專利名稱：檢測和分析病原體的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
tt^^很快。 一些裝 置含有用于高通量分析的多通道隔離裝置和在單個芯片上集成了樣品制備和分析功能的分析器。同時結(jié)合了多通道分析和^MW羊品制備的裝置能夠減少進(jìn) 行多個測定^r瞼所需的資源和成本量。在基因組學(xué)領(lǐng)域可以找到一個例證在單個裝置中集成測序樣品的制備、純化和電泳分析可以使測定時間和成本降低 并且提高測定的通量效率和耐用性。在所有情況下，微^y空裝置中高水平的集狄都需要芯片才W勾具有耐用性以便分離、絲、》v^、分流、和儲存大量的 流體。用于硅、玻璃硅、聚^f勿、和棒性微^空裝置中的一些閥技術(shù)以有限的方 式滿足了這些需要。然而，許多這些技術(shù)與許多化學(xué)或生化測定A瞼在化學(xué)或物理'^t上不兼容。而且，對J賄的玻璃微^U空裝置來說，許多技術(shù)缺乏耐用表面修飾的各種化學(xué)性質(zhì)。此外，典型地制造單個微流控閥;UM]單獨的膜件，其通常保持打開。具有通常為打開的閥就需要持續(xù)驅(qū)動以保持對流動的控制。采用這種閥的微;iU空裝置不能夠從控制系統(tǒng)中去掉，否則會失去對裝置中流動成分的控制能力。此外， 一些典型的裝置采用單獨設(shè)置的乳月^M件。單獨設(shè)置的氣動乳月^M件雖然有所M， ^il種制造方法阻礙了 ^!^莫^A化為多通道、 高通量的分析裝置。另 一些孩G;U空裝置是利用陽45^合的#玻璃晶片制成，并通its電驅(qū)動。然而，由于硅的導(dǎo)電性和化學(xué)相容性it^其在分析裝置中的應(yīng)用較復(fù)雜。結(jié)合或者沉積^ iJi的薄膜只能部分^咸少其導(dǎo)電性和化學(xué)相容性。人們還禮瞼了彈性裝置。然而，斷生材料的疏水性和多孔性使得斷生裝置與許多化學(xué)和生化測定試驗不相容。因itLA們希望與舉性體表面的流^^觸最 小化。復(fù)雜的制作、化學(xué)相容性、不可靠的流^^控性以及其它的問^itA了 現(xiàn)有的流,空技術(shù)不適合于t^到;^見模、高通量的芯片式實驗室 (lab-on-a-chip)裝置上。因此，本發(fā)明的技#才/^勾提供了一種適合于高密度絲到銜緒裝置上 的*膜件閥結(jié)構(gòu)。，，供:各種基于該^^膜件閥結(jié),的湳控構(gòu)，。、，壯置的一個實例。才M居多種實施方式，病原體檢測系統(tǒng)包括免疫捕獲和DM分析 機(jī)構(gòu)，例如聚合S^iC^應(yīng)(PCR)，和毛細(xì)管電泳(CE)機(jī)構(gòu)。在一個實施例 中，該病原^^r測系統(tǒng)可以在具有樹^U空構(gòu)造的玻^^i^裝置上實現(xiàn)。

圖1A-1E是可以在玻璃微^空裝置上實現(xiàn)的^^膜件閥的圖示。圖1A為整 體膜件閥的頂浮見示。圖1B為具有該閥的三層式裝置的側(cè)視示。圖1C為具有該閥的四層式裝置的僻現(xiàn)示。圖1D為三層式裝置的一種打開式閥的 側(cè)-f見示。圖1E為四層式裝置的一種打開式閥的僻f見示。根悟圖1A和 IB中所示的各種實施方式，三層式玻^(鼓^U空裝置包括夾在兩個玻璃晶片101 和105之間的萍性膜件111。在一個實施例中，該舉性膜件為聚二甲^lJi^ (PDMS)膜件，購自Bisco Silicons of Elk Grove, IL, 254um厚的HT-6135 和HT-6240型膜件。也可以采用其它的柔性膜件。舉^^件111使得晶片之間 的結(jié)合可逆而牢固。
在結(jié)合之前，晶片中蝕刻了流體通道103用于承栽流體。類^a4蝕刻出集
該閥。典型的是，:充^it道107和(09位于一個晶片;05、上，i^E稱之為充 氣晶片，而流體通道蝕刻在第二晶片IOI上，il^稱為流體晶片。這些蝕刻的 通道特征可直接與膜件接觸并形成"^式玻璃/灃性體通道，如圖1B所示。
或者，膜件可位于熱接合的全玻璃流體晶片夾層(XY)與充氣晶片159之 間，如圖1C的四層式裝置150中所示。具有全玻璃的通道可以讓裝置受益于玻 璃的良好物理和化學(xué)'性質(zhì)。任何具有良好物理和化學(xué)性質(zhì)的層被稱作化學(xué)惰性 層。該化學(xué)惰性層可用于制造XY。在一個實施例中，構(gòu)成XY的151和155夾
層就由玻璃制成。
四層式裝置的例子包括熱豐給到連結(jié)晶片155上的流體晶片151。小直徑 的通孔設(shè)置在流體通道153中的間斷點上。舉性膜件157粘附在該流體/連結(jié)晶 片夾層XZ的連接晶片155 —側(cè)。閥偏流腔室161蝕刻在集管晶片159中并與膜 件157粘合，完成了該四層式裝置150。這樣，流體通道153保持了全坡^f匕 學(xué)上有益的構(gòu)造，同時可以實現(xiàn)大^^莫^M匕的流控構(gòu)造。在一些實施方式中， 圖1C中所示的四層式裝置相比較三層式裝置具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)點，因為其減小了樣 品和萍t生膜件之間的接觸。
才M居多種實施方式，^^膜件裝置內(nèi)的各沐JU空成分是通過向充氣晶片上 的孑U^口壓力或真空來驅(qū)動的。iU^f^可單個的膜件稱為IH^膜件。具有整 體膜件的任何單個裝置在j^皮稱為M裝置。用于向與充氣晶片相伴隨的蝕刻 通ii^加壓力或真空的機(jī)構(gòu)在》W皮稱為氣口或充氣口。在三層式裝置中，充氣 晶片中的蝕刻通道將驅(qū)動真空分軟于舉性膜件111的閥區(qū)域109內(nèi)。通過閥區(qū) 域109處的集管通it^加的真空推動膜件遠(yuǎn)離通道的間斷點，并為流體流動提 供了穿過該間斷點的路徑，從而打開閥，如圖1D所示。利用充氣壓力可開關(guān)的閥在itbf皮稱為可開關(guān)閥或氣動開關(guān)閥。
施加充氣壓力包括加壓或者^p真空的情況。因而膜件157能夠調(diào)節(jié)附近 流體通道中的流體流動，如圖1D中所示。在圖1D中，通過與充氣晶片105相 伴隨的蝕刻通道向閥區(qū)域109 口真空來打開流體通道103。當(dāng)不再向閥區(qū)域 109^/口真空或者吸力時，膜件111關(guān)閉流體通道103，如圖1B所示。圖1E表 示了一種四層式裝置。該四層式裝置包4頓道層151、通道153、連接層155、 膜件層157，以及充氣層159。如上所述，該四層式裝置比三層式裝置具有相當(dāng) 的好處，因為其使樣品與萍性膜件之間的接觸最小化，在一些情況下只在閥區(qū) 域161處有接觸。
應(yīng)當(dāng)注意，所示構(gòu)造可以朝著任何方向。在一些實施例中，閥可以在裝置 上倒置。充氣層可以位于流動層的上方或下方。本發(fā)明的技術(shù)方案允許朝著各 種方向，因為重力并不會對該膜件閥ii^不利的影響。
^y空構(gòu)造具有多種優(yōu)點。例如，^^膜件閥通常為關(guān)閉的閥，也，^U3兌該 閥即使在裝置不與驅(qū)動壓力源連接時也^#關(guān)閉狀態(tài)?，F(xiàn)有的通常為打開式的 微^|空閥需要持續(xù)驅(qū)動以^#對裝置流動成分的控制能力。而且，不像形狀記 憶^r的結(jié)構(gòu)，該閥構(gòu)造的開關(guān)溫度都是處于環(huán)境溫度之下，這有利于在水溶 液的生物流體情況下工作。
在許多典型的實施方式中，微^U空裝置之間需要許多接口以便操控各種流 控才M勾。然而，才M居本發(fā)明的多種實施方式，膜件的多個區(qū)域可以通iti^接它 們的充^空制通狄并行驅(qū)動。在一個實施例中，利用單個充氣口就可以控制 一系列閥。因此，僅使用有PM欠量的外部接口或充氣口就能夠控制相當(dāng)多的閥。 這就簡化了實現(xiàn)過程并最小化了裝置接口的問題。才M居各種實施方式，以這種 方式控制閥能夠?qū)膜件進(jìn)行大量并行的充^區(qū)動，用以操控閥、泵、儲液
池、選路器、以錄置內(nèi)的其它;^空構(gòu)造。
膜件閥可用于構(gòu)成各種;劇封/^勾。圖2A和2B為采用膜件閥構(gòu)成的泵的圖 示。才M居圖2A和2B中所示的多種實施方式，串聯(lián)設(shè)置的三個閥構(gòu)成了隔膜泵 210。按照五個步驟的循環(huán)驅(qū)動這些閥就可以實現(xiàn)抽吸過程。圖2A表示了一種 三層式，膜件隔膜泵的頂視圖。圖2B表示了該三層式整體膜件P鬲膜泵的側(cè)視 圖。該P禺膜泵包括輸入閥201、隔膜閥203和輸出閥205。應(yīng)當(dāng)注意該隔膜^ 兩個方向上都可以工作，因而輸入閥和輸出閥的指定為任意的。該泵包括具有 蝕刻的流體通道211的流動層209，整體膜件207，以及集管層213。閥的氣密特征使該泵能自動充滿并且除了其它氣體和流^M^卜還能夠抽吸空氣。
才財居各種實施方式，抽吸過程可通過一系列階#狄實施。第一步，輸出閥
205關(guān)閉，輸入閥201打開。第二步，隔膜岡203打開。第三步，輸入閥201 關(guān)閉。第四步，輸出閥205打開。第五步，P禺膜閥203關(guān)閉，通過打開的輸出 閥205抽吸分析物流體。
每次循環(huán)4由吸的量取決于打開的隔膜閥內(nèi)所包含的^^P、，該^^P、又依次取 決于隔膜閥中充氣腔室的大小。因此，可以通過調(diào)節(jié)隔膜閥充氣腔室的大小來 制造為了測量已知在納升至微升,Ji^的流體量而設(shè)計的泵。該隔膜泵能自動充 滿并且能夠向前抽吸流體或者通iH向運行所述驅(qū)動循環(huán)過程向后抽吸流體。 還應(yīng)當(dāng)注意的是，膜件接觸玻璃密封表面處的閥所在位置可以蝕刻成具有凸脊 或者其它的表面修飾，以控制膜件與玻璃表面的粘著性。
發(fā)沐閥還可以用于形成^i^路器、混合器和分流器。應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管以 下構(gòu)造將通過三層式構(gòu)造的文字來說明，但該構(gòu)造也可以用于四層或更多層式 的結(jié)構(gòu)。圖3為一種選路器300的圖示。該選路器包4舌閥301、 303、 305和317, 充，道331、 333、 335、 337和339,流體通道321、 323、 325和327,以及 P鬲膜閥309。該i^器將流體從任一輸入口抽吸到^""輸出口，其取決于在該 抽吸循環(huán)過程中在什么部位驅(qū)動了哪個輸入/輸出閥。同時驅(qū)動兩個或多個輸入 閥可在輸出閥處將幾股不同的流體流';^^成一股流。相反，同時驅(qū)動兩個或多 個輸出閥可在輸出閥處將單股流體流分^A幾股不同的液流。
例如，為使流體從通道327選路到通道321，閥301和305要保持關(guān)閉。 然后如上面所述用閥317、 309和303做為泵。選路器包括;a^和分流流體通道 的功能。為將流體AUa道325和327';^^到通道323，閥303^#關(guān)閉。為 將流體從通道321分流到通道323和327,閥301要4呆持關(guān)閉。而在另一個實 施例中，為將經(jīng)通道327引入的流體選路到通道325,閥303和305 ^f緣關(guān) 閉。打開閥317和301以使流體通iM道327流到通道325。各種設(shè)置方式皆 有可能。
利用整體閥還可以形成混合環(huán)"洛。在一個實施例中，通過流體在裝置的兩 個區(qū)域之間流動可實現(xiàn)〉'^^過考呈。混合過程可用于實現(xiàn)在芯片上進(jìn)行的所有類 型的操怍。圖4為一種"^環(huán)"洛400的圖示。該混/^環(huán)>^或混合器包括閥401、 403和405，流體通道411、 413和415，以及充^道421、 423和425。該環(huán) 路上連接著其它的有閥的通道，向流^4^供通向或來自濕合器的路徑。通itit道413和415可使兩種或多種流量的流體i^A該;^^環(huán)"洛中，并且如上所述， 將^^由吸到循環(huán)中直到這些流體通iiT散作用而^/^。再將該';^^f勿抽吸出該
';^^環(huán)路?；旌线^程&可以通過使流體在兩個儲液池之間來回流動而實現(xiàn)。
圖5A-5C為儲液池500的圖示。圖5A為具有蝕刻的排総室的儲液池頂視 圖。圖5B為該儲液池的側(cè)視圖。圖5C為表示注滿后的儲液池的側(cè)視圖。圖5D 為具有鉆孑U^M室和用于自發(fā)填注/分配過程的泵的大容量儲液池的側(cè)視圖。 該儲液池包含在充氣晶片513上，其中膜件505夾在該充氣晶片513與流體晶 片511之間。通iiit道501儲液池可以注滿或排空。才娥多種實施方式，閥區(qū) 域503中打開的M膜件閥^t儲液池的作用以用于芯片上流體的儲存。充氣 晶片513中腔室的大小決定了儲存在儲液池內(nèi)的流體體積，當(dāng)^口真空時該儲 液池填滿，施加壓力時其排空。
才M居多種實施方式，制造用于儲存大量流體的儲液池時可以用鉆孔來代替 蝕刻充氣腔室，并可直接向該鉆孑Ufe加驅(qū)動壓力或真空?；蛘撸梢?# 連接到隔膜泵上來制造不具有直接充氣連接的儲液池。圖5D表示了一種連接到 泵上的儲液池503。該儲液^M居抽吸的方向被注滿或抽空，其具有可變^K 的優(yōu)點。在一個實施例中，泵例如閥531、 533和535可用于對儲液池503進(jìn)行 填注或分配流體。
具有一個或多個流皿入口的^^膜件儲液^^芯片M器的作用。如 同儲液池一樣，該反應(yīng)器可以利用通過充氣集管晶片^口的直接壓力或真空來 直接引A^物或排出產(chǎn)物。或者，該M器可以利用M的泵、';^器、和/ 或選路器構(gòu)it^間接引A^物或排出產(chǎn)物。才M居多種實施方式，由于^器 的容積受到充氣晶片中腔室503的尺寸限制，在不大幅改變流體晶片內(nèi)結(jié)構(gòu)設(shè) 計的情況下，在裝置的任何部位都可以具有任意容積的反應(yīng)器。而且，才娥芯 片上涉及不同體積反應(yīng)物的反應(yīng)需要，可以部分填注該反應(yīng)器。
大多數(shù)舉性膜件為透氣性的，因而這種'M目前被利用以簡化所有舉性裝 置的流體注入it考呈。
才M居多種實施方式，膜件的透氣性可消除氣泡或著氣穴。當(dāng)向^^膜件反 應(yīng)器或其它流動結(jié)構(gòu)^M區(qū)動真空時，來自于產(chǎn)生氣體的反應(yīng)中的氣泡可以被 消除。例如，透氣性膜件可減少PCR反應(yīng)物在芯片上的熱循環(huán)過程中形成的氣 泡，該氣泡會導(dǎo)lt^^^討的損耗。
復(fù)雜的微流控裝置可包括一些與流動總^f目連接的獨立模塊。在一個實施例中，向多個不同的流體通道提^^析物流似艮有用處。在另一個實施例中，
可將能獲得的多種試劑引入微^空裝置中。圖6是可用于分配分析物流體的總 線閥600的圖示。該總線閥600包括閥601、 603、 605和607，其被制成使流 體從流體總線通道611選路到流體通道621、 623、 625和627中。充^it道631、 633、 635和637分管控制流體分配的閥。典型的總線閥在總線一側(cè)具有死體積。 死體積^it^難以徹底沖洗流體i^l^作之間的總線。根悟多種實施方式，本發(fā) 明的技^4€供的總線閥在總線側(cè)的死體樹艮少或者沒有。這使得流體i^^t 之間的總線能夠被徹底地沖洗，并且防止了在裝置，過程中不同流體之間的
';a^或交叉污染。
微^空裝置才;U勾可以采用各種技術(shù)來制造。才M居多種實施方式，通道特征
被蝕刻進(jìn)玻璃晶片，例如，利用標(biāo)準(zhǔn)的濕法化學(xué)蝕刻技術(shù)。玻璃晶片(厚度1. lmm, 直徑100,)用硝^/it!U匕氫(piranha)清洗(20: 1)并利用LPCVD爐或濺 射系統(tǒng)來涂覆犧牲層(200nm)多晶硅蝕刻掩41^。將Borof loat玻璃晶片或者 Schott D263硅酸硼玻璃晶片用于所述具有三層式或四層式設(shè)計的裝置。多晶 硅沉積之后，用陽性it^膠旋涂該晶片，溫和烘烤并用接觸iW〉斜幾制成圖案。 用Microposit顯影劑去除光刻膠的紫外線膝光區(qū)域。通過在SF6等離子中進(jìn)行 蝕刻去除多晶硅的曝光區(qū)域。在HF溶液中(49%的HF用于Borof loat晶片，1: 1: 2的HF: HC1: H20用于D263晶片)以7 um/min的i^l等向蝕刻晶片，直 到達(dá)到所需的蝕刻深度。
才M居多種實施方式，三層式裝置的流體通道晶片蝕刻成20um深，而四層式 裝置蝕刻成40um深。三層式裝置的集管晶片蝕刻70um深，而四層式裝置在閥 位置鉆孔。然后分別用PRS-3000和SF等離子將剩余的光刻膠和多晶^晶片 上剝?nèi)ァｃ@出貫穿流體和集管晶片的通孔并再次用硝^/it^化氫清潔該晶片。
在一些實施例中，采用三層式設(shè)計的裝置的組裝是通過將PDMS膜件(254um 厚的HT-6135和HT-6240， Bisco Silicones, Elk Grove, IL)加到流體通道 晶片中的蝕刻構(gòu)iUi，并且無論集管上鉆孑Lil蝕刻排維室是如何朝向的，都 直4^^壓具有閥的集管混合玻璃-PDMS流體通it^閥位置橫過PDMS膜。采用四 層式設(shè)計的裝置的組^:通過首先將流體通道晶片熱津給到具有直徑為254um 的M鉆孑Ut孔的210um厚的D263連接晶片上，其中該通孑W立置對應(yīng)通道間隙 的位置。該流體通#連接晶片在真空爐(J. M. Ney， Yucaipa， CA)中以570 匸加熱3. 5h而粘合。然后將得到的含有全玻璃通道的兩層式結(jié)構(gòu)粘合在PDMS膜和集管晶片上。這樣形成的玻璃-PDMS鍵合是可逆的，但仍然足夠牢固以承 受施加到該裝置上的真空和壓力范圍。^E^，在組裝之前通ii^ UV臭氧清潔 器(Jelight Company Inc. ， Irvine, CA)中清潔集管晶片和PDMS膜可獲得不 可逆的玻璃-PDMS鍵合。
上述的微流控裝置的機(jī)構(gòu)可用于實現(xiàn)^^種裝置。可以靈活地設(shè)置包括閥和 泵的構(gòu)造以提供多通道的芯片式實驗室儀器，使其能夠在單個裝置上集成樣品 制備和分析步驟。該微流控平臺特別適合于用作一個能夠?qū)崿F(xiàn)M化病原^f企 測系統(tǒng)的裝置。
測定法(FIA) ^i^t^則。典型:也，4&則會^5J;分析物特異性^體的固定、 與樣品溶液的溫育、連接著酶或焚光團(tuán)的夾心抗體的識別，然后是顯色和;j^則 過程。也可以^^1免疫熒>^^則測定法。然而，^-種測定法都相對具有;^則 局限性。
采用各種形式的基于PCR的基因檢測和類型測定^艮"fi4，因為其具有高 度的特異性和獲得量。然而，盡管基于DNA的PCR方法功能強(qiáng)大，但它們對活 和死的病原體都呈陽性^，這就有可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因而可^^^RNA 目標(biāo)物進(jìn)m&則，因為其能夠很快地降解，也就意味著需要活的目標(biāo)物才能夠 被御'J出，
人們還提出了多種可選擇的4&則方法。已開發(fā)出質(zhì)^^析法通過沖^則中性 脂質(zhì)體、極4生質(zhì)脂體和芽孢特異性生物標(biāo)記來檢測病原體、芽孢以及其它生物 試劑。然而，質(zhì)語分析法的速度、通量和便攜性并不出色而且其特異性還未得 到證實。
對來自于土壤、空氣等的芽孢(例如炭必的稱則是個難題，因為其具有高
大多凄汰進(jìn)的沖^則原理是利用^具有薄膜加熱器和絲熒m^和檢測過程的 硅制微型^器中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時沖^則的。該系^^iM皮擴(kuò)^J'J了一種十 通道的高級核酸分析儀UNAA)以及一種便攜的形式。該系統(tǒng)的各種形式還被 開發(fā)用于軍事上和郵局中。還開發(fā)出了一種具有集成(多微升)樣品處理過程 的GeneXpert樣品制備系統(tǒng)用于進(jìn)行實時PCR分析。
開發(fā)出能夠快速實施自動和復(fù)雜的前述化學(xué)M并定量病原體濃度和抗生 素抗性的便攜式分析儀是一個很大的進(jìn)步。類似地，當(dāng)需要篩選大量樣品或者可肯^"在的受感染個體時，能夠在高通量、多樣品篩選應(yīng)用中快ii^r測和測 定大量樣品的類型并且假陽性率非常^^沐用處。這類自動化臨床分析儀的 ^ 也有所進(jìn)步。在一個實施例中，開發(fā)出了;Ut為脊遏自動分析儀的微型形 式的復(fù)雜微:^空回路系統(tǒng)用于血液臨床分析。還開發(fā)出了一種全面M的分析 儀U鼓升體積身見格)，可用于血液樣品制備用以在微陣列上進(jìn)行HIV分析。該 系統(tǒng)可進(jìn)行包括多個核酸步驟的復(fù)雜測定，并且采用了 > 100 nL的死體積充氣 膜件閥，該閥將在下面作更詳細(xì)的M。
已經(jīng)開發(fā)出透明塑料(lucite)微流控管用于控制溶液在六個不同的免疫 陣列傳感器上流動，該傳感器以小型便攜式系統(tǒng)的形式控制流體，其具有簡單 的減壓系統(tǒng)從而有利于其免疫測定的性能。所開發(fā)的這種形式的系統(tǒng)如，利用 集成式流動系統(tǒng)和纖維光學(xué)生物傳感器毛細(xì)管的Raptor便攜式分析儀，可在十 分紳的操作時間內(nèi)分析四種不同的試劑，人們已經(jīng)認(rèn)識了可尋址陣列的獨特性 質(zhì)從而開發(fā)出一種集成式的疊層微型實驗室，其可以實現(xiàn)自動化電場驅(qū)動免疫 捕獲和DNA雜交陣列分析。例如，赫免疫捕獲細(xì)菌被釋放出用于鏈置換擴(kuò)增 (SDA)，然后進(jìn)行擴(kuò)增志賀樣(Shiga like)毒素基因的雜交分析。然而，其 不能進(jìn)行多樣品分析也沒有研究過檢測的局限性。
盡管常規(guī)的微細(xì)加工是^ kh進(jìn)行的，^SA們已發(fā)5W于化學(xué)和生化分析 來說，玻^(敫流控結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出優(yōu)選的化學(xué)和電泳性能，并且塑料結(jié)構(gòu)的范圍也 在不斷擴(kuò)展。在高通量應(yīng)用中，本發(fā)明的技術(shù)具有徑向的通道設(shè)計，其能夠快 速并行地分析96至384個片段大小或者平行M^布則序分離。在芯片上直接集 成PCR與CE分析并具有DNA酶切和親和捕獲的功能。
才M居多種實施方式，本發(fā)明的微^U空裝置才/^勾可以形成復(fù)雜的通道構(gòu)造， 其能夠制iU空室、閥和CE分析通道的復(fù)雜陣列。這些小型的CE通道與交叉注 射器一起使用有助于實現(xiàn)十分決速的高分辨率電泳分離。差本上在色傳柱或毛 細(xì)管中進(jìn)行的所有"^ft^減小到了芯片的形式，所需的樣品量隨之減少，分 析時間和靈敏性得到了提高。
根據(jù)多種實施方式，本發(fā)明的病原^^企測系統(tǒng)具有靈敏性與特異性和定量 能力相結(jié)合的特征，從而提供了一種特別有用的測定方法。許多病原體在4HA 細(xì)菌量〉103時具有感染性，而K c/ o/wa (霍亂病毒)在經(jīng)口揭入量低于105 時都不會引起癥狀，或者A a/^rac7\f (炭疽桿菌)在量^^多的7jc平上^M皮 認(rèn)為具有影響力。識別菌抹以便將致病菌林與非致病菌林區(qū)分開來，以及鑒定特異性毒素或抗生素抗性基因的存樹于鑒^險性和確定治療方法來說^M艮 關(guān)鍵。此外，能夠確定細(xì)菌的濃度或劑量并且隨著所述鑒定結(jié)果一起進(jìn)行定量
報告不同于背景技術(shù)的 _測定^^瞼，負(fù)y^供重要'^測定^^果。
圖7為一種病原體檢測系統(tǒng)700的一個實施例圖示。分析物通過通道701 引入到免疫親和性捕l^室703、 713和723中，通道731處收集殘余物。才M居 多種實施方式，免疫親和性試劑用于將輸入的細(xì)菌"^^捕獲、集中并分層到 一系列分離的免M室703、 713和723中。該便易的過程將重要的大型界面處 理為微小界面，原先它們是應(yīng)用微流控系統(tǒng)進(jìn)行痕量病原體枱鄰J的一個障礙。 免疫捕獲的第一階^i^提高測定的特異性方面^ij 了重要的作用。為達(dá)到較 高的靈城，病原^M^測系統(tǒng)的^ ]者可接著對存在試劑進(jìn)行基于PCR的重復(fù) 確認(rèn)，還開發(fā)出了利用DNA分析;N勾705、 715和725進(jìn)行的基于特定引物的方 法或者更普通的測U因類型的方法，例如PCR,用以鑒定特定的菌林、毒素 基因的存在以及抗生物素抗性標(biāo)記的存在。在一個實施例中，DNA分析才鳩705、 715和725包括PCR和CE。
才M居多種實施方式，免疫親和性捕微室703、 713和723與PCR腔室絲， 但CE才/U納橫獨立。聯(lián)合免疫捕獲與核酸分析大大提高了個體測定禮瞼的靈敏 度和特異性。
AUt傳學(xué)上區(qū)分病原體和非病原體在許多應(yīng)用中很重要。聯(lián)合免疫捕獲作 為PCR分析的上游端對輸入的細(xì)菌種群具有重要的純化作用，可以處理通常存 在于不純的復(fù)雜"現(xiàn)實"樣品中的PCR抑制物。根據(jù)多種實施方式，病原體才企 測系統(tǒng)將建立起實施i^環(huán)4欠(非漸近的)方案的PCR，這樣可^Mt并報告輸 入的目#^群的數(shù)量。在許多實施例中，處理的樣品可接著供以CE分析。^JD 現(xiàn)^f效^空技術(shù)可以制造廉價、快速和耐用的測定系統(tǒng)，其體積小、便于攜帶、 并且只需要很少的能量、資源和騰技能。
病原體分析儀中包含了 ^A式免疫親和捕自室?？梢証UM捕獲機(jī)構(gòu)， 例如缺、孩沐、凝膠、餅件(monoliths)、以及聚合物。圖8和圖9;i^ 示利用二氧^i ^塊和樣沐實現(xiàn)的免疫捕獲腔室圖示。根據(jù)多種實施方式，免
疫捕 室包括一 系列用二lUt^)^硅酸鈉粘結(jié)劑的〉'^^勿填充晶片孔而制 成的二氧4W媳塊。經(jīng)艦水和沖洗，該硅雖凝結(jié)^5勤交并JUt801、 803、 805和807處形成了不溶的二氧^^姆塊。
根椐多種實施方式，在1. l咖厚的玻璃晶片中形成的每個^iil^直徑為l咖。免疫捕，室與用于引入和排出分析物的通道821相伴隨，晶片內(nèi)的;tm 很容易集成到含有膜件811和813以及閥和泵結(jié)構(gòu)的裝置上。在圖8中，四個 石i^塊801、 803、 805和807通過膜件811和813封閉住。每個'缺的較大硅 表面適合于通過各種有枳^^試劑來化學(xué)W汙生。為進(jìn)一步簡化裝置的制造， 在PDMS非熱津給到其余裝置上之^T以化學(xué)衍生所述，晶片。
在一個實施例中，諸如,或1. 5um的孩i^il樣的才;U勾孚i^口入捕，室中 以便能夠捕獲許多大的物質(zhì)種類，例如芽孢和細(xì)菌。固相捕獲許多大的物質(zhì)種 類對本領(lǐng)域技術(shù)人員來il^已知的，并且其特征曾描述于Weimer, B. C. ， M. L Walsh，C. Beer，R. Koka,以及X. Wang， 2001 Solid Phase Capture Of Proteins, Spores, and Bacteria. 紐/r肌飾ro6/o/柳,67: 1300-1307。在一 些實施例中，為采用樣^N式劑進(jìn)行捕獲，要用圍堰結(jié)構(gòu)來修飾腔室以便提供微 珠的止動件以及孩沐的$ 1入通道。電動式孩i^K床裝填與圍堰孩i^Mt獲對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來^A已知的。或者，可以將具有免疫功能的磁性孩沐引入沒有圍 堰的腔室中。
圖9是表示具有不再密封的脅件的打開閥圖示。才M居多種實施方式，在 區(qū)域901、 903、 905、 907和909處^i口氣動真空以使得分析物沿著通道921流 動通itfc^塊931、 933、 935和937。在所制造的裝置中可以含有^f可數(shù)量的熔 塊。
圖10A是表示分析物捕獲的圖示。4W居多種實施方式，包括三個膜件閥 1001、 1003和1005的泵1000用于抽吸含有寡核苷酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等的分析 物溶^it過一系列免疫捕l^室。
腔室可^^各種才/i4勾來捕獲感興趣的目標(biāo)物。在免疫捕iyt室中捕獲的任
何感興趣的物質(zhì)在》t^皮稱為目標(biāo)物。攜帶目標(biāo)物的流體或物質(zhì)在J^皮稱為分析 物。在一個實施例中，目標(biāo)物為流體分析物中攜帶的沙門氏菌或利斯特氏菌 (Listeria)。
在另 一個實施例中，每個捕mit室填充了含有寡核苷酸探針的粘性聚^f勿 基質(zhì)，以便選擇'lli也結(jié)合目標(biāo)物分子。在DNA分析時，Sanger DM序列延伸產(chǎn) 物，包括高鹽濃度中的引物和聚^S^式劑，電泳通il^疫捕獲腔室，其中該免 疫捕自室中包含了含有MS^苷酸探針的固定化丙烯^^M。捕獲的序 列是這樣選擇的，使只有DNA擴(kuò)增產(chǎn)物被探針捕獲，而引物和聚合酶試劑隨同 鹽^流過該裝置。這就像需要從分析時遇到的復(fù)雜、不純的混合物中純化目標(biāo)物W那樣。
制備具有功能性聚合物捕g質(zhì)的微捕獲腔室的一個可選擇方法包括制備
具有10-20um范圍的孔的餅件，以及制備具有較大的、表面^^了功能性薄 交聯(lián)聚合物層的微細(xì)加工元件(大約100um)的腔室。該方法很有用，因為有 時候^^于填^J'j捕，室中并JUI^K^t于常M^常常缺4X夠的才;L^ 穩(wěn)定性。才娥多種實施方式，多孔(IO-20um)的表面功能性聚^f勿^^件的成
形成:捕旨室中的。 、1 5 'Z
由于聚合過程是利用UV光來實現(xiàn)的，通過 ']法可以在微^4空裝置的^^可 需要區(qū)域形成多孔聚^f勿。利用填絲前體》;^4勿的玻璃芯片的這種"孩瀏法" 聚合過程的動力學(xué)對本領(lǐng)域技^A員來^A已知的，例如描述于Yu, C. ， F. Svec,和J. M. J. Frechet 2000中的Towards stationary phases for chromatography on a microchip: Molded porous polymer monoliths prepared in capillaries by photoinitiated in situ polymerization as separation media for electrochromatography.(在微芯片上進(jìn)行的固相色鐠才支術(shù)通過 M始原位聚合反應(yīng)在毛細(xì)管中制備成型的多孔聚^f勿，件作為電色鐠隔離 介質(zhì))，f/ec"o/7力o/^/s， 21: 120-127，以及Yu， C. , M. Xu, F. Svec,和 J. M. J. Frechet 2002中的Preparation of monolithic polymers with controlled porous properties for microfluidic chip applications using photoinitated free radial polymerization.(利用ife^會自由基聚^^^制 備具有可控多孑L特征的餅件聚^^勿用于微力tl空芯片應(yīng)用)，/ ^/戸^5W,，
40: 755。類似地，可以控制裝置上，件材料的精確位置以及其表面化學(xué)仏貧， 這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的，如描述于Rohr， T. C， C. Yu, H. M. Davey， F. Svec,和J. M. J. Frechet 2001. Simple and efficient mixers prepared by direct polymerization in the channels of microfluidic chips.(通過 在微流控芯片的通道中的直接聚合反應(yīng)制備簡單而有效的混合物)， f/e"ro/ 力o/^/s， 22: 3959。脅件聚^f勿的多孑L4爭性可以通過調(diào)節(jié)致孑U^劑 的組分來實現(xiàn)。
無論4^]具有微細(xì)加工元件的，件還是表面，都可以使用同樣的#方 法來引入所需的4給元件。由于目的在于將抗體固定在這些糾件的孑L^面上， 因》b^的化學(xué)物質(zhì)特別易于與生物聚^4勿發(fā)生反應(yīng)。在一個實施例中，加入表面4^f勿的2-乙烯-4， 4-二曱基吖內(nèi)酯可以與蛋白質(zhì)iiliii^。這樣的才A^) 對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，如描述于Peterson, D. S. ， T. Rohr， F. Svec， 和J. M, J, Frechet, 2002中所述,Enzymatic microreactor-on-a-chip: protein Mapping using trypsin immobilized on porous polymer monoliths molded in channels of microfluidic devices.(酵芯片樣i^I器利用孩i: ;JM空裝置通道中成型的多孔聚^4勿^^件上固定的胰島素作蛋白質(zhì)圖鐠)，力朋/. C力e瓜，74: 4081: 4088?？蓪H'歸的表面(多孑L^^件，或者微細(xì)加工元件)
》'l:A單體溶液中，并且用uv光，裝置從而在于選定區(qū)域上實sy^過程。表
面功能化的程度由a溶液中單體的濃度、，時間，和UV光的強(qiáng)度控制。
在另一個實施例中，胰島素被固定在由2-乙烯-4， 4-二曱基吖內(nèi)酯、二曱 基丙烯酸乙酯和丙烯,或2-甲基丙烯酸羥乙酯構(gòu)成的多孔聚^4勿皿件上。 吖內(nèi)酯的功能是容易與酶的胺和石辦基M形^il定的^f介鍵。在一些實施例 中，脅件優(yōu)化的多孔性特征形成了非常低的背壓，使得能夠^ )簡單的才M勾 進(jìn)行抽吸來既實現(xiàn)Ai容液中固定酶又實現(xiàn)隨后的底物溶液分析。反應(yīng)器的 MicheallS"Menten動力學(xué)特征可以利用低分子量的底物，如N-a-苯曱酰-L-^奇 氨酸乙酯^U^則。
人們詳細(xì)研究了固定化變量，例如溶液中胰島素濃度和吖內(nèi)酯的百分比在
M件中的泛函性作用，以;^A應(yīng)時間對酶活性的作用，和過程變量如底物流
速和在反應(yīng)器中的停流時間的作用。芯片上酶孩汰應(yīng)器的蛋白水解活性在不同 流速下隨著作為底物的熒光標(biāo)記酪蛋白的裂解而得到證實。該整^^議應(yīng)器的 優(yōu)良特,f組可以通過快速流動速率為0.5 uL/min時的朋ii蛋白消化作用來證 實，其中停留時間僅為11.7s。然后利用MALDI-T0FMS ;J^4征消化物，在"3 條可能的肽片斷中識別了 102條，序列;^率達(dá)67%。
已經(jīng)作出了巨大的努力來開發(fā)新型的微細(xì)加工分析裝置及其^/(匕，以制 成微型全面分析系統(tǒng)(Ptas)。這些系鄉(xiāng)^yi供了比原尺寸儀器具有更高通量、 更少的樣品和試劑消耗量、更小尺寸以及更j^t成本的可能性。在微流控裝 置的各種應(yīng)用中，分析技術(shù)，例如電泳、電色譜、涉;sj酶的測定法，以及免疫 測定法都通itit種方式得到了證實。盡管孩";M空芯片4支術(shù)不可否i人取得了成功， 但仍存在一些問題。例如，大多數(shù)的微;iU空芯片特征是開放的通道構(gòu)造。因此， 這些通道的表面積與體積tbf目當(dāng)小。在,于與固相表面發(fā)生^I的應(yīng)用中， 例如在色謙分離、固相提#多相催化中，其可能成為嚴(yán)重的問題。由于只有通道壁可以用于提供所需的相互作用，所述《效型裝置只能處理孩￡量的4^物。
圖IOB是表示使用二維分析系統(tǒng)的圖示。在^NM牛1027捕獲了由具有閥 1001、 1003和1005的泵提供的目標(biāo)物之后，M件1027封閉。在一個實施例 中，每個腔室f^勸口熱以熔化雙鏈DNA并分離出單鏈DNA產(chǎn)物。才財居多種實 施方式，純化作用發(fā)生在120秒內(nèi)，可以錄初的3uLii^僅僅20nL的200倍 濃縮物。每條管線1011、 1013、 1015、 1017、 1019和1021都包括用于控制或 抽吸被捕獲目標(biāo)物的閥以用于進(jìn)一步的分析步驟。
在一個實施例中，測試裝置上提供了捕獲的目標(biāo)物用于PCR和CE分析。利
成測i錄^^i^4爭征包括i;免疫捕微室，其蝕刻進(jìn)具有微細(xì)加工的加熱
器和溫度傳感器的玻璃基fc 2 ) 100-300 nL的聚^miC^應(yīng)腔室，用于擴(kuò) 增從目標(biāo)細(xì)胞裂解所獲得的DNA;以及3)毛細(xì)管電泳微通道，其蝕刻進(jìn)用于分 離和^J則PCR擴(kuò)增子的玻璃_1^反。
4鏈的第四^f爭征，絲DNA預(yù)^^宿/純化腔室也可以加到該裝置上，用于 純^*改的病原體基因組DNA或者，在注入CE微通道之前如果需要的話用于預(yù) 濃縮擴(kuò)增的DNA。盡管先前的研究表明，為進(jìn)行成功的分析，將PCR擴(kuò)增子直 接;iXCE孩域iiJi，可以狄需要這樣額外的復(fù)雜性，但是要獲得高質(zhì)量的電 泳圖讒這種純化過程是必要的。利用^f亥苷酸捕l^t的化學(xué)'瞎可以實5 i廣 增子的純化過程。如果需要純化基因組DNA，可以在純化腔室中填^^f匕的二 氧^ft^封tt,并在PCR之前用作全面捕獲細(xì)菌DNA的基質(zhì)。
集成化的一種方法是在玻璃芯片上僅僅制a疫捕獲、才m純化、PCR、擴(kuò) 增子純化、以及CE的單獨模塊。再利用微通道和各種PDMS閥結(jié)構(gòu)將這些才狄 彼jtbf目接。圖11中給出了一種被制成具有單獨的免疫捕獲和PCR^器的病原 體分析芯片的示意圖。該集成化病原體檢測系統(tǒng)包括免疫親和性捕l^室1101。 分析物通過該免疫親和性捕，室1101引A^該病原^^測系統(tǒng)中。PCR腔室 1103與該免疫親和性捕獲腔室1101 4繊并接收由該免疫親和性捕獲腔室1101 捕獲的目標(biāo)物。CE通道1105與該PCR腔室1103 4喊用以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。 微細(xì)加工的電極1113可用于提供電勢差。還可以具有一個與該免疫捕自室和 /或PCR腔室4^的加熱器(未畫出)。各種閥控制了分析物流動通過該^/f匕 系統(tǒng)。才M居多種實施方式，這些閥為，閥。
盡管在裝置上提供免疫捕獲、PCR、 CE和純^+多財^A—個合理的方案，^#悟多種實施方式建議使用為更簡單的裝置，以便有利于捕l^:率、PCR效
率以及DNA片段的高靈M分離和4&則。盡管免疫捕獲和PCR可以在單獨的腔 室中進(jìn)行，^E^—個實施例中，免疫捕獲和PCR可以相結(jié)合以便簡化裝置和處 理過程。在該實施例中，PCR可以成功地從固體基質(zhì)和固相免疫捕獲試劑中引
發(fā)。在一個實施例中，PCR可以利用免疫標(biāo)記的孩沐iM^行。
圖12是表示聯(lián)合免疫捕獲和PCR腔室1201的圖示。根據(jù)多種實施方式， 該聯(lián)合腔室具有在該納升，室內(nèi)制造的iy^電PiU口熱機(jī)構(gòu)(未畫出)和電阻 式溫度檢測器(RTD) 1205。在一些實施例中，分析物通過輸入口 1211并通過 膜件閥1221引入。利用壓力驅(qū)動流體流動將目標(biāo)病原體固定在腔室1201內(nèi)， 而廢^it過閥1223在出口 1213處被收^M^。病原體固定^，用緩沖液沖 洗該腔室1201以去除松弛附著的細(xì)胞或者非特異性結(jié)合的試劑。
PCR緩沖液要么通過原始的樣品入口 1211引入，要么通過單獨的專用入口 來引入。才^居腔室1201中的目標(biāo)病原體，化學(xué)自劑可直接包含在該PCR緩沖 液中。引入裂解試劑和/或PCR緩沖液之后，用捕獲/PCR腔室中的^U^p熱 器1203將樣品溫度升高到一溫度下，使得病原體從捕11^中同時#^文出并且 才M居試劑種類而發(fā)生溶菌。
最簡單但通常是最有效的，方法是僅^ii行加熱/^卩循環(huán)。只加熱或者 在低濃度的化學(xué),溶劑下加熱時，革蘭氏陰性細(xì)菌和一些具有較薄夕卜部細(xì)胞 膜的真核細(xì)胞更易于裂解。在一些情況下，例如對于芽孢或者革蘭氏陽性細(xì)菌 來說，就可能需要使用能干擾PCR反應(yīng)的較強(qiáng)的,試劑。例如，通常需M 溶菌酶、蛋白酶K、溶葡萄球菌素、和變?nèi)芫貑为毣蛳群蟠?入，以裂解一 些頑固的革蘭氏陽性葡萄球菌和&葡萄球菌菌林。在這些情況下，^JD單獨的免 疫捕獲腔室再加上純化/預(yù)濃縮腔室可以使在細(xì)胞IUf^后PCR擴(kuò)增之前進(jìn)行 DNA的中間捕獲過程。
在該方案的捕獲和^^后，提取的DNA可以通過電泳而驅(qū)動itA純化腔 室，由幾基孩沐吸收而務(wù)賭下來。利用加熱或者改變離子強(qiáng)度可以將純化的DNA 從該純化腔室中釋放出來，并通過電^漸ili^PCR腔室中用于擴(kuò)增。 一旦來自 于IU^細(xì)胞的DNA出J脈具有PCR緩沖液的腔室中，利用微細(xì)加工的加熱器和 溫度傳感器，就可以在該釋放的基因物質(zhì)上直接進(jìn)行PCR 了。
應(yīng)當(dāng)注意在一些情況下，由于其復(fù)雜性或?qū)CR的抑制性，兼有捕獲和PCR 用途的單個腔室會出現(xiàn)問題。在這些特殊的情況下，僅僅需刻尋這兩個階段分開進(jìn)行。在一些實施例中，如^4在的捕^t或孩^M印制了PCR反應(yīng)或者如
果輸入的樣品引入了不能洗去或中和的PCR抑制劑時，就應(yīng)該這沖W坎。這樣， 棒改的DNA可以從捕自室中的勤醉細(xì)菌中被抽吸到或者電泳到單獨的PCR反 應(yīng)器中用于分析。
一旦完成了 PCR，可以將擴(kuò)增子直接注入到CE孩域道中用于分離和4&則， 根據(jù)所需的分辨率，可采用在分離基質(zhì)中的嵌入染料或者熒光標(biāo)記的引物并變 性分離M。在一些情況下，在注入CE樣at道之前，可引入DNA純化腔室以便 脫鹽和濃縮擴(kuò)增的DNA。通過將擴(kuò)增的DNA電泳i^A純化腔室，其中它結(jié)合到
羧似I^M戈者斜亥苷酸捕I^ (與所需目標(biāo)物互補的捕H^f亥苷酸)，實現(xiàn) 了純化過:程。結(jié)合^進(jìn)行洗滌并利用孩W口熱器^ii布顯度相關(guān)的釋放，然后 通過注入CE微通道的十字，對,和脫鹽化的PCR擴(kuò)增子進(jìn)行電泳用以分離和糊。
采用^^膜件閥建立病原^^r測和分析系統(tǒng)的裝置構(gòu)造可以有很大的變 化。圖13A是表示一種病原^"測和分析系統(tǒng)設(shè)計的一個實施例圖示。該設(shè)計 包括三個玻璃層，包括通ii^1303，連接層1305,和集管層1309。連接層1305 與集管層1309之間設(shè)置了一PDMS膜件層。集管層1309包括了可以向膜件1307 施加真空的才W勾用以控制閥機(jī)構(gòu)。
層1301上設(shè)置了電源接頭，層1311上具有集管卡盤層。通道層1303包括 免疫捕獲/PCR/純化腔室和CE微通道，以及位于該晶片的Ji4面的加熱器。根 據(jù)多種實施方式，通itJ: 1303與含有玻^4占孔作為閥連接的薄玻璃晶片1305 熱鍵合。PDMS閥/泵膜件1307可逆或者不可逆地與該多層疊層結(jié)構(gòu)相鍵合。底 部蝕刻的集管層1309將真空或壓力傳遞給裝置上的閥和泵。
利用i賄的薄膜技術(shù)制造溫控元件提供了構(gòu)建測i錄置的第 一種可行途 徑。然而，通itijl用IUt40錫UTO)加熱器可制氐該裝置的加工難度。ITO加 熱器以其低電阻率、任選的透明度、以及與玻璃J^反的兼容性而著稱。這些加 熱器可以沉積在同一個晶片上作為溫度傳感器，以避免需要背面加工和電鍍形 成加熱器。加熱器可以直接設(shè)置在腔室內(nèi)用于但選的熱傳遞，或者其可以設(shè)置 成抵靠在腔室上以便通iii皮璃晶片傳導(dǎo)熱能。ITO的^i4的透明度也使得可以 在流^^b逸道的上方選擇電加熱器引線的路線，而不^礙樣品或PCR擴(kuò)增子 的可艦絲松則。
圖13B是表示根悟多種實施方式的微細(xì)加工過程圖示。1381和1383表示了微細(xì)加工過程。在一些實施例中，先清潔玻璃晶片(550ium厚的D263，購自 Schott of Yonkers， NY)，然后通過直^5茲控'減射系統(tǒng)(購自于UHV Sputtering of SanJose， CA)將2000 A的無定形名i^;^Li。在該晶片的一面。利用購自Karl Suss of Waterbury Center, VT的接觸i^)^Mf購自Shipley 1818 of Marlborough, MA的;^ij膠旋涂上并形成光刻圖案，然后利用購自Plasma Therm of St. Petersburg, FL的平行M應(yīng)離子蝕刻(RIE)系統(tǒng)中的SF6將底層硅
蝕刻掩^t選擇地去除掉。
在一些實施例中，流體通道、電泳通道、和PCR腔室在49y。的氫氟酸中被 蝕刻成36Mm的深度。用購自Flashcut CNC of Menlo Park, CA、具有金剛石 鉆頭的CNC磨機(jī)鉆出PDMS閥的儲液池入孔(直徑1. 5 mm)和流動通孔(直徑 0.020")。然后用晶片劃片^M夸晶片切割成兩個20 rnrnx75 ,的滑片。
要形成RTD和電極，首先可將200 A的Ti和2000 A的Pt (UHV)賊涂在 550)am厚的D263晶片上。利用購自Suss Microtec of Waterbury Center, VT 的接觸W^4M夸購自Shipley (SJR 5740 ) of Marlborough, MA的厚光刻膠 旋涂上并形成圖案。4財居多種實施方式，在70'C下將it^月辨千2小時。利用 熱王水(3: l的HCl: HN03， 90'C )蝕刻金屬可形成RTD元件。M式加熱器 的形威^^通過首先利用購自于Perkin Elmer of Wellesiey， MA的RF'減射系 統(tǒng)將200 A的Ti和2000 A的Pt的多層薄膜沉積在RTD晶片的背面。將厚光 刻膠旋涂在該面，利用背面接觸^t〉斜幾(Suss)使該晶片形成圖案，然后烤 干。利用購自Technic(TG 25 E) of Anaheim, CA的亞石jfl^金電鍍液以4. 3mA/cm2 的電流密度^^r電鍍在所述Ti/Pt種層上23分鐘，厚度達(dá)5mm，從而制^f口 熱器導(dǎo)線。
才娥多種實施方式，去除^，]膠并利用厚;^iJM背面重新形成圖案。利 用購自Veeco Instruments of Plainview, NY的離子束蝕刻系統(tǒng)將力口熱元件蝕 刻成Ti/Pt種層。將RTD/加熱器晶片切割成兩個25咖x 75 ,的滑片(Disco )。 在一些實施例中，利用購自Centurion VPM， J. M. Ney, of Yucaipa， CA的可 編程真空爐^4占孑Ut道晶片與RTD/加熱器晶片熱^^合。
盡管J^反上可以包括單個的免疫捕獲、PCR、和CE系統(tǒng)，但本發(fā)明的技術(shù) 認(rèn)識到，開發(fā)用于臨床診斷的并行免疫捕獲、PCR、和CE系統(tǒng)也是有效的。在 一個實施例中， 一種便攜式病原體分析儀包括三個連續(xù)的免疫捕獲/PCR系統(tǒng)， 目標(biāo)在于抬3則樣品中的三種不同的病原體。直接并行排列了流控系統(tǒng)、加熱器
24電路、溫度傳感器以及用于三個系統(tǒng)的電泳裝置，單個顯微載玻片具有足夠的 表面積來制造三個完全并行的系統(tǒng)。
在另一個實施例中，提供了用于臨床診斷的糾并行免疫捕獲/PCR系統(tǒng)。
這種能夠分析來自多個個體或者威ia個體的多種不同試劑的能力提供了 一種強(qiáng)
有力的方法來鑒別和在疫病學(xué)上追蹤感染物。圖14是一種徑向平行的免疫捕獲 /PCR裝置1400的部分圖示。圍繞圓環(huán)軸排列的^f可具有多個免疫捕獲和DNA 分析機(jī)構(gòu)的系統(tǒng)或裝置在j^皮稱為徑向平行裝置。
才W居多種實施方式，該設(shè)計包括財?shù)姆治銎麝嚵?，每個分析器含有一個 與CE分析器集成的免疫捕ll/PCR腔室1423。樣品連續(xù)i4itii^置的給定小單 元內(nèi)的所有腔室，使得連續(xù)捕獲多種試劑。裝置的單個小單元1401、 1403、 1405、 1407、 1409、 1411能夠并行地分析不同的物質(zhì)。儲B 1447和1445提供了微 珠的輸入和孩沐的排出。儲液池1443和1441分別為常規(guī)的毛細(xì)管電泳的陰極 儲液池和廢液儲液池。
將腔室相互連接用于，式免疫親和捕獲。閥1431和1433在,環(huán)4上 封閉了所微室。閥1435和1437從孩沐引入和廢艦狄封閉了腔室。CE微 通道連接著常規(guī)的中心陽極，以利用現(xiàn)有的旋轉(zhuǎn)共焦熒光掃描儀(未畫出)進(jìn) #^則。提供了聯(lián)合捕 室1423的平行陣列和具有引線1451的加熱器，以 及改進(jìn)的閥和泵的耐用陣列。由于與腔室1423相伴隨的加熱器和溫度傳感器在 分析通iUi平行工作，使用簡單的環(huán)形加熱器就綽綽有余了 。因而不再需要單 個的加熱器和溫度傳感器，從而提供了經(jīng)濟(jì)和有效的平行病原^^則系統(tǒng)。
盡管上面為簡^^L以單數(shù)形^笛述了許多元件和加工方法，^a^領(lǐng)域技 ^A員應(yīng)當(dāng)明白，也可以使用多個元件和重復(fù)的過程來實踐本發(fā)明的技術(shù)。
盡管本發(fā)明是才M居其特定的實施方式^^^i兌明的，^M頁域技術(shù)人員 工應(yīng)明白在不偏離發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下，可以對所公開的實施方式的形式 和細(xì)節(jié)作出改變。例如，上述實施方式可以利用各種材料來實現(xiàn)。因此，本發(fā) 明的范圍應(yīng)當(dāng)參考所附的權(quán)利要求來確定。
權(quán)利要求
1.一種病原體檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括集成在微流控裝置上的免疫捕獲腔室，該免疫捕獲腔室可用于捕獲通過微流控通道提供給所述免疫捕獲腔室的目標(biāo)物；與所述免疫捕獲腔室相伴隨的DNA分析機(jī)構(gòu)，該DNA分析機(jī)構(gòu)集成在所述微流控裝置上，所述DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
2. 權(quán)利要求1所述的病原^^則系統(tǒng)，其中所述DNA分析才/U勾包括PCR 和CE。
3. 權(quán)利要求2所述的病原^(^"測系統(tǒng),其中PCR包含在與所述免疫捕雌 室相分離的腔室中。
4. 權(quán)利要求2所述的病原^M^則系統(tǒng)，其中PCR包含在所狄疫捕雞室中。
5. 權(quán)利要求2所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述PCR的腔室用于擴(kuò)增/^^斤 需目標(biāo)4勿，所得到的DNA。
6. 權(quán)利要求3所述的病原體枱側(cè)系統(tǒng)，進(jìn)一步包括蝕刻的毛細(xì)管電泳孩誠 道，用于分離和^"測PCR擴(kuò)增子。
7. 權(quán)利要求6所述的病原^^測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括DNA預(yù),與純化腔室， 用于純^#^的病原體基因組DNA，或者在注入CE獨通iUi之前用于脫鹽^f貞 ^t擴(kuò)增的DNA。
8. —種病原禍4企測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括^M數(shù)^空裝置上的免疫捕皿置，該免疫捕g置可用于捕自過微;iU空通道4^供的目標(biāo)物；與所述免疫捕l^置相伴隨的DNA分析裝置，該DNA分析裝置|1^在所述 微^M空裝置上，所述DNA分析裝置可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
9. 權(quán)利要求8所述的病原^^則系統(tǒng)，其中所述DNA分析裝置包括與所述免疫捕l^置相分離的PCR腔室。
10. 權(quán)利要求9所述的病原^^測系統(tǒng)，所述PCR的腔室用于擴(kuò)增從所需目 標(biāo)物裂解所得到的DNA。
11. 位于M裝置上的病原^^則系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括 M在該整沐裝置上的多個免疫捕自室，該免疫捕，室可用于捕獲通過微刷空通道提供給所il^疫捕，室的目標(biāo)物；與所iiit疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)，所述多個DNA分析;tM勾 集成在該整體裝置上，所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
12. 權(quán)利要求11所述的病原^^則系統(tǒng)，其中所述多個DNA分析才贈包括 PCR和CE。
13. 權(quán)利要求11所述的病原^^則系統(tǒng)，其中PCR是在與所述多個免疫捕 室相分離的腔室中進(jìn)行的。
14. 權(quán)利要求13所述的病原體抬鄰J系統(tǒng)，進(jìn)一步包括多個燭刻的毛細(xì)管電 》Wtit道，用于分離和^ri則PCR擴(kuò)增子。
15. 權(quán)利要求14所述的病原^^r測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括多個絲的DNA預(yù)濃 縮與純化腔室，用于純^^改的病原體基因組DNA，或者在注入CE微通iUi之 前用于脫鹽和預(yù)濃縮擴(kuò)增的DNA。
16. 權(quán)利要求11所述的病原^^則系統(tǒng)，其中所狄疫捕艦室進(jìn)一步可 用于純化和濃縮目標(biāo)物。
17. 權(quán)利要求11所述的病原體抬r測系統(tǒng)，其中所述多個微細(xì)加工的免疫捕 自室被制成以##所選擇的抗體。
18. 權(quán)利要求17所述的病原^#^則系統(tǒng)，其中所選擇的抗體由孩沐、艦、 溶膠^^交、^^交、或者聚^4勿，件所##。
19. 權(quán)利要求17所述的病原^^則系統(tǒng)，其中所選擇的抗體由直接形絲 捕刻空室內(nèi)的多孔、表面功能化聚^4勿成型塊所##。
20. 權(quán)利要求19所述的病原^(4^r測系統(tǒng)，其中所狄型^A通過含有單體 和致^L^劑的前體"^物的光聚合反應(yīng)而形成的。
21. 權(quán)利要求17所述的病原^#"測系統(tǒng)，其中所述多個免疫捕雜室被制 成徑向平行的方式。
22. 權(quán)利要求21所述的病原^^則系統(tǒng)，進(jìn)一步包括與所述多個免疫捕獲 腔室偶聯(lián)的環(huán)形加熱器，該環(huán)形加熱器可用于加熱所述多個免疫捕自室以釋 方W斤捕獲的目標(biāo)物。
23. 權(quán)利要求17所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述多個免疫捕獲腔室在玻 璃層上制成。
24. 權(quán)利要求23所述的病原^M&則系統(tǒng)，其中所i^L璃層與餅?zāi)ぜ优悸?lián)。
25.權(quán)利要求23所述的病原^f^則系統(tǒng)，其中所itJ^璃層包括多個蝕刻通 道，該蝕刻通道可用于提供流體流動的路徑。
26，權(quán)利要求25所述的病原體枱鄰j系統(tǒng)，其中所述玻璃層和充氣層夾著所 艦件層。
27. —種用于病原體分析的方法，該方法包括通過^^M裝置上的微^空通道將流體分析物提供給多個免疫捕M^室；在免疫捕獲腔室中捕獲與所述流體分析物相關(guān)的目標(biāo)物；以及 利用與多個免疫捕，室相伴隨的多個DNA分析;fcM勾對所述目標(biāo)物進(jìn)行DNA 分析，所迷多個DNA分析才;U勾M在所述整體裝置上。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所迷多個DNA分沖;HM勾包括PCR和CE。
29. 權(quán)利要求27所述的方法，其中PCR才;U勾包含在與所迷多個免疫捕皿 室相分離的腔室中。
30. 權(quán)利要求29所述的方法，其中所述多個DNA分析才;U勾包括PCR的腔室， 用于擴(kuò)增^MJ斤需目標(biāo)物IU^所得到的DNA。
31. 權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括多個蝕刻的毛細(xì)管電泳孩腿道， 用于分離和4&則PCR擴(kuò)增子。
32. 權(quán)利要求31所述的方法,進(jìn)一步包括多個城的DNA預(yù)鵬/純化腔室， 用于純^#放的病原體基因組DNA,或者在注入CE微通iUi之前用于脫鹽， 濃縮擴(kuò)增的DNA。
33. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述免疫捕獲腔室進(jìn)一步可用于純化和 濃縮目標(biāo)物。
34. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述多個微細(xì)加工的免疫捕獲腔室被制 成以^#著所選擇的抗體。
35. 權(quán)利要求34所述的方法，其中所選擇的抗體由微珠、熔塊、溶膠^l交、 鄉(xiāng)交、或者聚^4勿^^件所##。
36. 權(quán)利要求34所述的方法，其中所選擇的抗體由直接形M捕自室內(nèi) 的多孔、表面功能化聚^4勿成型塊州緣。
37. —種用于檢測病原體的設(shè)備，該設(shè)備包括通過|1^*裝置上的微:^空通道將流體分析物提供給多個免疫捕， 室的裝置；用于捕獲與所述流體分析物相關(guān)的目標(biāo)物的裝置；以及 利用與多個免疫捕l^空室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)對所述目標(biāo)物進(jìn)行DNA 分析的裝置，所述多個DNA分析;f/^勾M在所述M裝置上。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于實現(xiàn)微流控分析裝置的方法和設(shè)備。與集成的充氣集管相伴隨的整體彈性膜件可以設(shè)置有和驅(qū)動多種流控結(jié)構(gòu)的密集陣列，例如用于隔離、選路、混合、分流和存儲流體量的結(jié)構(gòu)。該流控結(jié)構(gòu)可用于實施病原體的監(jiān)測和分析系統(tǒng)，包括集成式免疫親和性捕獲和分析，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和毛細(xì)管電泳(CE)分析。將分析物溶液引入并且泵壓通過微細(xì)加工腔室中的一系列免疫親和性捕獲基質(zhì)，其中具有靶向各類微生物有機(jī)體的抗體，例如細(xì)菌、病毒和細(xì)菌芽孢的抗體。該免疫親和性腔室能夠捕獲、純化和富集目標(biāo)物以便進(jìn)行進(jìn)一步的分析步驟。
文檔編號C12M1/34GK101613660SQ20091016047
公開日2009年12月30日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者A·斯克利, B·佩格爾, C·N·劉, E·拉加利, R·A·馬蒂斯, R·布拉澤, W·H·格羅弗 申請人:加州大學(xué)評議會