呼吸道病原體的雙重?zé)晒鈖cr檢測引物、探針、反應(yīng)液及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種能快速檢測呼吸道16項(xiàng)病原體的雙重?zé)晒釶CR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） 檢測引物、探針、反應(yīng)液及試劑盒，屬于核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)熱呼吸道癥候群(FRS)是現(xiàn)階段我國最主要的一組傳染病之一，通過十一五和 十二五'艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治'科技重大專項(xiàng)實(shí)施，我國建立了覆蓋全國 的跨部門、跨學(xué)科傳染病防控支撐技術(shù)平臺，實(shí)現(xiàn)了傳染病應(yīng)急處置能力由點(diǎn)到面的提升。 我國發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測方案(2012版)要求發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室對所采集的 標(biāo)本中的鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支氣管肺泡灌洗液及胸腔穿刺液標(biāo)本，進(jìn)行流感病 毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒Π型、副流感病毒m型、人偏肺病 毒、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒NL63、冠狀病毒229E、冠狀病毒0C43、人博卡病毒、鼻病毒、腸道 病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團(tuán)菌的核酸檢測。
[0003]呼吸道疾病可由幾十種病原體引起，病原體的最終確認(rèn)需要大量的操作步驟，費(fèi) 時費(fèi)力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的是提供一種能同時能快速檢測呼吸道16項(xiàng)病原體的雙重?zé)晒?PCR檢測試劑盒。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：
[0006] -種用于呼吸道病原體的雙重?zé)晒釶CR檢測的PCR引物，所述PCR引物擴(kuò)增下述16 種呼吸道病原體中的至少一種的基因突變位點(diǎn)：呼吸道合胞病毒、腸道病毒、冠狀病毒 NL63、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒229E和冠狀病毒0C43、副流感病毒1型和2型、鼻病毒和副流 感病毒3型、人博卡病毒和人偏肺病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體、腺病毒和嗜肺軍團(tuán)菌;所 述PCR引物為以下16對中的至少一對：SEQIDN0.1和SEQIDN0.2;SEQIDN0.4和SEQID N0·5;SEQIDN0·7和SEQIDN0·8;SEQIDN0·10和SEQIDN0·11;SEQIDN0·13和SEQID N0·14;SEQIDN0·16和SEQIDN0·17;SEQIDN0·19和SEQIDN0·20;SEQIDN0·22和SEQ IDNO.23;SEQIDNO.25和SEQIDNO.26;SEQIDNO.28和SEQIDNO.29;SEQIDNO.31和 SEQIDNO.32;SEQIDNO.34和SEQIDNO.35;SEQIDNO.37和SEQIDNO.38;SEQID NO.340和SEQIDNO.41;SEQIDNO.43和SEQIDNO.44;SEQIDNO.46和SEQIDNO.47。
[0007]本發(fā)明還提出一種用于檢測呼吸道病原體基因片段的TaqMan探針，所述探針用于 檢測上述呼吸道病原體中的至少一種;所述探針包括下述基因序列中的至少一個：SEQID N0.3、SEQIDN0.6、SEQIDN0.9、SEQIDN0.12、SEQIDN0.15、SEQIDN0.18、SEQID N0.21、SEQIDN0.24、SEQIDN0.27、SEQIDN0.30、SEQIDN0.33、SEQIDN0.36、SEQID N0.39、SEQIDN0.42、SEQIDN0.45、SEQIDN0.48。
[0008]本發(fā)明還提出一種用于檢測呼吸道病原體的PCR反應(yīng)液，用于檢測上述病原體中 的至少一種;上述的PCR引物和TaqMan探針。
[0009]本發(fā)明還提出一種用于檢測呼吸道病原體的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征是： 包括:預(yù)分裝的如權(quán)利要求3所述的PCR反應(yīng)液，RT-PCR酶，陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
[0010] 本發(fā)明開發(fā)的檢測試劑可在2小時內(nèi)完成16項(xiàng)呼吸道癥候群病原體篩查，大幅度 節(jié)約檢測時間和成本。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)，非常容易在各口岸實(shí)驗(yàn)室推廣。
[0012] 該項(xiàng)檢測平臺和方案還可以推廣至腸道傳染病、蟲媒傳染病等病原譜篩查，具有 廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0013]圖1是8組雙重焚光定量RT_PCR(reverse transcription PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)陽性質(zhì) 控品的擴(kuò)增曲線。
[0014]圖2是A組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0015]圖3是B組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0016]圖4是C組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[00Π]圖5是D組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0018]圖6是E組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0019]圖7是F組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0020]圖8是G組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0021]圖9是Η組雙重?zé)晒舛縍T-PCR陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
[0022]圖10是RSV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0023]圖11是HEV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0024]圖12是NL63樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0025]圖13是HKU1樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0026]圖14是229E樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0027]圖15是0C43樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0028]圖16是PIV1樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0029]圖17是PIV2樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0030]圖18是hRV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[00311圖19是PIV3樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0032]圖20是hBoV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0033]圖21是hMPV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0034]圖22是MP樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0035]圖23是CP樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0036]圖24是AdV樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0037]圖25是LP樣本及陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。
[0038]圖26是在96孔板中的分布組合方式示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0040]為了能快速準(zhǔn)確完成對項(xiàng)呼吸道癥候群病原體篩查并節(jié)約成本，本發(fā)明下述實(shí)施 例意在開發(fā)出一種能同時能快速檢測呼吸道16項(xiàng)病原體的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒。該方 法主要依賴采用預(yù)分裝技術(shù)和雙重?zé)晒釶CR檢測的方法來實(shí)現(xiàn)。
[0041]本發(fā)明下述實(shí)施例中將詳述描述一種能同時能快速檢測呼吸道16項(xiàng)病原體的雙 重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括:預(yù)分裝PCR反應(yīng)液，RT-PCR酶，1個陽性質(zhì)控品和1個陰性質(zhì)控 品。
[0042]其中，所述預(yù)分裝PCR反應(yīng)液的設(shè)計(jì)組合:該項(xiàng)篩查技術(shù)由8個雙重?zé)晒馓结楶CR反 應(yīng)完成，其組合是A組（呼吸道合胞病毒和腸道病毒HEV)、B組（冠狀病毒NL63和冠狀病毒 HKU1)、C組(冠狀病毒229E和冠狀病毒0C43)、D組（副流感病毒1型和2型）、E組(鼻病毒和副 流感病毒3型）、F組(人博卡病毒和人偏肺病毒）、G組(肺炎支原體和肺炎衣原體）、H組(腺病 毒和軍團(tuán)菌）。在96孔板中的分布按以下組合方式：
[0043]其中1-10列代表10個待測樣本，11和12列分別代表陽性和陰性對照。
[0044] 所述PCR反應(yīng)液設(shè)有用于檢測呼吸道合胞病毒、腸道病毒、冠狀病毒NL63、冠狀病 毒HKU1、冠狀病毒229E、冠狀病毒0C43、副流感病毒1型、副流感病毒2型、鼻病毒、副流感病 毒3型、人博卡病毒、人偏肺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒和嗜肺軍團(tuán)菌的引物和 TaqMan(-種RNA探針)探針，其中用于呼吸道合胞病毒檢測的引物序列分別為SEQIDN0:1 和SEQIDN0:2，TaqMan探針序列為SEQIDN0:3,熒光標(biāo)記為FAM;用于腸道病毒檢測的引 物序列分別為SEQIDN0:4和SEQIDN0:5，TaqMan探針序列為SEQIDN0:6,熒光標(biāo)記為 HEX;用于冠狀病毒NL63檢測的引物序列分別為SEQIDN0:7和SEQIDN0:8，TaqMan探針序 列為SEQIDN0:9,熒光標(biāo)記為FAM;用于冠狀病毒HKU1檢測的引物序列分別為SEQIDNO: 10和SEQIDNO: 11，TaqMan探針序列為SEQIDNO: 12,熒光標(biāo)記為HEX;用于冠狀病毒229E 檢測的引物序列分別為SEQIDNO: 13和SEQIDNO: 14，TaqMan探針序列為SEQIDNO: 1