專利名稱：一種適用于底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于底泥中微生物群落 結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法。
背景技術(shù)：
河流或湖泊中的底泥是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是大量微生物類群的棲息 地，這些微生物類群在湖泊進(jìn)化演替以及營養(yǎng)元素循環(huán)等方面發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前， 有關(guān)底泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究已成為微生物生態(tài)學(xué)研究中的熱點領(lǐng)域。但 是，由于自然界中存在的許多微生物不可培養(yǎng)，依靠傳統(tǒng)的顯微鏡觀察和分離培養(yǎng)來研 究微生物的方法難以快速、全面的對湖泊沉積物中的微生物進(jìn)行研究。近年來，隨著分 子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了一些新的微生物生態(tài)學(xué)研究方法，如自動核糖體基因間隙 分析(Automated ribosomal intergenicspacer analysis, ARISA)，變性梯度凝膠電泳 (Denaturing gradient gelelectrophoresis， DGGE)以及末端限制性片段長度多態(tài)性 (Terminal restrictionfragment length polymorphisms,T-RFLP)等，這些方法的共同之
處是突破了原有的微生物分離培養(yǎng)的過程限制，能夠更加全面的分析自然界中存在的各種
微生物。另外，這些基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)一般需要先從底泥中提取出DNA，然后再進(jìn) 行進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。因此，DNA提取質(zhì)量的好壞，會直接影響到微生物群落結(jié)構(gòu)的 分析結(jié)果。通常底泥成分復(fù)雜，難以直接提取到高濃度、高質(zhì)量的DNA。另外，底泥中包含的 腐質(zhì)酸、重金屬等物質(zhì)會干擾后續(xù)的PCR反應(yīng)，必須在DNA提取階段予以去除。目前大多數(shù) 學(xué)者使用的DNA提取方法有的無法有效去除底泥中的腐質(zhì)酸等干擾物質(zhì)，給后續(xù)的PCR擴(kuò) 增帶來困難，有的需要使用高成本的核酸吸附柱。因此，探索簡便、高效、低成本的DNA提取 方法仍然是微生物生態(tài)學(xué)研究所面臨的難題。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明提供了一種從底泥中提取DNA的簡便、高效的方法，可直接用于 底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。 技術(shù)方案一種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，提取步驟為
a.用TENP buffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮于PBSbuffer中；
b.將經(jīng)步驟a預(yù)處理的底泥樣品在-S(TC和65t:反復(fù)凍溶后加入溶菌酶，在37°C 水浴lh，所述溶菌酶最終濃度為lmg/mL ; c.向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，在55t:水浴1.5h，所述蛋白酶 K最終濃度為0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸鈉最終濃度為1% (w/v); d.步驟c所得樣品在室溫下離心后取上清液，向其中加入等體積的酚氯仿異
戊醇混合液，振蕩混勻，所述混合液中各物質(zhì)的體積比為25 : 24 : i; e.步驟d所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入等體積的氯仿異戊醇混 合液，混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 : 1;
3
f.步驟e所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入預(yù)冷的異丙醇在_20°〇沉 淀2h; g.步驟f所得樣品在4t:條件下離心去上清，向沉淀中加入預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀
三次，再離心去乙醇； h.將樣品在空氣中自然風(fēng)干，用TE緩沖液溶解DNA保存于-2(TC。
—種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，提取步驟為稱取0. 5g濕重的 底泥樣品置于5mL滅菌后的離心管中，加入3mL TENP buffer,所述TENP buffer的配方為 50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl， 0. 01g/mLPVPP， pHlO. 0，漩渦振蕩8min， lOOOOrpm離 心5min，棄上清，在沉淀中再加3mL TENP buffer,按上述方法再洗滌兩次，最后加3mL的 PBS buffer,所述PBS buffer配方為8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HP04， 0. 24g KH2P04，:^# 于1L水中，pH7. 4 ;將預(yù)處理之后的沉積物樣品置于-S(TC和65t:反復(fù)凍溶三次，向樣品中 加入溶菌酶，溶菌酶的終濃度為lmg/mL，在37t:水浴lh ;向樣品中加入蛋白酶K和十二烷 基磺酸鈉，蛋白酶K的終濃度為0. 2mg/mL，十二烷基磺酸鈉的終濃度為1 % (w/v)，在55°C 水浴1. 5h，每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻；樣品在室溫下lOOOOrpm離心5min， 取出500iiL上清液置于一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液， 酚氯仿異戊醇的體積比為25 : 24 : 1，輕輕振蕩、混勻；室溫下14000rpm離心25min，
取出400iiL水相置于一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，氯仿異戊醇的
體積比為24 : 1 ;室溫下14000rpm離心25min，取出300iiL水相置于一新離心管中，加 入200 ii L預(yù)冷的異丙醇，在-20。C沉淀2h ;在4。C條件下，14000rpm離心25min，去上清， 向沉淀中加入lmL 70X體積濃度的冷乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心10min，去乙醇，再用 同樣方法洗滌沉淀兩次；倒掉乙醇，在空氣中自然風(fēng)干，用50ii L TE緩沖液溶解DNA，保存 于-20。C，所述TE緩沖液配方為10mM Tris-HCl， lmM EDTA， pH8. 0。 有益效果本方法可有效去除底泥中存在的腐質(zhì)酸等雜質(zhì)，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增實 驗的順利開展提供了有利的條件。 本方法操作簡便，所用到的試劑均為常規(guī)生化試劑，不需要使用價格昂貴的DNA 吸附柱，降低了實驗成本。


圖1為應(yīng)用本方法提取得到的DNA電泳圖譜；其中1 8號泳道為某湖泊不同 采樣點底泥樣品中提取得到的DNA條帶，9號泳道為A-Hind III DNAMarker，最大片段為 23. 1Kb。 圖2為應(yīng)用本方法提取的DNA為模版，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 得到的電泳圖譜。其中1 8號泳道分別為應(yīng)用提取的1 8號總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所 得的電泳條帶，9號用到為DL 2000DNA Marker。 圖3為應(yīng)用其它方法提取得到的DNA電泳圖譜；其中1 8號泳道為某湖泊不同 采樣點底泥樣品中提取得到的DNA條帶，9號泳道為A-Hind III DNAMarker，最大片段為 23. 1Kb。
具體實施方式

材料 (1)湖泊底泥樣品； (2)三羥基甲基氨基甲烷，乙二銨四乙酸，聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，氯化鈉，氯化 鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，蛋白酶K，溶菌酶，十二烷基磺酸鈉，酚，氯仿，RNase A，異戊 醇，異丙醇，無水乙醇； (3) TENP緩沖液:50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl，O. 01g/mLPVPP， pHlO. 0 ;
(4)PBS緩沖液8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HP04，0. 24g KH2P04，溶于1L水中， pH7. 4 ; (5)DNA抽提緩沖液100mM Tris-HCl， lOOmM EDTA， 100mMNa3P04， 1. 5MNaCl， 1 % CTAB(w/v)。 DNA純度的檢測方法用分光光度計測定OD26。/OD28。，與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
實施例1 稱取0. 5g底泥樣品(濕重)置于5mL滅菌后的離心管中，加入3mL TENPbuffer， 漩渦振蕩8min， lOOOOrpm離心5min，棄上清，在土壤顆粒沉淀中再加3mL TENP buffer,按 上述方法再洗滌兩次，最后加3mL的PBS buffer。將預(yù)處理之后的底泥樣品置于_80"和 65t:反復(fù)凍溶三次，向樣品中加入溶菌酶(最終濃度為lmg/mL)，在37t:水浴lh。向樣品中 加入蛋白酶K(最終濃度為0. 2mg/mL)和十二烷基磺酸鈉(SDS)(最終濃度為l%，w/v)，在 55t:水浴1. 5h (每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻)。在室溫下10000rpm離心5min，
取出500ii L上清液置于一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液(體
積比為25 : 24 : 1)，輕輕振蕩、混勻。室溫下14000rpm離心25min，取出400iiL水相置于 一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液(體積比為24 : 1)。室溫下14000rpm 離心25min，取出300 y L水相置于一新離心管中，加入200 y L預(yù)冷的異丙醇，在-2(TC沉 淀2h。在4t:條件下，14000rpm離心25min，去上清，向沉淀中加入lmL 70%體積濃度的冷 乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心10min，去乙醇，再用同樣的方法洗滌沉淀兩次。倒掉乙醇， 在空氣中自然風(fēng)干，用50ii L TE緩沖液(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0)溶解DNA，保存 于-20。C。 將提取得到的總DNA用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果在紫外燈下拍照，圖 譜見圖1。 用紫外分光光度計測定所提取的DNA在260nm和280nm處的吸光度，計算出0D26。/ 0D28。的平均值為1. 82，屬于純DNA的OD26。/OD28。 " 1. 8的范圍，可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)。 實施例2 將實施例1中提取得到的DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，使用 美國Bio-Rad公司的PCR擴(kuò)增儀，采用細(xì)菌的16S rRNA基因V3區(qū)的通用引物對 GC-F341禾P R518進(jìn)行擴(kuò)增，引物具體序列為F341 (5 ' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 '); R518(5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ' ) ， GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)(5 ' -CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC-3')。(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)
50 ii L的PCR反應(yīng)體系包括DNA模板50ng、正反向引物各20pmo1、200 y M dNTP、10 X PCR buffer (不含MgCl2) 5 ii L、 1. 5mM的MgCl2、 1U的ExTaqDNA聚合酶和適量的雙蒸水 補(bǔ)足50iiL。 PCR反應(yīng)采用降落式PCR策略，艮卩94t:預(yù)變性5min，前20個循環(huán)為94t: lmin， 65 55°C lmin和72°C 3min(其中每個循環(huán)后復(fù)性溫度下降0. 5°C )，后10個循環(huán)條件為 94°C lmin，55°C lmin和72 °C 3min，最后在72"C下延伸8min，4t:保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果在紫外燈下拍照，圖譜見圖2。從圖中可以看出，采用實施例 1所述方法提取得到的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后都得到了清晰、明亮的條帶，說明按實施例1所述 方法提取得到的DNA可直接用于PCR擴(kuò)增。
實施例3 稱取0. 5g底泥樣品(濕重)，同時加入5mL DNA抽提緩沖液(100mMTris-HCl， pH8. 0， 100mM EDTA， pH8. 0， 100mM Na3P04緩沖液，pH8. 0， 1. 5M NaCl， 1% CTAB， w/v)和蛋白 酶K(終濃度為200ii g/mL)，混合均勻，于搖床中水平振蕩(37°C，225rpm)約30min后，加入 lmL TE(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0)和溶菌酶(終濃度為lmg/mL)，繼續(xù)振蕩30min， 再加0.5mL 20% (W/V)的SDS，經(jīng)65。C水浴30min后加入2%的PVPP (w/v) ， 10000rpm離心 10min，將上清液移入新的離心管，沉淀重復(fù)抽提2次，步驟為往沉淀中加入DNA抽提緩沖 液及20%的SDS(w/v) ，65"水浴10min， 10000rpm離心10min，收集3次抽提的上清液于同 一離心管中，加入RNaseA(終濃度為200 y g/mL)，在37。C下作用15min，加入等體積酚氯 仿異戊醇(25 : 24 : l)溶液輕輕混勻，15000rpm離心15min，將上層水相移入新的離心 管，加入0. 6倍體積異丙醇，于-20°C中沉淀lh。在4°C ， 12000rpm條件下離心10min，棄上 清，沉淀用70%體積濃度乙醇洗兩次，溶解于50 ii L TE緩沖液中，于-2(rC保存。
將提取得到的總DNA用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果在紫外燈下拍照，圖 譜見圖3。 用紫外分光光度計測定所提取的DNA在260咖和280咖處的吸光度，計算出OD26。/OD28。
的平均值為1.66，說明其中含有蛋白等雜質(zhì)。 序列表 〈110>河海大學(xué) 〈120〉 一種適用于底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法 〈130〉 〈141>2009-10-22 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211〉 17 〈212>DNA 〈213>人工引物 〈400〉 1 cctacgggag gcagcag 17
〈210>2
〈211〉 17
〈212>DNA〈213〉人工引物〈400>2attaccgcgg ctgctgg〈210>3〈211〉40〈212>DNA<213>人工序列〈400>3cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggc
17
40
權(quán)利要求
一種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，其特征在于提取步驟為a.用TENP buffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮于PBSbuffer中；b.將經(jīng)步驟a預(yù)處理的底泥樣品在-80℃和65℃反復(fù)凍溶后加入溶菌酶，在37℃水浴1h，所述溶菌酶最終濃度為1mg/mL；c.向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，在55℃水浴1.5h，所述蛋白酶K最終濃度為0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸鈉最終濃度為1％(w/v)；d.步驟c所得樣品在室溫下離心后取上清液，向其中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，所述混合液中各物質(zhì)的體積比為25∶24∶1；e.步驟d所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液中氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1；f.步驟e所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入預(yù)冷的異丙醇在-20℃沉淀2h；g.步驟f所得樣品在4℃條件下離心去上清，向沉淀中加入預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀三次，再離心去乙醇；h.將樣品在空氣中自然風(fēng)干，用TE緩沖液溶解DNA保存于-20℃。
2. —種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，其特征在于提取步驟為稱取 0. 5g濕重的底泥樣品置于5mL滅菌后的離心管中，加入3mLTENP buffer,所述TENP buffer 的配方為50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl， 0. Olg/mL PVPP， pHlO. 0，漩渦振蕩8min， 10000rpm離心5min，棄上清，在沉淀中再加3mL TENP buffer,按上述方法再洗滌兩次，最 后加3mL的PBS buffer,所述PBS buffer配方為8g NaCl，O. 2g KCl，1.44g Na2HP04，0. 24g K^P(V溶于IL水中，pH7. 4 ;將預(yù)處理之后的沉積物樣品置于-S(TC和65。C反復(fù)凍溶三 次，向樣品中加入溶菌酶，溶菌酶的終濃度為lmg/mL，在37t:水浴lh ;向樣品中加入蛋白 酶K和十二烷基磺酸鈉，蛋白酶K的終濃度為0. 2mg/mL，十二烷基磺酸鈉的終濃度為1%， 在55t:水浴1. 5h，每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻；樣品在室溫下10000rpm離 心5min，取出500iiL上清液置于一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混 合液，酚氯仿異戊醇的體積比為25 : 24 : 1，輕輕振蕩、混勻；室溫下14000rpm離心 25min，取出400 y L水相置于一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，氯仿異 戊醇的體積比為24 : 1 ;室溫下14000rpm離心25min，取出300iiL水相置于一新離心管 中，加入200 ii L預(yù)冷的異丙醇，在-2(TC沉淀2h ;在4。C條件下，14000rpm離心25min，去 上清，向沉淀中加入lmL 70%濃度的冷乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心10min，去乙醇，再用 同樣方法洗滌沉淀兩次；倒掉乙醇，在空氣中自然風(fēng)干，用50 ii L TE緩沖液溶解DNA，保存 于-20。C，所述TE緩沖液配方為10mM Tris-HCl， lmM EDTA， pH8. 0。
全文摘要
一種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，提取步驟為用TENPbuffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮于PBS buffer中；將預(yù)處理的底泥樣品反復(fù)凍溶后加入溶菌酶，向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，所得樣品在室溫下離心后取上清液，向其中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入等體積的氯仿∶異戊醇混合液，所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入預(yù)冷的異丙醇；所得樣品離心去上清，向沉淀中加入預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀三次，再離心去乙醇；將樣品在空氣中自然風(fēng)干，用TE緩沖液溶解DNA保存。
文檔編號C12N15/10GK101696410SQ200910180630
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者趙大勇 申請人:河海大學(xué);