專(zhuān)利名稱(chēng)：一種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)木聚糖酶的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，具體地說(shuō)，是涉及一 種能夠表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖酶(EC3.2丄8)是一類(lèi)以內(nèi)切方式降解木聚糖分子中p-l,4木聚糖苷鍵的酶系。 該酶是一種重要的工業(yè)用酶，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、釀造、醫(yī)藥和造紙等行業(yè)。特 別是在制漿造紙工業(yè)中該酶用于紙漿漂白，能夠增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂 白用化學(xué)物質(zhì)的用量，從而有效減輕造紙業(yè)對(duì)環(huán)境造成的巨大污染。
目前商業(yè)化的木聚糖酶多為酸性或中性木聚糖酶，而生物漂白時(shí)在60'C左右、堿性 條件下進(jìn)行紙漿處理，生物漂白工藝從技術(shù)經(jīng)濟(jì)性方面考慮要求使用木聚糖酶在較高溫 度和寬泛pH條件下具有較高活性。因此，篩選或者構(gòu)建耐熱、耐堿的木聚糖酶成為當(dāng) 今研究的熱點(diǎn)之一。
中國(guó)農(nóng)科院姚斌等人對(duì)Streptomyces olivaceoviridis的木聚糖酶XYNB進(jìn)行定點(diǎn)突 變，發(fā)現(xiàn)突變酶N13D和S40E在70'C處理5min，熱穩(wěn)定性比原酶分別提高了 24.76% 和14.46%;突變酶N13D的比活性比XYNB提高了 22%，最適pH從5.2上升到5.8。
2008年江南大學(xué)李武等人對(duì)宇佐美曲霉04^wg///^ Msa/n ii) E001的木聚糖酶Xyn II 進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果顯示Xyn IID37N的最適pH由4.2升高到5.3， pH穩(wěn)定范圍由3.0 7.5縮減為3.0 5.5，但最適溫度和熱穩(wěn)定性基本保持不變。這一結(jié)果說(shuō)明第ll族木聚 糖酶的催化結(jié)構(gòu)域在P折疊股A3和B3之間存在一個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn)第37位Asp， 該位點(diǎn)與木聚糖酶的pH特性有關(guān)。
2004年Fred等人，對(duì)7Hc/iocferma wew/的木聚糖酶II進(jìn)行了定點(diǎn)突變，構(gòu)建了突 變子Y5(T2C， T28C， K58R, +191D),結(jié)果顯示，突變酶在65。C的半衰期由40s升高到 20min，在70'C時(shí)的半衰期由小于10s升高到6min，而pH穩(wěn)定性和野生型酶保持一致。 隨后，F(xiàn)red等人在Y5的基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了幾個(gè)突變子P9(N97R+F93W+H144K)， P12(H144C+N92C)， P15(F180Q+H144C+N92C)和P21(H22K+F180Q +H144C+N92C)。 這幾個(gè)突變酶的pH穩(wěn)定性都有不同程度的提高，p-折疊片的B6b和B9區(qū)域?qū)τ诿傅?穩(wěn)定性十分重要，尤其是對(duì)耐熱性。
2005年Jian-Yi Sun等人，用7T^womow(wpora/^ca木聚糖酶A (TfeA)的N-末 端替代^^ ^7/^"&^木聚糖酶八(AnxA)的相應(yīng)位置，構(gòu)建一個(gè)雜合的木聚糖酶，
3叫做ATx。試驗(yàn)結(jié)果表明，雜合酶的耐熱性提高，在pH3.0 10.0， 25'C條件下保育lh, ATx的殘留酶活全部在80%以上，因此，AnxA的耐熱性和催化活性都提高了。
2008年Seok等人，認(rèn)為催化殘基的pKa值直接影響著酶的最適pH，因此通過(guò)pKa 的計(jì)算可以確定突變位點(diǎn)并且預(yù)測(cè)突變酶所具有的pH穩(wěn)定性。他們以5a("7/附"Vcm/ww 木聚糖酶(BCX)為基礎(chǔ)構(gòu)建了兩個(gè)突變子A115X和S84X。其中A115X突變酶的活 性下降，可能是破壞了酶與底物結(jié)合過(guò)程中酶結(jié)構(gòu)恰當(dāng)?shù)母淖?。因此也說(shuō)明了，離催化 位點(diǎn)遠(yuǎn)的氨基酸殘基對(duì)催化位點(diǎn)的氨基酸殘基的pKa值和BCX的最適pH也具有十分 重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，以實(shí) 現(xiàn)有效節(jié)約酶應(yīng)用中pH和溫度控制帶來(lái)的酸堿和能耗成本、實(shí)現(xiàn)木聚糖酶在紙漿漂白 和低聚木糖生產(chǎn)的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述酵母工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述酵母工程菌的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，其分類(lèi)命名為巴斯德畢赤酵母 (戶/c/^戸加&)。已保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)，地址 武漢武漢大學(xué)；郵編430072;登記入冊(cè)的編號(hào)CCTCCNO: M209148;保藏日期 2009年7月14日。
上述的表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，為分泌型巴氏畢赤酵母重組菌株。在 分泌型巴氏畢赤酵母重組菌株中轉(zhuǎn)化有重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17，該重組突變質(zhì)粒 pPIC9KXYN17以三磷酸甘油醛脫氫酶基因(DQ465985)為啟動(dòng)子，并含有木聚糖酶基 因(XYNII) (S67387)和ZeocinTM抗性基因(Z46234)。
一種構(gòu)建上述表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌的方法，包括以下步驟-
(1) 應(yīng)用常規(guī)重組質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建出重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II;
(2) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件，以重組質(zhì)粒pPIC9K-XYNII為模板，設(shè)計(jì)三個(gè)突變引物， 分別為
T2C- gtggagaagcgccagjgeattcagcccggcacg; T28C- cggcgtgacgta ctgcaatggtcccggc; S156F- cggcgaaccac您aacgcgtgggc;
(3) 采用Stratagene公司的多重定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，以重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II為模板，應(yīng)用步驟(2)中設(shè)計(jì)的引物，將模板的第2和28位的蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?進(jìn)而在這兩個(gè)氨基酸之間形成二硫鍵將該酶的N-末端序列與相鄰的p-鏈相連，并且將 第156位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?；制備出重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17;
(4) 將重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17用Sa/I酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母 宿主菌中，即構(gòu)建成表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母重組菌株。
(5) 將步驟(4)構(gòu)建的重組菌株，經(jīng)過(guò)甲醇利用表型篩選、外源基因多拷貝整合 篩選以及誘導(dǎo)表達(dá)篩選后，即選出高效表達(dá)木聚糖酶的重組工程菌。
其中，步驟(1)中，所述的重組質(zhì)粒pPlC9K-XYNII是目的基因XYNII插入到質(zhì) 粒pPIC9K中形成的重組質(zhì)粒。具體方法參見(jiàn)Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊(cè)。
步驟(2)中，引物設(shè)計(jì)軟件采用Stratagene公司的在線引物設(shè)計(jì)軟件QuikChang^ Primer Design Program 。
步驟(4)中，在將重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17用S"/I酶切線性化之后，電擊轉(zhuǎn) 化入畢赤酵母宿主菌中之前，可將突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。
上述表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌在生產(chǎn)高穩(wěn)定性木聚糖酶中的應(yīng)用。
將制備的高效表達(dá)木聚糖酶的重組工程菌在BMG培養(yǎng)基中，28 3(TC培養(yǎng)至細(xì)胞 密度OD咖達(dá)到2~6，用BMM重懸細(xì)胞至OD6o0=1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)72小時(shí)誘導(dǎo) 培養(yǎng)(每隔24小時(shí)向培養(yǎng)基添加100%甲醇至終濃度為1.0%)，將完成培養(yǎng)的酵母基因 工程菌經(jīng)離心除去菌體，收集上清液，以分子量為10KD的超濾管，濾去小分子量蛋白 和鹽，經(jīng)過(guò)分子篩Superdex 75 prep grade純化，使用去離子水，流速0.5ml/min洗脫， 分布收集洗脫峰中的樣品，經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定，確定目的樣品所在的收集管，得到電^C純的 目標(biāo)蛋白。
本發(fā)明使用基因突變的方法提高木聚糖酶基因XYNII編碼產(chǎn)物的工業(yè)應(yīng)用li定 性；通過(guò)定點(diǎn)誘變，獲得突變基因，該突變的木聚糖酶基因在畢赤酵母表達(dá)后熱穩(wěn)、定性 和pH穩(wěn)定性大幅度提高，通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建高效表達(dá)重組木聚糖酶的酵母基因 工程菌，并從中培養(yǎng)分離純化制取耐熱耐堿的重組木聚糖酶。
有益效果本發(fā)明所得到的突變木聚糖酶(以下記為HA17)與未突變木聚糖酶(以 下記為H9K+-3)進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)比較，比酶活由原來(lái)的203IU/ mg增加到856IU/mg，最 適反應(yīng)pH不變，為5.0(pH5.0-6.0基本一致)；最適反應(yīng)溫度由5(TC提高到60'C(55-65'C 基本一致)，原酶60。C2min酶活降至59。/。，突變酶60。C20min酶活沒(méi)有下降；70。C半 衰期由1分鐘提高到14分鐘，在50'C 60min下的pH穩(wěn)定范圍由5.0 7.0擴(kuò)展到4.0~10.0。


圖l是重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2是多重定點(diǎn)突變方法的流程圖。 圖3是經(jīng)純化酶液的SDS-PAGE圖譜。 圖4是突變木聚糖酶與未突變木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。 圖5是pH對(duì)木聚糖酶活的影響。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì) 限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例l:重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
構(gòu)建出重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II(Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit 操作手冊(cè))，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖l所示，該重組質(zhì)粒pPIC9K-XYNII是目的基因XYNI1 插入到質(zhì)粒pPIC9K中形成的重組質(zhì)粒，以后的突變操作就是在該重組質(zhì)粒上完成的。
實(shí)施例2:重組質(zhì)粒的定點(diǎn)突變。
應(yīng)用Stratagene公司的在線引物設(shè)計(jì)軟件QuikChange Primer Design Program,以重 組質(zhì)粒pPIC9K-XYNII為模板，設(shè)計(jì)三個(gè)突變引物，分別為
T2C- gtggagaagcgccagtgeattcagcccggcacg;
T28C- cggcgtgacgta ctgcaatggtcccggc;
S156F- cggcgaaccac您aacgcgtgggc;
對(duì)重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN 1I的第2位、28位和156位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，制備 出重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17。其中，第2位和28位的蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，進(jìn)而 在這兩個(gè)氨基酸之間形成二硫鍵將該酶的N-末端序列與相鄰的P-鏈相連；第156位絲 氨酸突變?yōu)楸奖彼幔换蚨c(diǎn)突變反應(yīng)體系如表1所示，PCR反應(yīng)參數(shù)如表2所示。
PCR結(jié)束后，經(jīng)過(guò)DpnI消化，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌體內(nèi)，采用TaKaRa公司 的質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒提取質(zhì)粒，送到金思特公司測(cè)序，選出想要得到的質(zhì)粒。
該多重定點(diǎn)突變方法流程如圖2所示。第一步，以設(shè)計(jì)好的突變引物為指導(dǎo)并以質(zhì) 粒pPIC9K-XYNII為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第二步，將擴(kuò)增好的質(zhì)粒用DpnI酶進(jìn)行消化， 除去和母鏈相同的DNA鏈，得到只含有突變位點(diǎn)的DNA鏈；第三步，將消化好的質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)XL10-Gold感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。
6表1基因定點(diǎn)突變反應(yīng)體系
組分體積
10xQuikChange敏Multi reaction buffer
QuikSolution0.75^1
ds-DNA template城100ng)
Mutagenic primers:
T2C(33bp)1.30nl
T28C(28bp)
S156F(25bp)l.OOpl
dNTPmix
QuikChange Multi enzyme blendini
加蒸餾水至體系終體積為25^115.35pl
表2PCR反應(yīng)參數(shù)部分 循環(huán) 溫度時(shí)間
1 1 95°C1 minute
2 30 95 。C1 minute
55 °C1 minute
65 °C18 minutes
實(shí)施例3:目的DNA的準(zhǔn)備及畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化。
將所得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用SalI進(jìn)行酶切，通過(guò)酚抽提和乙 醇沉淀得到線性的目的DNA;制取畢赤酵母的電感受態(tài)細(xì)胞；將8(^1的電感受態(tài)細(xì)胞與 10nl的線性化DNA混合，轉(zhuǎn)入0.2 11電轉(zhuǎn)化杯中，在電壓2.0KV條件下進(jìn)行電擊。
實(shí)施例4:轉(zhuǎn)化子的篩選。
(1) 酵母轉(zhuǎn)化子的甲醇利用表型的篩選。
用滅菌牙簽挑取單克隆，在MM及MD平板上以一定的方式劃線或點(diǎn)His+轉(zhuǎn)化子， 確保先在MM平板上點(diǎn)；為分離Mut+及MutS表型，在MD及MM平板上各點(diǎn)上對(duì)照 (GS115/His+MutsAblumin)及(GS115/His^uf p-gal); 30°C，孵育2天；兩天后， 觀察菌落的大小并計(jì)數(shù)，篩選在MD平板和MM平板上均能正常生長(zhǎng)的酵母轉(zhuǎn)化子(表 型即為His+Mut+)。
(2) 外源基因多拷貝整合轉(zhuǎn)化子篩選。制備適量YPD培養(yǎng)基，高溫滅菌后冷卻至55'C 60'C，按表3加入適當(dāng)體積的100 mg/mlG418貯備液，立即混勻鋪制平板，以制備含不同濃度G418 (0mg/ml， 0.25mg/ml， 0.75mg/ml， 1.00mg/ml, 1.50mg/ml， 2.00mg/ml， 3.00mg/ml, 4.00mg/ml)的YPD平板， 注意減少氣泡產(chǎn)生；準(zhǔn)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每個(gè)孔中加入200^1 YPD;用滅菌牙簽在 第一組平板中每孔接種單個(gè)HIS+轉(zhuǎn)化子，輕輕攪動(dòng)以懸浮細(xì)胞；蓋住96孔板在30'C孵 育2天；2天后，取新的96孔板，每孔加入YPD;用移液器從第一組板中吸取IO[U 培養(yǎng)液于對(duì)應(yīng)的第二組板中；蓋住第二組板，30。C孵育過(guò)夜；第二天，在第三組板中重 復(fù)第二組板的操作；孵育后，取第三組板，用移液器吸取孔中的培養(yǎng)液上下吹打重新懸 浮細(xì)胞；取10nl每孔中液體點(diǎn)在含遺傳霉素濃度為0， 0.25， 0.5, 0.75， 1.00， 2.00， 3.00， 4.00mg/ml的YPD平板上；待液體吸收，30'C培養(yǎng)2 5天，每天檢査菌落生長(zhǎng)情 況；挑取具有G418抗性的菌落，在YPD平板上劃線進(jìn)行純化處理。
表3 G418貯備液G418終濃度G418貯備液(ml) /25mlYPD
0.500.125
1.000.25
2.000.5
3.000.75
4.001.0
(3)重組酵母菌表達(dá)。 挑取單克隆，接種至25mlMGY， BMG或BMGY中，28-30°C， 250-300rpm搖至 OD600=2-6;室溫1500-3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用MM， BMM或BMMY 重懸細(xì)胞至OD6wr1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；在1L搖瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋兩層滅菌紗 布，放入搖床繼續(xù)生長(zhǎng)；每24小時(shí)，加甲醇至終濃度為1.0%以繼續(xù)誘導(dǎo)；72小時(shí)結(jié)束
表達(dá)，收集發(fā)酵液，測(cè)定酶活性。
酶活單位定義l個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)為1%可溶性木聚糖 (4-0-Me-D-glucurono-D-xylan， Sigma From Birchwood)為底物，每分鐘在pH4.8、 50°C 條件下分解木聚糖生成1 Mmol木糖所需的酶量。
實(shí)施例5:重組木聚糖酶的純化。
酵母發(fā)酵液經(jīng)4000rpm/min離心10分鐘，把上清液通過(guò)分子量為10KD的超濾管進(jìn)行 超濾，濾去一些小分子蛋白和鹽，取超濾過(guò)的液體2ml，經(jīng)過(guò)分子篩Superdex 75 prep grade
8純化，使用去離子水，流速0.5ml/min洗脫，分布收集洗脫峰中的樣品，經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定， 確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目標(biāo)蛋白。如圖3所示，是經(jīng)純化酶液的 SDS-PAGE圖譜。其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，1為HA17, 2為H9K+0， 3為HA17用去糖 基化酶處理(因?yàn)槲刺幚磉^(guò)的HA17有兩條帶，經(jīng)去糖基化酶處理后只剩一條帶，說(shuō)明另 外一條帶是被糖基化了的酶)，4為去糖基化酶(Deglycosylase)。
實(shí)施例6:酶學(xué)性質(zhì)的分析與比較。
將純化后的突變酶與野生型酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的比較研究。包括酶的最適溫度和熱穩(wěn) 定性、最適pH和pH穩(wěn)定性、比活性等。比酶活由原來(lái)的203IU/mg增加到856IU/mg，最 適反應(yīng)pH不變，為5.0 (pH5.0-6.0基本一致)；最適反應(yīng)溫度由50'C提高到60'C (55-65'C 基本一致)，原酶60'C2min酶活降至59W，突變酶60'C20min酶活沒(méi)有下降；7(TC半衰 期由1分鐘提高到14分鐘，在50'C60min下的pH穩(wěn)定范圍由5.0 7.0擴(kuò)展到4.0 10.0。
圖4為突變木聚糖酶與未突變木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度，從圖中可得知，最適反應(yīng) 溫度由50'C提高到6O'C。圖5為pH對(duì)木聚糖酶活的影響，在50'C60min下的pH穩(wěn)定范圍 由5.0 7.0擴(kuò)展至U4.0 10.0。其中，在不加底物條件下，將酶置于50'C水浴溫育30分鐘后 測(cè)定酶活。
9SEQUENCE LISTING
<110>南京林業(yè)大學(xué)
<120> —種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
<130> njfu090724
〈160〉 3
<170> Paterrtln version 3. 3
<210> 1
〈211〉 33
〈212> DNA
〈213〉 Artificial
〈220>
<223> T2C
〈400〉 1
gtggagaagc gccagtgcat tcagcccggc acg 33
〈210> 2
〈211〉 28
〈212> DNA
<213> Artificial
<220>
〈223〉 T28C〈400〉 2
cggcgtgacg tactgcaatg gtcccggc 28
〈210〉 3
〈211〉 25
〈212〉 DNA
<213> Artificial
〈220〉
<223> S156F 〈400〉 3
cggcgaacca cttcaacgcg tgggc 2權(quán)利要求
1、一種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，已保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)是CCTCC NOM 209148。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，其特征在于所述 的酵母工程菌為分泌型巴氏畢赤酵母重組菌株。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，其特征在于所述 的分泌型巴氏畢赤酵母重組菌株轉(zhuǎn)化有重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17，所述的重組突變 質(zhì)粒pPIC9KXYN17以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱?dòng)子，并含有木聚糖酶基因和 ZeocinTM抗性基因。
4、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌的方法，其特 征在于該方法包括以下步驟(1) 構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II;(2) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件，以重組質(zhì)粒pPIC9K-XYNII為模板，設(shè)計(jì)三個(gè)突變引物， 分另lj為T(mén)2C- gtggagaagcgccagtgeattcagcccggcacg; T28C- cggcgtgacgta ctgcaatggtcccggc; S156F- cggcgaaccac您aacgcgtgggc;(3) 采用Stratagene公司的多重定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，以重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II為 模板，應(yīng)用步驟(2)中設(shè)計(jì)的引物，將模板第2和28位的蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，進(jìn) 而在這兩個(gè)氨基酸之間形成二硫鍵將該酶的N-末端序列與相鄰的p-鏈相連，并且將第 156位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?；制備出重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17;(4) 將重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17用Sfl/I酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母 宿主菌中，即構(gòu)建成表達(dá)木聚糖酶的酵母工程菌；(5) 將步驟(4)構(gòu)建的重組菌株，經(jīng)過(guò)甲醇利用表型篩選、外源基因多拷貝整合 篩選以及誘導(dǎo)表達(dá)篩選后，即選出高效表達(dá)木聚糖酶的酵母工程菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌的方法，其特 征在于步驟(1)中，所述的重組質(zhì)粒pPIC9K-XYN II是目的基因XYNII插入到質(zhì)粒 pPIC9K中形成的重組質(zhì)粒。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌的方法，其特 征在于步驟(4)中，在將重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17用Sfl/I酶切線性化之后，電擊 轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌之前，將突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。
7、 權(quán)利要求1所述的表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，在生產(chǎn)高穩(wěn)定性木聚 糖酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)高穩(wěn)定性木聚糖酶的酵母工程菌，其保藏號(hào)為CCTCC NOM 209148，該酵母工程菌是在分泌型巴氏畢赤酵母重組菌株中轉(zhuǎn)化有重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17，所述的重組突變質(zhì)粒pPIC9KXYN17以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱?dòng)子，并含有木聚糖酶基因和ZeocinTM抗性基因。本發(fā)明還公開(kāi)了上述酵母工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。該重組工程菌具體表現(xiàn)為比酶活由203IU/mg增加到856IU/mg；最適反應(yīng)溫度由50℃提高到60℃；70℃半衰期由1分鐘提高到14分鐘，在50℃、60min下的pH穩(wěn)定范圍由5.0～7.0擴(kuò)展到4.0～10.0。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101624574SQ20091018445
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者強(qiáng) 勇, 宋向陽(yáng), 勇 徐, 鑫 李, 歐陽(yáng)嘉, 連之娜, 牧 陳, 韓承業(yè) 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)