-3-庚酮、2，6_ 二甲基庚烷、2，5- 二甲基庚烷、2，6_ 二甲基-2-庚烯、 2，6- 二甲基-3-庚烯、2，5- 二甲基-2-庚烯、2，5- 二甲基-3-庚烯、3，6- 二甲基-3-庚烯、 2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、 2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二 甲基_3，4-庚二酮、2，6- 二甲基-3-羥基-4-庚酮、2，6- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、2，5- 二 甲基-3-羥基-4-庚酮、2，5- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、正辛烷、1-辛烯、2-辛烯、1_辛醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羥基-5-辛酮、 2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、3-甲 基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、6-甲 基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、2-甲 基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、2-甲 基-4-羥基-5-辛酮、2-甲基-5-羥基-4-辛酮、3-甲基-4-羥基-5-辛酮、3-甲基-5-羥 基-4-辛酮、2，7_ 二甲基辛烷、2，7_ 二甲基-3-辛烯、2，7_ 二甲基-4-辛烯、2，7_ 二甲 基-4-辛醇、2，7- 二甲基-4-辛酮、2，7- 二甲基-4，5-辛二醇、2、7_ 二甲基-4，5-辛二酮、 2，7-二甲基-4-羥基-5-辛酮、2，6-二甲基辛烷、2，6-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛 烯、3，7-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛醇、3，7-二甲基-4-辛醇、2，6-二甲基-4-辛 酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲 基-4-羥基-5-辛酮、2，6- 二甲基-5-羥基-4-辛酮、3，6- 二甲基辛烷、3，6- 二甲基-3-辛 烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，6-二甲基-4，5-辛 二醇、3，6- 二甲基-4，5-辛二酮、3，6- 二甲基-4-羥基-5-辛酮、正壬烷、1_壬烯、壬醇、 壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲基_5_壬 醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基_4，5-壬二醇、8-甲基-4， 5-壬二酮、8-甲基-4-羥基-5-壬酮、8-甲基-5-羥基-4-壬酮、2，8- 二甲基壬烷、2，8- 二 甲基-3-壬烯、2，8_ 二甲基-4-壬烯、2，8_ 二甲基-5-壬烯、2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二 甲基-5-壬醇、2，8_ 二甲基-4-壬酮、2，8_ 二甲基-5-壬酮、2，8_ 二甲基-4，5-壬二醇、2， 8- 二甲基-4，5-壬二酮、2，8- 二甲基-4-羥基-5-壬酮、2，8- 二甲基-5-羥基-4-壬酮、 2，7- 二甲基壬烷、3，8_ 二甲基-3-壬烯、3，8_ 二甲基-4-壬烯、3，8_ 二甲基-5-壬烯、3， 8-二甲基-4-壬醇、3，8_ 二甲基-5-壬醇、3，8_ 二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、 3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、3， 8-二甲基-5-羥基-4-壬酮、η-癸烷、1-癸烯、1-癸醇、癸酸、2，9_ 二甲基癸烷、2，9_ 二甲 基-3-癸烯、2，9_ 二甲基-4-癸烯、2，9_ 二甲基-5-癸醇、2，9_ 二甲基-5-癸酮、2，9_ 二 甲基-5，6-癸二醇、2，9_ 二甲基-6-羥基-5-癸酮、2，9_ 二甲基-5，6-癸二酮^一烷、 Ι-i^一烯、1-十一醇、i^一醛，十一酸、正十二烷、1-十二烯、1-十二醇、十二醛、十二酸、正 十二烷、1-十癸烯(decadecene)、1-十二醇、十二醛、十二酸、正十三烷、十三烯、十三 醇、十三醛、十三酸、正十四烷、1-十四烯、1-十四醇、十四醛、十四酸、正十五烷、1-十五烯、 1-十五醇、十五醛、十五酸、正十六烷、1-十六烯、1-十六醇、十六醛、十六酸、正十七烷、 1-十七烯、1-十七醇、十七醛、十七酸、正十八烷、1-十八烯、1-十八醇、十八醛、十八酸、正 十九烷、1-十九烯、1-十九醇、十九醛、十九酸、二十烷、1-二十烯、1-二十醇、二十醛、二十 酸、3-羥基丙醛、1、3-丙二醇、4-羥基正丁醛、1、4_ 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2、3_ 丁二 醇、1，5_戊二醇、高檸檬酸、高異檸檬酸、b-羥基己二酸、戊二酸、戊二半醛，戊二醛、2-羥 基-1-環(huán)戊酮、1，2_環(huán)戊二醇、環(huán)戊酮、環(huán)戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羥基-異 戊酸、2_氧代異戊酸、異丁酰_Co4、異丁酸酯、異丁醛、5-氨基戊醛、1，10- 二氨基癸烷、1， 10- 二氨基-5-癸烯、1，10- 二氨基-5-羥基癸烷、1，10- 二氨基-5-癸酮、1，10- 二氨基-5， 6_癸二醇、1，10- 二氨基-6-羥基-5-癸酮、苯乙醛、1，4- 二苯基丁烷、1，4- 二苯基-1- 丁 烯、1，4-二苯基-2-丁烯、1，4-二苯基-2-丁醇、1，4-二苯基-2-丁酮、1，4-二苯基-2，3-二醇、1，4- 二苯基-3-羥基-2- 丁酮、1- (4-羥苯基)-4"苯基丁烷、1-(4-羥苯基)~4~苯 基-1- 丁烯、1- (4-羥苯基)-4-苯基-2- 丁烯、1- (4-羥苯基)-4-苯基-2- 丁醇、1_ (4-羥 苯基)-4_苯基-2-丁酮、1-(4_羥苯基)-4_苯基-2，3-丁二醇、1-(4-羥苯基)-4-苯 基-3-羥基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基丁烷、1-(吲哚-3)-4-苯基-1-丁烯、1-(吲 哚-3) -4-苯基-2- 丁烯、1-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁醇、1-(吲哚_3) -4-苯基-2- 丁酮、 1-(吲哚_3) -4-苯基-2，3- 丁二醇、1-(吲哚-3) -4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、4-羥基苯乙 醛、1，4_ 二(4-羥苯基)丁烷、1，4_ 二(4-羥苯基)-1_ 丁烯、1，4_ 二(4-羥苯基)_2_ 丁 烯、1，4_ 二(4-羥苯基)-2_ 丁醇、1，4_ 二(4-羥苯基)-2_ 丁酮、1，4_ 二(4-羥苯基)_2， 3_ 丁二醇、1，4_ 二(4-羥苯基)-3_羥基-2-丁酮、1-(4_羥苯基)-4-(吲哚-3-) 丁烷、 1-(4-羥苯基)-4-(吲哚-3)-1- 丁烯、1- 二 (4-羥苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁烯、1_ (4-羥 苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁醇、1- (4-羥苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁酮、1_ (4-羥苯基)-4-(吲 哚-3) -2，3- 丁二醇、1- (4-羥苯基-4-(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、吲哚_3_乙醛、1，4- 二 (吲哚-3_) 丁烷、1，4_ 二(吲哚-3)-l-丁烯、1，4_ 二(吲哚-3)-2-丁烯、1，4_ 二(口引 哚-3)-2-丁醇、1，4-二(吲哚-3)-2-丁酮、1，4-二(吲哚 _3)-2，3-丁二醇、1，4-二(口引 哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8- 二羧基酸、3-己烯-1，8- 二羧基酸、3-羥 基-己烷-1，8-二羧基酸、3-己酮-1，8-二羧基酸、3，4_己二醇-1，8-二羧基酸、4-羥 基-3-己酮-1，8-二羧基酸、巖藻依聚糖、碘、葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、鈣、鎂、鐵、鈉、鉀、磷酸鹽寸。
術(shù)語(yǔ)“生物活性片段(biologically active fragment) ”，適用于參照或全長(zhǎng)多 核苷酸或多肽序列的片段，是指具有參照序列活性的至少約0. 1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99% 的片 段。本發(fā)明范圍內(nèi)包括長(zhǎng)度至少約 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200或更多核苷酸或殘基的生物活性片段，其包含或 編碼參照多核苷酸或多肽的活性。示例性的生物活性片段通常參與相互作用，例如分子內(nèi) 或分子間相互作用。分子間相互作用可以是特異結(jié)合相互作用或酶促相互作用。分子間 相互作用可以是在ADH多肽和輔因子分子之間，所述輔因子分子例如煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH分子。ADH多肽的生物活性 部分包括包含與任何以下氨基酸序列具有足夠相似性或同一性或者衍生自任何以下氨基 酸序列的的氨基酸序列的肽:SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38 或 78?！熬幋a序列(coding sequence)”是指對(duì)基因的多肽產(chǎn)物編碼的起作用的任何核酸 序列。相反地，術(shù)語(yǔ)“非編碼序列(non-coding sequence) ”是指對(duì)基因的多肽產(chǎn)物編碼不 起作用的任何核酸序列。在本說(shuō)明書(shū)始終，除非上下文另有規(guī)定，詞語(yǔ)“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”和“包含(comprising) ”應(yīng)理解為意指包括所述的步驟或要素或者步驟 或要素組，而不排除任何其他的步驟或要素或者步驟或要素組?！坝伞M成(consisting of)”是指包括且限于跟在該短語(yǔ)“由…組成”之后的內(nèi)容。因此，短語(yǔ)“由…組成”表明所 列出的要素是必需的的或強(qiáng)制性，并且不存在其他要素?！盎旧嫌伞M成(consisting essentially of) ”指包括該短語(yǔ)后面列出的任何要素，并且限于不干擾或促進(jìn)所列出的要素在本公開(kāi)內(nèi)容中給定的活性或作用的其他要素。因此，該短語(yǔ)“基本上由…組成”表明所 列出的要素是必需的或強(qiáng)制性的，但其他要素不是任選的，其是否可以存在取決于它們是 否影響所列出的要素的活性或作用。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的(complementary)，，和“互補(bǔ)性(complementarity)，，是指與堿基配 對(duì)原則相關(guān)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”與序列“T-C-A”是互補(bǔ)的。 互補(bǔ)性可以是“部分的(partial)”，其中只有一些核酸堿基按照堿基配對(duì)原則被匹配?；?者，可以有核酸之間“完全的”或“全部的”互補(bǔ)性。核酸鏈之間互補(bǔ)性的程度對(duì)核酸鏈之 間雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著影響?！皩?duì)應(yīng)于(corresponds to)，，或“對(duì)應(yīng)于(corresponding to)，，是指(a)多核昔酸 具有與參照多核苷酸序列的全部或部分基本上同一的或互補(bǔ)的核苷酸序列，或者編碼與肽 或蛋白質(zhì)中的氨基酸序列同一的氨基酸序列；或者(b)肽或多肽具有與參照肽或蛋白質(zhì)中 的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列?！把苌铩笔侵竿ㄟ^(guò)修飾從基礎(chǔ)序列衍生而來(lái)的多肽，所述修飾例如通過(guò)與其他化 學(xué)部分共軛或配位或者通過(guò)翻譯后修飾，這些在本領(lǐng)域是可以理解的。術(shù)語(yǔ)“衍生物”在其 范圍內(nèi)還包括對(duì)母序列(parentsequence)進(jìn)行的改動(dòng)，其包括用于提供功能等同分子的 添加或缺失。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“功能”和“功能的”等是指生物的、酶的或治療的功能。 術(shù)語(yǔ)“外源的”通常指不是天然存在于野生型細(xì)胞或生物體中，而是通常通過(guò)分子 生物學(xué)技術(shù)即工程改造技術(shù)導(dǎo)入到細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生重組微生物的多核苷酸序列或多肽?！巴?源”多核苷酸的實(shí)例包括編碼期望的蛋白或酶的載體、質(zhì)粒和/或人造核酸構(gòu)建體。術(shù)語(yǔ) “內(nèi)源的”通常指可以見(jiàn)于給定的野生型細(xì)胞或生物體內(nèi)的天然存在的多核苷酸序列或多 肽。例如某些天然存在的細(xì)菌或酵母種類(lèi)通常不含有苯甲醛裂解酶基因，因此，不包含編碼 苯甲醛裂解酶的“內(nèi)源的”多核苷酸序列。關(guān)于這點(diǎn)，還應(yīng)該注意到盡管生物體包含給定的 多核苷酸序列或基因的內(nèi)源的拷貝，但是導(dǎo)入編碼所述序列的質(zhì)?；蜉d體，例如用于過(guò)表 達(dá)所述編碼蛋白或者調(diào)節(jié)所述編碼蛋白的表達(dá)，表示所述基因或多核苷酸序列的“外源”拷 貝。任何本文所述的途徑、基因或酶可以利用或依賴(lài)于“內(nèi)源”序列，或者可以作為一個(gè)或 多個(gè)“外源”多核苷酸序列提供，和/或按照已經(jīng)包含在給定的微生物中的內(nèi)源的序列來(lái)使 用?！爸亟M”微生物包含一個(gè)或多個(gè)外源的核苷酸序列，例如在質(zhì)粒或載體中的外源核 苷酸序列?！拔⑸锵到y(tǒng)”通常指重組微生物的群體，例如包含在培養(yǎng)箱或其他類(lèi)型的微生物 培養(yǎng)瓶/裝置/孔中的群體，或者例如發(fā)現(xiàn)在皿或板上生長(zhǎng)的(例如含有瓊脂糖的培養(yǎng)皿) 群體?！盎颉笔侵冈谌旧w占據(jù)特定基因座的遺傳單位，其由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列 和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(即內(nèi)含子、5’和3’非翻譯序列)組成?！巴葱?Homology) ”是指同一的或組成型保守取代的核苷酸或氨基酸的百分?jǐn)?shù)。 同源性可以使用序列比較程序來(lái)確定，例如GAP(Deverauxet al.，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)，在此通過(guò)引用將其并入。以此方式，與本文引用的序列長(zhǎng)度相似或 基本上不同的序列可以通過(guò)在比對(duì)中插入空位來(lái)進(jìn)行比較，所述空位的確定例如通過(guò)GAP所用的比較算法。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是本發(fā)明的任何重組載體或分離的多核苷酸 的接受體的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，并且由于天然的、 偶然的或蓄意的突變和/或變化，所述后代并不一定與最初的母體細(xì)胞完全相同(在形態(tài) 上或在總DNA互補(bǔ)物方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn) 染或感染的細(xì)胞。包含本發(fā)明重組載體的宿主細(xì)胞是重組宿主細(xì)胞?！胺蛛x的，，是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上沒(méi)有通常在其天然狀態(tài)中與之伴隨的組分的物質(zhì)。 例如，本文使用的“分離的多核苷酸”是指從在天然存在狀態(tài)時(shí)位于其側(cè)翼的序列中純化的 多核苷酸，例如從通常與其相鄰的序列中移開(kāi)的DNA片段?？蛇x地，本文使用的“分離的肽” 或“分離的多肽”等是指肽或多肽分子從其天然細(xì)胞環(huán)境中和從與該細(xì)胞其他組分的結(jié)合 中進(jìn)行體外分離和/或純化，即它不與體內(nèi)物質(zhì)結(jié)合。如本文所用敘述，“多糖”、“適合的單糖”或“適合的寡糖”可以作為微生物中能量 和碳的來(lái)源使用，并且適合用于產(chǎn)生例如生物燃料和生物汽油的碳?xì)浠衔锏纳锶剂系?生物合成途徑。多糖、適合的單糖和適合的寡糖的實(shí)例包括但不限于藻酸鹽、瓊脂糖、巖藻 依聚糖、果膠、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露醇、來(lái)蘇糖、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳 糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖和2-酮基-3-脫氧D-葡萄糖酸-6-磷 酸(KDG)等。 “獲自”是指樣品，例如諸如多核苷酸提取物或多肽提取物分離自或衍生自特定來(lái) 源的個(gè)體。例如，所述提取物可以獲自直接從所述個(gè)體分離的的組織或生物流體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指多個(gè)核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類(lèi)似物)通過(guò)磷酸二酯鍵(或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類(lèi)似 物)連接組成的聚合物。因此，雖然術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”通常指核苷酸聚合物，其中核苷酸殘基 和它們之間的連接是天然存在的，但也應(yīng)該理解到，該術(shù)語(yǔ)在其范圍內(nèi)還包括各種類(lèi)似物， 包括但不限于肽核酸(PNAs)、氨基磷酸酯、硫代磷酸、甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核酸等。 分子精確的大小根據(jù)具體應(yīng)用而有所不同。寡核苷酸通常在長(zhǎng)度上較短，通常從10到30 個(gè)核苷酸殘基，但是該術(shù)語(yǔ)可以指任何長(zhǎng)度的分子，盡管術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸”通常用 于指代大的寡核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接(operably linked) ”表示將結(jié)構(gòu)基因置于啟動(dòng)子 的調(diào)節(jié)控制下，然后該啟動(dòng)子控制基因的轉(zhuǎn)錄和任選的翻譯。在異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組 合的構(gòu)建中，通常優(yōu)選地將基因序列或啟動(dòng)子放置在與基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有一定距離的位 置，這段距離與該基因序列或啟動(dòng)子和其在天然環(huán)境中控制的基因之間的距離大約相同； 即所述基因序列或啟動(dòng)子衍生自的基因。在本領(lǐng)域中眾所周知，可以對(duì)所述這段距離進(jìn)行 一些變化，而不會(huì)損失功能。相似地，調(diào)節(jié)序列元件相對(duì)于將置于其控制下的異源基因的優(yōu) 選的放置是由該元件在其天然環(huán)境中的放置所限定；即該元件衍生自的基因。本文使用的敘述“優(yōu)化的”是指途徑、基因、多肽、酶或其他分子具有改變的生物活 性，例如通過(guò)多肽的氨基酸序列的遺傳改變或通過(guò)所述多肽周?chē)?xì)胞環(huán)境的改變/修飾， 以相對(duì)于最初的分子或最初的細(xì)胞環(huán)境(例如給定多肽的野生型序列或野生型微生物)改 善其功能特性。本文所述的任何多肽或酶類(lèi)可以任選地“優(yōu)化”，并且本文所述的任何基因 或核苷酸序列可以任選地編碼優(yōu)化的多肽或酶。本文所述的任何途徑可以任選地含有一個(gè)或多個(gè)“優(yōu)化的”酶或一個(gè)或多個(gè)用于編碼優(yōu)化的酶或多肽的核苷酸序列。通常，多肽、酶或其他分子的改善的功能特性與所述多肽或其他分子用于在生物 途徑(例如生物合成途徑、C-C連接途徑)將單糖或寡糖轉(zhuǎn)化為生物燃料的適合性有關(guān)。 因此某些實(shí)施方案考慮使用“優(yōu)化的”生物途徑。示例性的“優(yōu)化的”多肽可以在其氨基酸 編碼序列含有一個(gè)或多個(gè)改變或突變(例如點(diǎn)突變、缺失、異源序列的添加)，這促進(jìn)在給 定的微生物系統(tǒng)或微生物中的表達(dá)和/或穩(wěn)定性的改善，允許相對(duì)于所需底物調(diào)節(jié)多肽活 性(例如誘導(dǎo)型或阻遏活性)，調(diào)整多肽在細(xì)胞中的定位(例如細(xì)胞內(nèi)定位、細(xì)胞外分泌)， 和/或相對(duì)于所需底物影響多肽整體活性水平(例如降低或增加酶促活性)。也可以“優(yōu) 化”多肽或其他分子用于通過(guò)改變給定的微生物系統(tǒng)或微生物內(nèi)的一條或多條途徑來(lái)與該 系統(tǒng)或生物體一起使用，例如通過(guò)改變調(diào)節(jié)“優(yōu)化的”多肽或其他分子的表達(dá)(例如上調(diào))、 定位和/或活性的途徑，或者通過(guò)改變將不需要的副產(chǎn)品產(chǎn)量降到最低的途徑，以及其他 改變。這樣，多肽或其他分子可以改變或不改變其野生型氨基酸序列或最初的化學(xué)結(jié)構(gòu)而 被“優(yōu)化”。按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)，優(yōu)化的多肽或生物途徑可以通過(guò)例如針對(duì)所需要的表 型進(jìn)行直接誘變或自然選擇來(lái)獲得。在某些方面，“優(yōu)化的”基因或多肽可以包含與本文所述的參照(例如野生型)基 因或多肽的核苷酸或氨基酸序列50%至99%同一的(包括中間的所有整數(shù))核苷酸編碼 序列或氨基酸序列。在某些方面，“優(yōu)化的”多肽或酶可以具有參照多肽的約1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、20、30、40、50、100(包括中間的所有整數(shù)和小數(shù)點(diǎn)，例如 1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,5. 5、 5. 6,5. 7,60,70等)或更多倍的生物活性。
如本文使用的敘述“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該 術(shù)語(yǔ)通常指在長(zhǎng)度上至少10個(gè)堿基的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸 或脫氧核苷酸或兩種類(lèi)型核苷酸之一的修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈或雙鏈形式的DNA。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸變體”和“變體”等是指展示出與參照多核苷酸序列基本的序列同 一性的多核苷酸或與參照序列在下文定義的嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。這些術(shù)語(yǔ)還包括 與參照多核苷酸的區(qū)別在于至少一個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代的多核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ) “多核苷酸變體”和“變體”包括其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被添加或缺失或用不同核苷酸取代 的多核苷酸。關(guān)于這點(diǎn)，在本領(lǐng)域應(yīng)很好地理解到，包括突變、添加、缺失和取代的的某些改 變可以用于參照序列，由此改變的多核苷酸保留該參照序列的生物功能或活性。多核苷酸 變體包括與 SEQ ID NOs :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 或 37 中 任一個(gè)所示的序列具有至少50% (和至少51%至至少99%，以及中間的所有整數(shù)百分比) 序列同一性的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸變體”和“變體”還包括天然存在的等位基因變體?！岸嚯摹?、“肽”和“蛋白，，在本文可交替使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合 成類(lèi)似物。因此，這些術(shù)語(yǔ)適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天 然存在的氨基酸，例如相應(yīng)天然存在氨基酸的化學(xué)類(lèi)似物，還適用于天然存在的氨基酸聚 合物。如本文使用的表述“ADH多肽”或“及其變體”包括但不限于，具有與SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 78 中任一個(gè)所示的序列共 享至少50% (和至少51%至99%，以及中間的所有整數(shù)百分比)序列同一性的氨基酸序 列的多肽。這些表述還包括可以在細(xì)菌種類(lèi)彼此之間存在或發(fā)生的ADH多肽的天然等位變體。包括其變體在內(nèi)的ADH多肽，，包括展示出至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、 60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%和130%野生型40!1多肽特異性活性的多肽(即 例如具有醇脫氫酶活性，包括DEHU氫化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性)。具有與 野生型ADH多肽相比基本上相同或提高的生物活性的ADH多肽包括變體包括展示出至少約 25%、50%、75%、100%、110%、120%或130%的野生型多肽的特異生物活性的多肽。為了 本申請(qǐng)的目的，ADH相關(guān)生物活性可以通過(guò)例如測(cè)量ADH多肽或其變體以DEHU或D-甘露 糖醛酸為底物(參見(jiàn)例如實(shí)施例2)消耗NADPH的能力來(lái)定量。具有與野生型ADH相比降 低的生物活性的ADH多肽包括變體展示出少于約25%、10%、5%或的野生型ADH的特 異活性。表述多肽“變體”是指通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或取代與參照多肽相 區(qū)別的多肽。在某些實(shí)施方案中，多肽變體是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)保守性或非保守性取代與參 照多肽相區(qū)別。在某些實(shí)施方案中，所述多肽變體包含保守性取代，并且關(guān)于這點(diǎn)，在本領(lǐng) 域中應(yīng)該很好地理解到，一些氨基酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕V泛相似性質(zhì)的其他氨基酸而不改變 該多肽的活性的本質(zhì)。多肽變體還包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加或缺失或用不同氨基酸殘 基所取代的多肽。本發(fā)明考慮全長(zhǎng)ADH序列以及其生物活性片段在本申請(qǐng)的方法和微生物系統(tǒng)中 的用途。通常，全長(zhǎng)ADH多肽的生物活性片段可以參與相互作用，例如分子內(nèi)或分子間相互 作用。分子間相互作用可以是特異結(jié)合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以 是瞬時(shí)的和共價(jià)鍵的形成或打開(kāi))。全長(zhǎng)ADH多肽的生物活性片段包括包含與(推定的) 全長(zhǎng)ADH氨基酸序列足夠相似或衍生自(推定的)全長(zhǎng)AD H氨基酸序列的氨基酸序列的 肽。通常，生物活性片段包含具有全長(zhǎng)ADH多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序，并且可以 包括多種活性結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)(以及某些情況下所有的)，以及包括含有具有氫化酶 活性片段的片段，例如醇脫氫酶活性、DEHU氫化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性。 全長(zhǎng)ADH多肽的生物活性片段可以是，例如，SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36、38 或 78 中任一個(gè)所示的氨基酸序列的 10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150 或更多 個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽。在某些實(shí)施方案中，生物活性片段包含如本文所述的NAD+、NADH、 NADP+或NADPH結(jié)合基序。適宜地，所述生物活性片段具有不少于約1%、10%、25%和50% 的其來(lái)自的全長(zhǎng)多肽的活性。如本文使用的表述“序列同一性”或例如包含“與…50%同一的序列”是指基于整 個(gè)比較窗內(nèi)的核苷酸與核苷酸或者氨基酸與氨基酸的序列的同一程度。因此，“序列同一性 百分比”的計(jì)算通過(guò)如下進(jìn)行將兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列在整個(gè)比較窗內(nèi)進(jìn)行比較，確定在兩 個(gè)序列中出現(xiàn)一致的核酸堿基(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷)或同一的氨 基酸殘基(例如丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半 胱氨酸和蛋氨酸)的位置的數(shù)目，以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比 較窗中位置總數(shù)(即窗大小)，并且將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。用來(lái)描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參照序列(reference sequence) ”、“ 比較窗(comparison window) ” “序列同一性(sequence identity)，，“序列同一'性百分比(percentage of sequenceidentity)，，禾口“基本同一'性 (substantial identity)”?！皡⒄招蛄小痹陂L(zhǎng)度上為至少12個(gè)，但經(jīng)常15至18個(gè)，且通 常至少25個(gè)單體單位，包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可以每個(gè)包含(1) 在所述兩個(gè)核苷酸之間相似的序列(即只有完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在所述 兩個(gè)核苷酸之間不同的序列，所以?xún)蓚€(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較通常通過(guò)比較 整個(gè)“比較窗”內(nèi)的兩個(gè)多核苷酸的序列來(lái)進(jìn)行，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。 “比較窗”是指至少6個(gè)連續(xù)位置，常見(jiàn)地約50個(gè)到約100個(gè)連續(xù)位置，更常見(jiàn)地約100至 約150個(gè)連續(xù)位置的概念節(jié)段，其中序列與參照序列最佳比對(duì)后，所述序列與相同數(shù)目連 續(xù)位置的所述參照序列比較。用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)時(shí)，比較窗與對(duì)照序列相比(不包 含添加或缺失)可以包含約20%或更少的添加或缺失(即空位)。用于比對(duì)比較窗的序列 的最佳比對(duì)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)化執(zhí)行運(yùn)算法則(威斯康星遺傳學(xué)軟件包7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0)的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，遺傳學(xué)計(jì) 算機(jī)組(GeneticsComputer Group)，575 Science Drive Madison, WI, USA)或者通過(guò)目測(cè) 來(lái)實(shí)施，由此通過(guò)選定的不同方法的任一種得到最優(yōu)的比對(duì)(即得到整個(gè)比較內(nèi)最高百分 比同源性)。還可以參照例如Altschul et al.，1997，Nucl. AcidsRes. 25 3389所公開(kāi)的 BLAST家族程序，。序列分析的詳細(xì)討論可以見(jiàn)Ausubel et al, " Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)指南)〃，John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第 15 章的19. 3單元“載體(vector)”指多核苷酸可以插入或克隆入其中的來(lái)自于例如質(zhì)粒、噬菌體、 酵母或病毒的多核苷酸分子，優(yōu)選地DNA分子。載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位 點(diǎn)，并且能在規(guī)定的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，所述宿主細(xì)胞包括靶細(xì)胞或組織或者其前體細(xì) 胞或組織，或者能與規(guī)定的宿主的基因組整合，這樣克隆的序列就是可復(fù)制的。因此，所述 載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外獨(dú)立體存在的實(shí)體的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色 體復(fù)制，例如線形或閉合環(huán)狀質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(mini-chromosome)或人工 染色體。所述載體可以含有任何用于確保自我復(fù)制的元件?？蛇x地，當(dāng)所述載體被導(dǎo)入宿主 細(xì)胞中時(shí)，其可以整合到基因組中并且與其整合的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可以包含單 個(gè)載體或質(zhì)粒，兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA， 或者轉(zhuǎn)座子。載體的選擇通常取決于載體與該載體被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。在本文情 況下，載體優(yōu)選是在細(xì)菌細(xì)胞中可操作地起作用的載體。所述載體還可以包括選擇標(biāo)記，例 如用于選擇適合轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性基因。術(shù)語(yǔ)“野生型”和“天然存在的”可交替使用，指具有基因或基因產(chǎn)物從天然存在 的來(lái)源中分離出來(lái)時(shí)的特征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因或基因產(chǎn)物(例如多肽)是群 體中最常見(jiàn)的并因此任意設(shè)計(jì)為基因的“正常”或“野生型”形式。本發(fā)明的實(shí)施方案部分地與細(xì)菌脫氫酶基因和這些基因編碼的多肽的分離和表 征有關(guān)。一些實(shí)施方案可以包括具有醇脫氫酶活性的分離的脫氫酶多肽，所述多肽稱(chēng)作醇 脫氫酶(ADH)多肽。按照本申請(qǐng)，ADH多肽可以具有DEHU氫化酶活性、D-甘露糖醛酸活性 或DEHU和D-甘露糖醛酸氫化酶活性?xún)烧摺Ｆ渌膶?shí)施方案可以包括編碼這些多肽的多核 苷酸。例如本申請(qǐng)的分子可以包括選自以下的分離的多核苷酸，及其片段或變體
(a)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80%同一的核苷酸序列；(b)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90%同一的核苷酸序列；(c)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列；(d)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97%同一的核苷酸序列；(e)分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99%同一的核苷酸序列；和(f)分離的多核苷酸，其包含 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 、23、25、
27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸編碼具有脫氫酶活性的多肽。在某些實(shí)施方案中，所述多 肽具有醇脫氫酶活性，例如DEHU氫化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性。本發(fā)明的分子還可以包括分離的ADH多肽或其變體、片段或衍生物，其具體可以 選自(a)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；(b)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；(c)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列；(d)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97%同一的氨基酸序列；(e)分離的多肽，其包含與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99%同一的氨基酸序列；和(f)分離的多肽，其包含 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列，其中所述分離的多肽具有脫氫酶活性。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有醇脫氫 酶活性，例如DEHU氫化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氫化酶活性。在另外的實(shí)施方案中，如本文公開(kāi)分離的多核苷酸編碼多肽，所述多肽包含煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH結(jié)合基序 中的至少一個(gè)。其他實(shí)施方案包括如本文公開(kāi)的ADH多肽、其變體、片段或衍生物，其中 所述多肽包含NAD+、NADH、NADP+或NADPH結(jié)合基序中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中， 所述結(jié)合基序選自以下Y-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO 67)、Y-X-X-G—G—X—Y (SEQ ID NO 68)、 Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO 69),Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO :70)、Y-X-X-G-G-X-X_Y(SEQ ID NO 71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO :72)、Y-X-G-X-Y (SEQ ID NO :73)、Y-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO :74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 75)和 Y-X-X-X-X—G—X—Y(SEQ ID NO 76)；其中 Y 獨(dú)立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X獨(dú)立地選自基因編碼的氨基酸。不希望被任何理論所約束，NAD+和相關(guān)分子在脫氫酶反應(yīng)中作為輔因子，這些結(jié) 合基序通常在醇脫氫酶中是保守的，并且在NAD+、NADH、NADP+或NADPH結(jié)合中起到重要作用。本申請(qǐng)所包括的變體蛋白是有生物活性的，即它們保留所需要的天然蛋白的生物 活性。此類(lèi)變體可以來(lái)自，例如，基因多態(tài)性或人為操縱。如通過(guò)本文其他地方所述的序列 比對(duì)程序、使用默認(rèn)參數(shù)所測(cè)定的，天然或野生型ADH多肽的生物活性變體具有與天然蛋 白的氨基酸序列的至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%，經(jīng)常約90%至 95%或更高，典型性地約98%或更高的序列相似性或一致性。野生型ADH多肽的生物活性 變體與該蛋白的差別通常是200、100、50或20個(gè)氨基酸殘基，或者適宜地少至1-15個(gè)氨基 酸殘基，少至1-10個(gè)，例如6-10，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。在一些實(shí) 施方案中，ADH 多肽與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、 36、38或78中的相應(yīng)序列的差異在于至少一個(gè)但少于15、10或5個(gè)氨基酸殘基。在其他實(shí) 施方案中，它與 SEQ IDNO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 78中的相應(yīng)序列的差異在于至少一個(gè)殘基但少于20%、15%、10%或5%的殘基。ADH多肽可以用各種方法改變，包括氨基酸取代、缺失、截?cái)嗪筒迦?。此?lèi)操縱的 方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。例如，ADH多肽的氨基酸序列變體可以通過(guò)DNA中的突變制 備。用于誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。參見(jiàn)，例如Kimkel (1985， Proc. Natl. Acad. Sci USA. 82 488-492),Kunkel et al, (1987,Methods in Enzymol,154 367-382)，美國(guó)專(zhuān)利第 4，873，192 號(hào)，Watson, J. D. et al, ( "Molecular Biology of the Gene (基因分子生物學(xué))”，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park, Calif, 1987)和其中 引用的文獻(xiàn)。不影響目的蛋白的生物活性的合適的氨基酸取代的指導(dǎo)可以見(jiàn)于Dayhoff et al.，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集) (Natl. Biomed. Res. Found. ,Washington,D. C)中的模型。篩選由點(diǎn)突變和截?cái)嗌傻慕M合 文庫(kù)的基因產(chǎn)物的方法和用于篩選具有所選特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域 已知的。這些方法適于ADH多肽的組合誘變所生成的基因文庫(kù)的快速篩選。遞歸整體誘變 (recursive ensemble mutagenesis (REM))是提高文庫(kù)中功能性突變體的頻數(shù)的技術(shù)，可 以與篩選檢測(cè)聯(lián)合使用來(lái)鑒定ADH多肽變體(Arkinand Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 7811-7815 ；Delgrave etal.，(1993)Protein Engineering，6 :327_331)。如 下文更詳細(xì)討論的，保守性取代，例如將一個(gè)氨基酸交換成具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸， 可能是理想的。變體ADH多肽當(dāng)與親本ADH氨基酸序列比較時(shí)，可以在沿著其序列的不同位點(diǎn)含 有保守性氨基酸取代?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被藲埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基端殘基所 替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已有界定，通?？梢园凑找韵逻M(jìn)行亞分 類(lèi)酸性殘基在生理pH值由于失去氫離子而帶有負(fù)電荷，并且殘基被水溶液吸引， 以至于當(dāng)含有該殘基的肽在生理PH值的水性介質(zhì)中時(shí)，該殘基在肽的構(gòu)象中尋找表面位 置。具有酸性側(cè)鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。堿性殘基在生理pH值或其一或兩個(gè)pH單位內(nèi)(例如組氨酸)由于與氫離子結(jié) 合而帶有正電荷，并且殘基被水溶液吸引，以至于當(dāng)含有該堿基的肽在生理PH值的水性介質(zhì)中時(shí)，該殘基在的肽的構(gòu)象中尋找表面位置。具有堿性側(cè)鏈的氨基酸包括精氨酸、賴(lài)氨酸 和組氨酸帶電荷的該類(lèi)殘基在生理PH值下帶有電荷，因此包括具有酸性和堿性側(cè)鏈的氨 基酸(即谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)。疏水的該類(lèi)殘基在生理pH值下不帶電荷，并且該殘基被水溶液排斥，以至于當(dāng) 含有該殘基的肽在水性介質(zhì)中時(shí)，該殘基在肽的構(gòu)象中尋找內(nèi)部位置。具有疏水側(cè)鏈的氨 基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性的/極性的該類(lèi)殘基在生理pH值下不帶電荷，但是該殘基不被水溶液充分 排斥，這樣當(dāng)含有該殘基的肽在水性介質(zhì)中時(shí)，該殘基可能會(huì)在肽的構(gòu)象中尋找內(nèi)部位置。 具有中性的/極性的側(cè)鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和 蘇氨酸。本說(shuō)明書(shū)還將某些氨基酸表征為“小的”，因?yàn)榧词谷狈O性基團(tuán)，其側(cè)鏈也不足 夠大到賦予其疏水性。除了脯氨酸，“小的”氨基酸是那種當(dāng)至少一個(gè)極性基團(tuán)在側(cè)鏈時(shí)為 4個(gè)碳或更少的氨基酸，以及當(dāng)沒(méi)有極性基團(tuán)在側(cè)鏈時(shí)為3個(gè)碳或更少的氨基酸。具有小側(cè) 鏈的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。由于脯氨酸已知的對(duì)肽鏈二級(jí)構(gòu)象的影 響，所以基因編碼的二級(jí)氨基酸(secondary amino acid)脯氨酸是特例。脯氨酸的結(jié)構(gòu)與 所有其他天然存在氨基酸的區(qū)別在于其側(cè)鏈與α-氨基基團(tuán)的氮以及α-碳結(jié)合。但是，一 些氨基酸相似性矩陣(例如，ΡΑΜ120矩陣和ΡΑΜ250矩陣，例如由Dayhoff et al.，(1978)， A model of evolutionarychange in proteins. Matrices for determining distance relationships In M. 0. Dayhoff, (ed. )，Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 以及由 Gonnet etal.，(1992，Science, 256 (5062) 14430-1445)所公開(kāi)的)將脯氨酸包括在與甘 氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸相同的組內(nèi)。因此，為了本發(fā)明的目的，脯氨酸分類(lèi)為“小”氨 基酸。極性或非極性分類(lèi)所需的吸引或排斥的程度是任意的，因此本發(fā)明所特別考慮的 氨基酸被分類(lèi)為兩者中的一種。沒(méi)有特別命名的大部分氨基酸可以基于已知的行為進(jìn)行分 類(lèi)。氨基酸殘基可以進(jìn)一步亞分類(lèi)為環(huán)狀或非環(huán)狀，芳香族或非芳香族，根據(jù)殘基側(cè) 鏈取代基團(tuán)的顯而易見(jiàn)的分類(lèi)，以及亞分類(lèi)為大或小。如果殘基在存在額外的極性取代基 時(shí)，包括羧基碳在內(nèi)總共含有4個(gè)或更少的碳原子，或不存在額外的極性取代基時(shí)含有總 共3個(gè)或更少的碳原子，該殘基被認(rèn)為是小的。當(dāng)然小的殘基總是非芳香族的。氨基酸殘 基根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性可能落入兩個(gè)或更多的分類(lèi)中。對(duì)于天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，按照本 方案的亞分類(lèi)顯示于表A中。表 A氨基酸亞分類(lèi)
權(quán)利要求
分離的多核苷酸，選自(a)分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80％同一的核苷酸序列；(b)分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列；(c)分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列；(d)分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97％同一的核苷酸序列；(e)分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99％同一的核苷酸序列；和(f)分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸編碼具有脫氫酶活性的多肽。
2.用于將多糖轉(zhuǎn)化為單糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖與重組微生物接觸，其 中所述重組微生物包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
3.用于催化糖醛酸，D-甘露糖醛酸還原(氫化)的方法，其包含使所述糖醛酸，D-甘 露糖醛酸與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
4.用于催化糖醛酸，4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)還原(氫化)的方法，其 包含使DEHU與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
5.包含如權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其中所述分離的多核苷酸可操作地連接到表達(dá)調(diào)控區(qū)。
7.包含重組微生物的微生物系統(tǒng)，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求5所述的載體。
8.包含重組微生物的微生物系統(tǒng)，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求1所述的多核 苷酸，并且其中所述多核苷酸整合到所述重組微生物的基因組中。
9.如權(quán)利要求8所述的微生物系統(tǒng)，其中所述分離的多核苷酸可操作地連接到表達(dá)調(diào) 控區(qū)。
10.如權(quán)利要求7或8所述的重組微生物，其中所述微生物選自醋化醋桿菌 (Acetobacter aceti)、無(wú)色桿菌(Achromobacter) > Bf lif (Acidiphilium)、不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter)、馬杜拉放線菌(Actinomadura)、游動(dòng)放線菌(Actinoplanes)、嗜熱 古生菌(Aeropyrum pernix)、土壤桿菌(Agrobacterium)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes)、菠 蘿(Ananas comosus) (M)、_ 胃(Arthrobacter)、■曲 β (Aspargillus niger)、f ft 霉(Aspargillus oryze)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、粉狀曲霉(Aspergillus pulverulentus)、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)、醬油曲霉(Aspergillus sojea)、宇 佐美曲霉(Aspergillus usamii)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽胞桿菌活菌(Bacillus licheniformis)、浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、洋 蔥布克氏菌(Burkholderia c印acia)、柱狀假絲酵母(Cmdida cylindracea)、皺褶假 絲酵母(Candida rugosa)、番木瓜(Caricapapaya) (L)、纖維菌(Cellulosimicrobium)、 頭抱霉(Cephalosporium)、毛殼菌(Chaetomium erraticum)、細(xì) HI3 毛殼菌(Chaetomium gracile)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、丙酮丁醇 梭菌(Clostridium acetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)、(谷氨 酸)棒狀桿菌(Corynebacterium(glutamicum))、efficiens 棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸球菌(Enterococcus)、菊歐文氏菌(Erwina chrysanthemi)、葡糖桿菌(Gliconobacter)、葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)、嗜鹽古 菌(Haloarcula)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、Humicola nsolens、西唐北里孢菌 (Kitasatospora setae) Λ ^Wtt Kff S" (Klebsiella) ^/^M^Wtt Kff S" (Klebsiella oxytoca)、克魯維斯酵母(Kluyveromyces)、脆壁克魯維斯酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳 酸克魯維斯酵母(Kluyveromyces lactis)、考克氏菌(Kocuria)、乳酸乳桿菌 (Lactlactis)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、 清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sake)、乳球菌(Lactococcus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、明串珠菌(Leuconostoc)、甲基孢囊菌(methylocystis)、西西里甲烷葉菌 (methanolobus siciliae)、嗜器官產(chǎn)甲焼菌(Methanogenium organophilum)、布氏甲焼 桿菌(Methanobacterium bryantii)、蛾微桿菌(Microbacterium imperiale)、溶壁微球 菌(Micrococcus lysodeikticus)、小月菌(Microlunatus)、爪口圭毛霉(Mucorjavanicus) Λ 木干 (Mycobacterium)、■ ■胃(Myrothecium)、石宵 it 木干 M (Nitrobacter)、M 石宵 化單胞菌(Nitrosomonas)、諾卡氏菌(Nocardia)、番木瓜(Papaya carica)、小球 菌(Pediococcus)、嗜鹽片球菌(Pediococcushalophilus)、青霉菌(Penicillium)、 ^ Π tt zF # β (Penicilliurncamemberti)、 Μ # β (Penicillium citrinum)、 默森青霉(Peniclliumemersonii)、婁地青霉(Penicillium roqueforti)、薄青霉 (Penicilliumlilactinum)、多色青霉(Penicillium multicolor)、異養(yǎng)硝化-好氧反 石肖化菌(Paracoccus pantotrophus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、焚光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans)、熱球菌(Pyrococcus)、激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)、極端嗜 熱球菌(Pyrococcus horikoshii)、根瘤菌(Rhizobium)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus Lindt)、根霉(Rhizopus)、戴爾根霉 (Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、 米根霉(Rhizopus oryzae)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、紅球菌(Rhodococcus)、 (Saccharomyces cerevisiae) Λ tl # ^ (Sclerotina libertina)^ ^ ^ffi M 酉享?xiàng)U菌(Sphingobacteriummultivorum)、鞘氨酉享?xiàng)U菌(Sphingobium)、鞘氨酉享單胞菌 (Sphingomonas)、鏈球菌(Streptococcus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) Y-U 鏈霉菌(Streptomyces)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、變鉛青鏈霉 菌(Streptomyces lividans)、鼠鏈霉菌(Streptomyces murinus)、誘赤鏈霉菌 (Streptomyces rubiginosus)、紫紅鏈霉菌(Streptomyces violaceoruber)、輪枝鏈霉菌(StreptoverticiIlium mobaraense)、四聯(lián)球菌(Tetragenococcus)、嗜熱菌(Thermus)、 δ 胃 /求胃(Thiosphaera pantotropha)、！^ 胃(Trametes)、β (Trichoderma)、jk (Trichoderma longibrachiatum)、Jl 氏(Trichoderma reesei) > M^y^M (Trichoderma viride)、青霉毛抱子菌(Trichosporon penicillatum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黃桿菌(Xanthomonas)、酵母(yeast)、魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、酵單胞菌(Zymomonas)禾口運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonus mobilis)。
11.分離的多肽，選自(a)分離的多肽，其包含與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；(b)分離的多肽，其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；(c)分離的多肽,其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列；(d)分離的多肽，其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97%同一的氨基酸序列；(e)分離的多肽，其包含與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99%同一的氨基酸序列；和(f)分離的多肽，其包含SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列，其中所述分離的多肽具有脫氫酶活性。
12.用于將多糖轉(zhuǎn)化為單糖或寡糖的方法，其包含使所述多糖與重組微生物接觸，其中 所述重組微生物包含如權(quán)利要求11所述的多肽。
13.用于催化糖醛酸，D-甘露糖醛酸還原(氫化)的方法，其包含使所述糖醛酸，D-甘 露糖醛酸與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求11所述的多肽。
14.用于催化糖醛酸，4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)還原(氫化)的方法， 其包含使DEHU與重組微生物接觸，其中所述重組微生物包含如權(quán)利要求11所述的多肽。
15.用于將多糖轉(zhuǎn)化為單糖或寡糖的微生物系統(tǒng)，其中所述微生物系統(tǒng)包含重組微生 物，并且其中所述重組微生物包含選自以下的分離的多核苷酸(a)分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80%同一的核苷酸序列；(b)分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90%同一的核苷酸序列；(c)分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列；(d)分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97%同一的核苷酸序列；(e)分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99%同一的核苷酸序列；和(f)分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、`29、31、33、35或37所示的核苷酸序列。
16.用于將多糖轉(zhuǎn)化為單糖或寡糖的微生物系統(tǒng)，其中所述微生物系統(tǒng)包含重組微生 物，并且其中所述重組微生物包含選自以下的分離的多肽(a)分離的多肽，其包含與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；(b)分離的多肽，其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；(c)分離的多肽,其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列；(d)分離的多肽，其包含與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97%同一的氨基酸序列；(e)分離的多肽，其包含與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99%同一的氨基酸序列；和(f)分離的多肽，其包含SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38或78所示的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求1或15所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所 述多肽包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+) 或NADPH結(jié)合基序中的至少一個(gè)，所述結(jié)合基序選自Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO :67)、 Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ IDNO 68)、Υ-Χ-Χ-Χ-G-G-X-Y (SEQ ID NO 69)、Y-X-G-X-X-Y (SEQ IDNO 70)、Y-X-X-G-G-X-X-Y (SEQ ID NO 71)、Υ-Χ-Χ-Χ-G-X-X-Y (SEQ IDNO 72)、 Y-X-G-X-Y(SEQ ID NO :73)、Y-X-X-G-X_Y(SEQ ID NO :74)、Y-X-X-X-G-X_Y(SEQ ID NO 75) 和Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 76)；其中Y獨(dú)立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中G 是甘氨酸，并且其中X獨(dú)立地選自基因編碼的氨基酸。
18.如權(quán)利要求11或16所述的分離的多肽，其中所述多肽包含煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD+)、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH結(jié)合基序中的至少一 個(gè)，所述結(jié)合基序選自 Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO 67), Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO :68)、 Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO 69),Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO :70)、Y-X-X-G-G-X-X_Y(SEQID NO 71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO 72)、Y-X-G-X-Y(SEQ IDNO 73)、Y—X-X—G—X—Y(SEQ ID NO 74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 75)和 Υ-Χ-Χ-Χ-X-G-X—Y(SEQ ID NO 76)；其中 Y 獨(dú)立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X獨(dú)立地選自基因編碼的 氨基酸。
19.用于將多糖轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，其包含使所述多糖與重組微生物接觸，其中所述重 組微生物能夠在作為唯一碳源的所述多糖上生長(zhǎng)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組微生物包含至少一種編碼至少一種丙酮 酸脫羧酶的多核苷酸和至少一種編碼醇脫氫酶的多核苷酸。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多糖是藻酸鹽。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組微生物包含一種或多種含有燦爛弧菌的 V12B01_24189和V12B01_24249之間的基因組區(qū)的多核苷酸。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述至少一種丙酮酸脫羧酶來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述至少一種醇脫氫酶來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組微生物是大腸桿菌。
全文摘要
提供細(xì)菌的多核苷酸和多肽，其中所述多肽具有脫氫酶活性，例如醇脫氫酶(ADH)活性、糖醛酸，4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)((4S，5S)-4，5-二羥基-2，6-二氧代己酸)氫化酶活性、2-酮基-3-脫氧-D-葡萄糖酸脫氫酶活性、D-甘露糖醛酸氫化酶活性和/或D-甘露糖酸脫氫酶活性。還提供方法、酶類(lèi)、重組微生物和微生物系統(tǒng)，用于將例如來(lái)自生物質(zhì)的多糖轉(zhuǎn)化為適合的單糖或寡糖，還用于將適合的單糖或寡糖轉(zhuǎn)化為大量生產(chǎn)型化學(xué)品，例如生物燃料。還提供按本文所述方法生產(chǎn)的大量生產(chǎn)型化學(xué)品。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101970665SQ200980108270
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月28日
發(fā)明者樫山雄樹(shù) 申請(qǐng)人:生物結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室公司