專利名稱：高產(chǎn)油脂皮狀絲孢酵母突變株b3及其ems和紫外線復(fù)合誘變選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用甲基磺酸乙酯和紫外線復(fù)合誘變皮狀絲孢酵母，并結(jié)合磷酸香草 醛法初篩技術(shù)和索氏抽提法復(fù)篩技術(shù)，選育出產(chǎn)油脂率高且遺傳穩(wěn)定的皮狀絲孢酵母突變 株B3 (Trichosporon cutaneum B3)，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)是一種半知菌酵母。該菌的細(xì)胞形態(tài)多 樣，有真菌絲和假菌絲，可以形成節(jié)孢子，對數(shù)生長期主要以長絲狀存在。微生物油脂又稱為單細(xì)胞油脂(SCO)，其組成與植物油類似，主要為中性脂、 游離脂肪酸、磷脂及不皂化物，因其特殊功能而具有潛在的工業(yè)開發(fā)價值。產(chǎn)油微生 物(Oleaginousmicroorganisms)是指油脂含量能超過生物總量20 %的微生物，主 要包括酵母、霉菌、微藻和細(xì)菌，但以酵母菌和霉菌類真核微生物居多，如產(chǎn)油油脂酵 母(Lipomyces lipofer)、斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、亞羅解脂酵母 (Yarrowia lipolytics)、|^_占衾工—(Rhodotorulaglutinis)(Mortierella isabellina)等。產(chǎn)油微生物資源豐富，油脂含量高，能在多種培養(yǎng)條件下生長，可利用和轉(zhuǎn) 化廢棄木質(zhì)纖維素資源，保護(hù)環(huán)境，進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)有著巨大的潛力。微生物油脂 通過與低碳醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)可生產(chǎn)生物柴油，通過與多碳醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)，可用于生 產(chǎn)可生物降解的潤滑油、溶劑油、油漆和油墨溶劑、表面活性劑、粘接劑等產(chǎn)品，高值化潛力 大。部分微生物油脂含有多不飽和脂肪酸，是生產(chǎn)具有高附加值單細(xì)胞油脂的重要原料。國外利用微生物生產(chǎn)油脂的研究始于20世紀(jì)40年代。20世紀(jì)80年代初，日本成 功獲得了發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸技術(shù)，結(jié)束用蓖麻油裂解合成十三碳二元酸歷史。最新文 獻(xiàn)報道在氮源缺陷型培養(yǎng)基中，深黃被孢霉表現(xiàn)出了顯著的生長活性(其生物量達(dá)35. 9g/ L)和高糖攝入量，即使培養(yǎng)基的初始糖濃度很高(達(dá)100g/L)條件下亦是如此。氮源耗盡 后，真菌菌體中大量積累脂肪(達(dá)菌體干重的50% 55% )。國內(nèi)20世紀(jì)60年代就有霉 菌和酵母產(chǎn)油脂的報導(dǎo)，20世紀(jì)90年代和21世紀(jì)初有較多研究。如2003年施安輝等進(jìn)行 了粘紅酵母GRL513發(fā)酵生產(chǎn)油脂研究，結(jié)果表明其油脂含量達(dá)菌體干重的67. 2%。清華大 學(xué)吳慶余等通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲得了脂類含量高達(dá)細(xì)胞干重55%的異養(yǎng)藻細(xì)胞。為了獲得更高產(chǎn)油率的微生物，紫外、EMS等物理和化學(xué)等誘變是常采用的手段。 1993年，研究人員以深黃被孢霉As 3. 3410為出發(fā)菌株，紫外誘變獲得的突變株在IOL罐中 發(fā)酵生產(chǎn)GLA，其油脂含量達(dá)菌體干重的44. 7%，其中GLA含量達(dá)9. 44%。1998年，有人以 拉曼被孢霉SM541為原始菌株，經(jīng)過紫外線與氯化鋰復(fù)合誘變獲得突變株SM54129，其生物 量由12. 6g/L提高到28. 8g/L，油脂含量由5. 8g/L提高到15. 7g/L，氨基酸含量由321mg/L 增加到623mg/L，傳代實驗表明，SM54129具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一株高產(chǎn)油脂酵母_皮狀絲孢酵母突變株B3。本發(fā)明所述的菌株皮狀絲孢酵母B3，Trichosporon cutaneum B3，保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢武漢大學(xué)，中國保藏號為CCTCC NO. M 2010076, 保藏日期為2010年4月9日，搖瓶培養(yǎng)其油脂含量達(dá)53. 52%，是野生菌株的1. 78倍。所述的皮狀絲胞酵母有以下微生物學(xué)特征1.形態(tài)學(xué)上特征為①細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形或者柱形的，對數(shù)生長期主要以長絲狀存在；②大小為 3 6X4 30 μ m ；③菌落為白色，呈奶酪狀，光滑；2.該菌株的生理生化特征為①本菌株可以利用合成培養(yǎng)基生長；②培養(yǎng)時間5 7天；③對氧氣的需求好 氣；④生長pH范圍5. 5 6. 5 ；⑤生長最適宜溫度28 30°C ；⑥生成生物油脂主要 成份C16、C18系飽和和不飽和脂肪酸，為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、棕擱油酸中的一 種或幾種。本發(fā)明還提供皮該狀絲孢酵母菌種B3的選育方法，即利用甲基磺酸乙酯和紫外 線誘變方法進(jìn)行復(fù)合誘變、結(jié)合磷酸香草醛法進(jìn)行初篩以及索氏抽提法進(jìn)行復(fù)篩和驗證、 選育出一株產(chǎn)油脂率高且遺傳穩(wěn)定的突變菌株。本發(fā)明所述選育方法包括如下步驟①菌懸液的制備將保存的菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3天后，在裝有玻璃珠的三 角瓶內(nèi)無菌水洗活化菌種，盡可能洗下菌體，將少量菌絲打碎制成菌懸液，濃度控制在約 lOO-lOOOcfu/mLo②甲基磺酸乙酯和紫外線復(fù)合誘變③初篩通過磷酸香草醛法對高產(chǎn)油脂皮狀絲孢酵母進(jìn)行初篩。④復(fù)篩用索氏抽提法抽提出油脂，通過比較單位菌體油脂量的多少來進(jìn)行復(fù)篩。⑤驗證高產(chǎn)菌株將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)4次，每次都用與復(fù)篩一樣的方法——索氏抽 提法，對菌株產(chǎn)油率穩(wěn)定性進(jìn)行驗證。⑥高產(chǎn)菌株的保藏將篩選出的一株高產(chǎn)油脂和遺傳性穩(wěn)定的皮狀絲孢酵母B3采用甘油管法和冷凍 干燥法進(jìn)行保藏。本發(fā)明所述方法的具體步驟為①取馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 4天的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株，用pH 6. 0的 無菌磷酸緩沖液配制菌懸液，經(jīng)10 15倍系列稀釋達(dá)到濃度100 lOOOcfu/mL備用；②用EMS溶液誘變處理①中培養(yǎng)的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株0. 5 5小時后，加入 1 10mL25%硫代硫酸納終止劑，5 30分鐘后將培養(yǎng)液置于無菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘 變；③取0. ImL經(jīng)②步驟處理的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)6 24小時，
5然后置于28 30°C培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)3 4天；④將步驟③中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培 養(yǎng)條件，收集菌體，稀釋到660nm下相同的OD值；⑤用硫酸_磷酸香草醛反應(yīng)分析經(jīng)④步驟培養(yǎng)及稀釋的菌體中油脂含量，并挑出 含油量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；⑥將初篩中挑選出來的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，離心收集菌體用蒸餾水洗三次，再將菌體在60士5°C下干燥24小時，待其恒重后，用索 氏抽提法進(jìn)行油脂的提取，計算單個細(xì)胞的含油率，挑選出高產(chǎn)產(chǎn)油的菌株；⑦將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)5 8次，每次采用⑥的方法對菌株的穩(wěn)定 性進(jìn)行驗證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株。本發(fā)明EMS和紫外線復(fù)合誘變處理的出發(fā)菌株培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期。本發(fā)明所述化學(xué)誘變劑EMS的誘變濃度為1 % 8 %。本發(fā)明紫外照射誘變采用15W或30W紫外燈，提前預(yù)熱20 30分鐘后，將菌液置 于距離紫外燈20 30cm處進(jìn)行紫外照射60 120秒。本發(fā)明所述的液體培養(yǎng)基為改良后的合成培養(yǎng)基葡萄糖30 100g/L， NH4NO3O. 2 0. 6g/L,酵母浸粉 0. 5 4. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, KH2PO4O. 75g/L, CaCl2 · 2H20 0. 4g/L, pH 為 5. 5 6. 5，余量為水。本發(fā)明所述誘變后菌株B3的搖瓶培養(yǎng)條件為溫度28 30°C、搖床轉(zhuǎn)速200 300
轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明利用皮狀絲孢酵母對化學(xué)和物理誘變比較敏感，生命力比較頑強(qiáng)，有較大 的產(chǎn)油脂潛力，提出了利用EMS和紫外線復(fù)合誘變手段，結(jié)合磷酸香草醛反應(yīng)初篩技術(shù)和 細(xì)胞油脂索氏抽提法復(fù)篩技術(shù)，選育出產(chǎn)油脂率高且遺傳穩(wěn)定的皮狀絲孢酵母突變株B3， 利用這種方法可以有效的提高皮狀絲孢酵母的產(chǎn)油脂能力，為利用其發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞油脂 和轉(zhuǎn)化生物柴油提供了優(yōu)良菌種。突變菌株皮狀絲孢酵母B3可用于單細(xì)胞油脂及生物柴 油的生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明方法流程圖；圖2所示為野生出發(fā)菌株CYPJ06的生長與產(chǎn)油特性圖；圖3所示為誘變菌株皮狀絲孢酵母B3生長與產(chǎn)油特性具體實施例方式以下結(jié)合實施實例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1 皮狀絲孢酵母的甲基磺酸乙酯和紫外線復(fù)合誘變①取馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的皮狀絲孢酵母CYPJ06，用pH為6. 0的無菌磷 酸緩沖液制成菌懸液，經(jīng)10倍系列稀釋達(dá)到濃度為lOO-lOOOcfu/mL備用。②取2mL化學(xué)誘變劑EMS與3mL無水乙醇和15mL pH為6. 0的磷酸緩沖液配成 10%的濃度，在每支裝有5mL皮狀絲孢酵母菌懸液的試管中加入2mL濃度為10%的化學(xué)誘變劑稀釋液，最終配成3%的誘變?nèi)芤骸＂壅T變混合液放在振蕩儀中振蕩1小時，使菌與誘變試劑充分的混合，取出后加 入ImL終止劑(25%硫代硫酸納溶液)。④硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)5分鐘之后，將反應(yīng)液置于無菌培養(yǎng)皿中，使之成為 Imm厚的薄層，培養(yǎng)皿放于磁力攪拌器上，再置于紫外燈下(預(yù)先已經(jīng)滅過菌)進(jìn)行紫外照 射，用15W紫外燈(提前預(yù)熱30分鐘)，距離30cm進(jìn)行紫外照射90s。⑤在裝有馬鈴薯固體培養(yǎng)基的平板中加入0. ImL的上述誘變過的菌懸液，進(jìn)行涂 布處理，使菌能夠均勻分布在平板上，黑暗處理6小時后，放入28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天。凡 碰到EMS試劑的器具放濃度為2%硫代硫酸鈉溶液中浸泡1天去毒后使用。皮狀絲孢酵母誘變后的初步篩選①將誘變后在馬鈴薯培養(yǎng)基中生長起來的菌落挑出，另取野生出發(fā)菌作為對照， 接入150mL三角瓶中，每瓶裝液量為50mL，液體培養(yǎng)基成分(葡萄糖40g/L、酵母粉lg/L、 KH2PO4O. 75g/L、NH4NO3O. 5g/L、CaCl2 · 2H20 0. 4g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、余量為水，pH 自 然)，在搖床上控制相同的培養(yǎng)條件，條件為28°C、200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)6天。②離心收集菌體，用蒸餾水洗三次，再統(tǒng)一稀釋到660nm下相同的OD值，以便控制 相同濃度。③取IOmL菌懸液，于4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，離心10分鐘，去上清液，用蒸餾水 定容至2mL，充分振蕩使之成為懸浮液。④取100 μ L菌懸液(對照去蒸餾水)，加入一帶塞試管中，加入2mL的濃度為 18mol/L的濃H2SO4，置于沸水浴中孵化lOmin。⑤取出試管，置于常溫條件下水浴5min，加入5mL磷酸-香草醛試劑(0. 12g香草 醛溶解于20mL蒸餾水中，用85%的磷酸定容至IOOmL)，37°C條件下保溫15分鐘。⑥取出置于常溫條件下水浴10分鐘，于530nm的波長下測反應(yīng)液的OD值。通過 比較OD的大小來判別含油量多少，OD越大，表明油脂量越多。對照野生出發(fā)菌，計算產(chǎn)率 的提高，將含油量高的挑出進(jìn)行保藏。皮狀絲孢酵母誘變后的復(fù)篩①菌體的收集a.將初篩中挑選出來的菌株，另取野生出發(fā)菌作為對照，接入馬鈴薯固體培養(yǎng)基 上擴(kuò)大培養(yǎng)3天。b.將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌株接入150mL三角瓶中，每瓶裝液量為50mL，液體培養(yǎng)基成分 (葡萄糖 40g/L、酵母粉 lg/L、KH2P040. 75g/L、NH4NO3O. 5g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 4g/L,MgSO4 ·7Η20 0. 4g/L、余量為水，ρΗ自然)，在搖床上控制相同的培養(yǎng)條件，條件為28°C、200轉(zhuǎn)/分鐘，培 養(yǎng)6天。c.離心收集菌體，用蒸餾水洗三次，再將菌體在60°C下干燥24小時，待其恒重后， 用索氏抽提法進(jìn)行油脂的提取。②油脂的抽提用索氏抽提法抽提油脂a.將干燥好的菌體用研缽研磨，使細(xì)胞盡可能破碎。b.將取磨碎后的干菌體全部移入重為Ml的濾紙包內(nèi)，稱濾紙和菌體的總重記為 M2。
c.將濾紙包放入索氏提取器的抽提管內(nèi)，連接干凈的接收瓶，加入石油醚，于 75°C水浴加熱回流6h。d. 6小時后，將抽提好的接收瓶接于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，回收溶劑。e.待接收瓶蒸完溶劑后，用少量石油醚試劑將留在瓶底的油脂洗下，重復(fù)洗五次， 以盡可能全部的洗下，清洗液裝于衡重為M3的EP管中。f.將裝有油脂的EP管開口放于干燥箱中60°C烘干，使石油醚揮發(fā)，24小時后取 出，置于60°C烘箱中烘至恒重稱量。稱得油脂和EP管的總重量記為M4，計算油脂得率。菌體量=M2-M1產(chǎn)油率=[(M4-M3)/ (M2-M1) ] X 100g.對照野生出發(fā)菌，計算產(chǎn)率的提高，將含油量高的挑出進(jìn)行保藏。篩選所得高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株B3經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，其油脂含量達(dá)53. 52%，是野生菌 株的1.78倍，具體見圖2和3。實施例2 ①取馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 4天的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株，用pH 6. 0的 無菌磷酸緩沖液配制菌懸液，經(jīng)10 15倍系列稀釋達(dá)到濃度500cfu/mL備用；②用濃度為5%的EMS溶液誘變處理①中培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的皮狀絲孢酵母 出發(fā)菌株0. 5 5小時后，加入5mL25%硫代硫酸納終止劑，5 30分鐘后將培養(yǎng)液置于無 菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘變；用15W紫外燈，提前預(yù)熱20 30分鐘后，將菌液置于距離紫 外燈20 30cm處進(jìn)行紫外照射60 120秒。③取0. ImL經(jīng)②步驟處理的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)6 24小時， 然后置于28 30°C培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)3 4天；④將步驟③中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的 培養(yǎng)條件，收集菌體，稀釋到660nm下相同的OD值，所述的液體培養(yǎng)基為改良后的合成培 養(yǎng)基葡萄糖 60g/L，NH4NO3O. 5g/L，酵母浸粉 3g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L，KH2PO4O. 75g/L， CaCl2 · 2H20 0. 4g/L, pH 為 5. 5 6. 5，余量為水。⑤用硫酸-磷酸香草醛反應(yīng)分析經(jīng)④步驟培養(yǎng)及稀釋的菌體中油脂含量，并挑出 含油量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；⑥將初篩中挑選出來的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，離心收集菌體用蒸餾水洗三次，再將菌體在60士5°C下干燥24小時，待其恒重后，用索 氏抽提法進(jìn)行油脂的提取，計算單個細(xì)胞的含油率，挑選出高產(chǎn)產(chǎn)油的菌株；⑦將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株搖瓶培養(yǎng)5 8次，每次采用⑥的方法對菌株的穩(wěn)定 性進(jìn)行驗證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株B3。誘變后菌株B3的搖瓶培養(yǎng)條件為溫度 28 30°C、搖床轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分鐘。篩選得到突變菌株B3形態(tài)學(xué)上特征為細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形或者柱形的，對 數(shù)生長期主要以長絲狀存在；大小為3 6 X 4 30 μ m ；菌落為白色，呈奶酪狀，光滑；生理 生化特征為本菌株可以利用合成培養(yǎng)基生長；培養(yǎng)時間5 7天；對氧氣的需求好氣； 生長PH范圍5. 5 6. 5 ；生長最適宜溫度28 30°C ；菌體生成生物油脂主要成份C16、 C18系飽和和不飽和脂肪酸，為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、棕擱油酸中的一種或幾種。實施例3
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①取馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 4天的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株，用pH 6. 0的 無菌磷酸緩沖液配制菌懸液，經(jīng)10 15倍系列稀釋達(dá)到濃度lOOcfu/mL備用；②用濃度為5%的EMS溶液誘變處理①中培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的皮狀絲孢酵母 出發(fā)菌株0. 5 5小時后，加入10mL25%硫代硫酸納終止劑，5 30分鐘后將培養(yǎng)液置于 無菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘變；用15W紫外燈，提前預(yù)熱20 30分鐘后，將菌液置于距離 紫外燈20 30cm處進(jìn)行紫外照射60 120秒。③取0. ImL經(jīng)②步驟處理的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)6 24小時， 然后置于28 30°C培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)3 4天；④將步驟③中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的 培養(yǎng)條件，收集菌體，稀釋到660nm下相同的OD值，所述的液體培養(yǎng)基為改良后的合成培 養(yǎng)基葡萄糖 30g/L，NH4NO3O. 6g/L，酵母浸粉 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L，KH2PO4O. 75g/L， CaCl2 · 2H20 0. 4g/L, pH 為 5. 5 6. 5，余量為水。⑤用硫酸_磷酸香草醛反應(yīng)分析經(jīng)④步驟培養(yǎng)及稀釋的菌體中油脂含量，并挑出 含油量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；⑥將初篩中挑選出來的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，離心收集菌體用蒸餾水洗三次，再將菌體在60士5°C下干燥24小時，待其恒重后，用索 氏抽提法進(jìn)行油脂的提取，計算單個細(xì)胞的含油率，挑選出高產(chǎn)產(chǎn)油的菌株；⑦將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株搖瓶培養(yǎng)5 8次，每次采用⑥的方法對菌株的穩(wěn)定 性進(jìn)行驗證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株B3。誘變后菌株B3的搖瓶培養(yǎng)條件為溫度 28 30°C、搖床轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分鐘。經(jīng)顯微形態(tài)觀察和油脂成分分析，突變菌株B3形態(tài)學(xué)特征和菌體生物油脂成分 同于實施例2。實施例4:①取馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 4天的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株，用pH 6. O的 無菌磷酸緩沖液配制菌懸液，經(jīng)10 15倍系列稀釋達(dá)到濃度lOOOcfu/mL備用；②用濃度為5%的EMS溶液誘變處理①中培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的皮狀絲孢酵母 出發(fā)菌株0. 5 5小時后，加入10mL25%硫代硫酸納終止劑，5 30分鐘后將培養(yǎng)液置于 無菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘變；用30W紫外燈，提前預(yù)熱20 30分鐘后，將菌液置于距離 紫外燈20 30cm處進(jìn)行紫外照射60 120秒。③取0. ImL經(jīng)②步驟處理的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)6 24小時， 然后置于28 30°C培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)3 4天；④將步驟③中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培 養(yǎng)條件，收集菌體，稀釋到660nm下相同的OD值，所述的液體培養(yǎng)基為改良后的合成培養(yǎng) 基葡萄糖 100g/L，NH4NO3O. 2g/L，酵母浸粉 4. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L，KH2PO4O. 75g/L， CaCl2 · 2H20 0. 4g/L, pH 為 5. 5 6. 5，余量為水。⑤用硫酸_磷酸香草醛反應(yīng)分析經(jīng)④步驟培養(yǎng)及稀釋的菌體中油脂含量，并挑出 含油量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；⑥將初篩中挑選出來的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，離心收集菌體用蒸餾水洗三次，再將菌體在60士5°C下干燥24小時，待其恒重后，用索氏抽提法進(jìn)行油脂的提取，計算單個細(xì)胞的含油率，挑選出高產(chǎn)產(chǎn)油的菌株；⑦將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株搖瓶培養(yǎng)5 8次，每次采用⑥的方法對菌株的穩(wěn)定 性進(jìn)行驗證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株B3。誘變后菌株B3的搖瓶培養(yǎng)條件為溫度 28 30°C、搖床轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分鐘。經(jīng)顯微形態(tài)觀察和油脂成分分析，突變菌株B3形態(tài)學(xué)特征和菌體生物油脂成分 同于實施例3。
權(quán)利要求
皮狀絲孢酵母突變菌株B3是從土壤中分離得到的皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)CYPJ06野生菌株突變而來，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO.M 2010076，保藏日期為2010年4月9日，其是由所述野生菌株經(jīng)甲基磺酸乙酯和紫外線復(fù)合誘變篩選得到的具有產(chǎn)油脂率高和遺傳穩(wěn)定的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的皮狀絲孢酵母突變菌株B3，其特征在于形態(tài)學(xué)上特征為細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形或者柱形的，對數(shù)生長期主要以長絲狀存 在；大小為3 6X4 30 μ m ；菌落為白色，呈奶酪狀，光滑；生理生化特征為本菌株可以利用合成培養(yǎng)基生長；培養(yǎng)時間5 7天；對氧氣的需 求好氣；生長PH范圍5. 5 6. 5 ；生長最適宜溫度28 30°C ；生成生物油脂主要成份 C16、C18系飽和和不飽和脂肪酸，為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、棕擱油酸中的一種或幾 種。
3.—種EMS和紫外線復(fù)合誘變選育高產(chǎn)油脂酵母的方法，其特征在于包括如下步驟①菌懸液的制備將保存的菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)3天后，在裝有玻璃珠的三 角瓶內(nèi)無菌水洗活化菌種，盡可能洗下菌體，將少量菌絲打碎制成菌懸液，濃度控制在 100-1000cfu/mL ；②甲基磺酸乙酯和紫外線復(fù)合誘變；③初篩通過磷酸香草醛法對高產(chǎn)油脂皮狀絲孢酵母進(jìn)行初篩；④復(fù)篩用索氏抽提法抽提出油脂，通過比較單位菌體油脂量的多少來進(jìn)行復(fù)篩；⑤驗證高產(chǎn)菌株將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)4次，每次都用與復(fù)篩一樣的方法——索氏抽提法， 對菌株產(chǎn)油率穩(wěn)定性進(jìn)行驗證；⑥高產(chǎn)菌株的保藏將篩選出的一株高產(chǎn)油脂和遺傳性穩(wěn)定的皮狀絲孢酵母B3采用甘油管法和冷凍干燥 法進(jìn)行保藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變育種方法，其特征在于包括如下步驟①取馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 4天的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株，用pH6. O的無菌 磷酸緩沖液配制菌懸液，經(jīng)10 15倍系列稀釋達(dá)到濃度100 lOOOcfu/mL備用；②用EMS溶液誘變處理①中培養(yǎng)的皮狀絲孢酵母出發(fā)菌株0.5 5小時后，加入1 10mL25%硫代硫酸納終止劑，5 30分鐘后將培養(yǎng)液置于無菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘變；③取0.ImL經(jīng)②步驟處理的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA平板上，黑暗培養(yǎng)6 24小時，然 后置于28 30°C培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)3 4天；④將步驟③中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，收集菌體，稀釋到660nm下相同的OD值；⑤用硫酸-磷酸香草醛反應(yīng)分析經(jīng)④步驟培養(yǎng)及稀釋的菌體中油脂含量，并挑出含油 量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；⑥將初篩中挑選出來的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 7天，控制相同的培養(yǎng)條件， 離心收集菌體用蒸餾水洗三次，再將菌體在60士5°C下干燥24小時，待其恒重后，用索氏抽提法進(jìn)行油脂的提取，計算單個細(xì)胞的含油率，挑選出高產(chǎn)產(chǎn)油的菌株；⑦將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)5 8次，每次采用⑥的方法對菌株的穩(wěn)定性進(jìn) 行驗證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株。
5.根據(jù)權(quán)利3要求所述的誘變育種方法，其特征在于化學(xué)誘變劑EMS的誘變濃度為 8%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變育種方法，其特征在于EMS和紫外線復(fù)合誘變處理的出 發(fā)菌株培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期。
7.根據(jù)權(quán)利3或4或5要求所述的誘變育種方法，其特征在于紫外照射誘變采用15W 或30W紫外燈，提前預(yù)熱20 30分鐘后，將菌液置于距離紫外燈20 30cm處進(jìn)行紫外照 射60 120秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的誘變育種方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基為 改良后的合成培養(yǎng)基葡萄糖30 100g/L, NH4NO3O. 2 0. 6g/L，酵母浸粉0. 5 4. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, KH2PO4O. 75g/L, CaCl2 · 2H20 0. 4g/L, pH 為 5. 5 6. 5，余量為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的誘變育種方法，其特征在于誘變后菌株B3的搖瓶 培養(yǎng)條件為溫度28 30°C、搖床轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)油脂皮狀絲孢酵母突變株B3及其EMS和紫外線復(fù)合誘變選育方法。突變菌株皮狀絲孢酵母B3保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO.M2010076，保藏日期為2010年4月9日。本發(fā)明以皮狀絲孢酵母CYPJ06野生菌株為出發(fā)株，利用甲基磺酸乙酯和紫外線誘變方法進(jìn)行復(fù)合誘變，結(jié)合磷酸香草醛法進(jìn)行初篩以及索氏抽提法進(jìn)行復(fù)篩和驗證，選育出一株產(chǎn)油脂率高且遺傳穩(wěn)定的突變菌株-皮狀絲孢酵母菌種B3，利用這種方法可以有效的提高皮狀絲孢酵母的產(chǎn)油脂能力，為利用其發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞油脂和轉(zhuǎn)化生物柴油提供了優(yōu)良菌種。
文檔編號C12R1/645GK101955888SQ20101021026
公開日2011年1月26日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者張志斌, 曾慶桂, 朱篤, 沈曉蜜, 顏日明 申請人:朱篤