一種釀酒酵母工程菌株及其制備方法、應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種釀酒酵母工程菌株及其制備方法、 應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-乳酸是以玉米淀粉為原料，經(jīng)過生物發(fā)酵精制而成的一種有機酸，為無色澄清 粘性液體，水溶液顯酸性反應(yīng)。與水、乙醇或乙醚能任意混合，在氯仿中不溶。因其左旋的 特征，具有很好的生物相融性，能與哺乳動物相融，可直接參與人體代謝、無任何副作用，被 廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域：
[0003] 食品行業(yè)：主要用于糖果，飲料（如啤酒，葡萄酒及乳酸類飲料）等食品加工業(yè)中， 作為酸味劑及口味調(diào)節(jié)劑，被稱為絕對安全的食品添加劑。另還可用于清涼飲料、蔬菜的加 工和保藏；
[0004] 醫(yī)藥行業(yè)：L-乳酸（L-Iacticacid)是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用作生產(chǎn)紅霉素 林格氏液輸液、L乳酸鈣、L乳酸鈉、L乳酸鋅、L乳酸亞鐵等藥物還可用作手術(shù)室、病房、實 驗室等殺菌消毒劑；
[0005] 化妝品：可用作滋潤劑、保濕劑、皮膚更新劑、pH調(diào)節(jié)劑、去粉刺劑、去齒垢劑；
[0006] 農(nóng)藥行業(yè)：L-乳酸具有很高的生物活性，對農(nóng)作物和土壤無毒無害，可用作生產(chǎn) 新型環(huán)保農(nóng)藥，在日、美等發(fā)達國家已得到大力的推廣；
[0007] 煙草行業(yè)：適量加入L-乳酸，可提高煙草的品質(zhì)，并保持煙草的濕度；皮革制造 業(yè)：可使皮革柔軟細膩，從而提高皮革的品質(zhì)；紡織工業(yè)：可用來處理纖維，可使之易著色， 增加光澤和觸感柔軟；
[0008] 其他行業(yè)：除了以上用途外，L-乳酸還可用來生產(chǎn)生物降解塑料一聚乳酸和綠色 環(huán)保溶劑一L乳酸甲酯、L乳酸乙酯等。
[0009]目前，L-乳酸主要采用發(fā)酵法合成，其是以含有淀粉的原料蔗糖、甜菜糖或其糖蜜 為原料。糖化接入乳酸菌株。pH控制在5-5. 5,溫度50°C左右發(fā)酵3-4d，用碳酸鈣使生成 的乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸鈣。同時防止PH值降低而影響發(fā)酵，趁熱過濾分離存在于溶液中的固體 碳酸鈣和氫氧化鈣等，精制得乳酸鈣。用硫酸酸化生成乳酸和硫酸鈣沉淀，過濾。濾液約含 10%的粗乳酸，濃縮至50%。再用活性炭除去有機雜質(zhì)，用亞鐵氰化鈉除去重金屬和濃縮時 凝聚的雜質(zhì)。最后用離子交換樹脂除去微量雜質(zhì)，再濃縮過濾得到產(chǎn)品。但采用乳酸菌進 行發(fā)酵所產(chǎn)的L-乳酸純度較低，生產(chǎn)成本較高。因此，如何提高L-乳酸的純度成為了研究 的熱點。
[0010]釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)，又稱面包酵母或出芽酵母。在生物生產(chǎn) 中是使用最廣泛的微生物之一。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因為傳統(tǒng) 上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，在現(xiàn)代分子和細胞生物學(xué)中用作真核模式生物， 其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類。釀酒酵母 的細胞為球形或者卵形，直徑5-10ym。其繁殖的方法為出芽生殖（既可營養(yǎng)生殖也可出 芽生殖）。因其較乳酸菌可耐受更低的pH值，所需培養(yǎng)基成分簡單，價格低廉，成為了生產(chǎn)L-乳酸的首選工程菌菌株。
[0011] NobuhiroIshida等通過在染色體整合牛乳酸脫氫酶基因，構(gòu)建有效產(chǎn)生L-乳酸 的釀酒酵母菌，產(chǎn)量可達55.6g/L。SatoshiSaitoh等將6拷貝牛乳酸脫氫酶基因整合在 葡萄酒酵母染色體上構(gòu)建高產(chǎn)乳酸菌株，并以甘蔗汁作培養(yǎng)介質(zhì)，乳酸產(chǎn)量高達122g/L。光 學(xué)純度達99. 9%。DaniloPorro等將牛的L-乳酸脫氫酶基因在丙酮酸脫羧酶基因突變的 KluyveromycesIactis中表達，使乳酸產(chǎn)量達到109g/L，轉(zhuǎn)基因K. Iactis菌株大大改進分 批補料發(fā)酵條件下產(chǎn)量。但上述經(jīng)過改造的生物工程菌株除了產(chǎn)物乳酸外還會產(chǎn)生副產(chǎn)物 乙醇。由于大量碳源的消耗，已經(jīng)有很多研究用代謝工程的方法減少副產(chǎn)物乙醇，但至今未 能完全解決該問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種釀酒酵母工程菌株及其制備方法、應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方 法。該釀酒酵母工程菌株不含乙醇代謝主要途徑，可以大量利用葡萄糖發(fā)酵積累乳酸，該菌 株能夠快速利用乙醇生長。
[0013] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0014] 本發(fā)明提供了一種釀酒酵母工程菌株，釀酒酵母工程菌株的roci、PDC5、H)C6、 ADHl、ADH4基因被敲除，并插入LDH基因。
[0015] 丙酮酸脫羧酶（roc)是在糖酵解和發(fā)酵產(chǎn)乙醇途徑的節(jié)點處，它將丙酮酸轉(zhuǎn)化為 乙醛。釀酒酵母途徑中有三個PDC基因（PDCl，roC5和roC6)。
[0016] 乙醛脫氫酶（ADH)可將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇，伴隨著NADH氧化為NAD+。在釀酒酵母中， 至少有6個ADH的同工酶，分別是由ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6和SFAl編碼的。 ADHlp在催化乙醛變?yōu)橐掖计鹆酥饕饔茫狙芯堪l(fā)現(xiàn)僅敲除ADHl是不能完全抑制乙醇生 產(chǎn)的，ADH4自發(fā)的染色體擴增可以修復(fù)ADHl的無義突變。
[0017] 因此在本研究中，為了敲除釀酒酵母丙酮酸一乙醛一乙醇途徑，敲除了roC1、 PDC5、PDC6、ADH1 和ADH4。
[0018] 在敲除roc(roci，roC5和roC6)和ADH(ADH1和ADH4)后，為維持胞內(nèi)代謝平衡， 碳源必然會流向其他產(chǎn)物合成。所以在不產(chǎn)乙醇情況下，為了維持胞內(nèi)氧化還原平衡，引進 了外源乳酸代謝途徑，在乳酸脫氫酶LDH作用下，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。合成乳酸與乙醇的 合成氧化還原平衡接近，外源基因?qū)胱钌?，僅插入一個基因LDH。經(jīng)過分子改造后，本發(fā)明 所述釀酒酵母工程菌株能夠利用葡萄糖產(chǎn)乳酸，且不產(chǎn)乙醇；該菌株可以僅以乙醇為碳源 快速生長。
[0019] 本發(fā)明釀酒酵母工程菌株SyBE_Sc01020039代謝葡萄糖不產(chǎn)乙醇產(chǎn)乳酸，敲除乙 醇生成路徑和插入外源乳酸生成途徑的示意圖見圖1。
[0020] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，釀酒酵母為釀酒菌株BY4741。
[0021] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母工程菌株的制備方法，包括如下步驟：
[0022] 將釀酒酵母的PDC5、PDC6基因敲除，獲得菌株MATaAPDC5 APDC6;
[0023] 改變菌株MATaATOC5ATOC6的交配型，獲得二倍體菌株MATa/ alphaAPDC5APDC6 ;
[0024]將二倍體菌株MATa/alphaAPDC5APDC6 的ADH4、PDC1、ADH1 基因敲除，并插入LDH 基因，獲得菌株alLa4plp5p6-D，制備單倍體菌株，獲得釀酒酵母工程菌株。
[0025] 該釀酒酵母工程菌株的制備方法，具體包括如下步驟：
[0026] 構(gòu)建rocs基因敲除片段：將編碼rocs的啟動子、終止子、開放閱讀框的一部分以 及篩選標(biāo)記連接，獲得F1DCS基因敲除片段，記為Prom_pdc5-Ter_pdc5_Marker_URA3-〇RF_ pdc5_f'，簡記為APDC5 ;
[0027] 構(gòu)建roce基因敲除片段：將編碼roce的啟動子、終止子、開放閱讀框的一部分以 及篩選標(biāo)記連接，獲得roC6基因敲除片段，記為Prom_pdc6-Ter_pdc6_Marker_URA3-〇RF_ pdc6_f'，簡記為APDC6 ;
[0028] 構(gòu)建ADH4基因敲除片段：將編碼ADH4的啟動子、終止子、開放閱讀框的一部分以 及篩選標(biāo)記連接，獲得ADH4基因敲除片段，記為Prom_adh4-Ter_adh4-Marke;r_URA3-〇RF_ adh4_f'，簡記為AADH4 ;
[0029] 構(gòu)建roCl基因敲除及LDH插入片段：
[0030] 將編碼roci的啟動子、終止子、開放閱讀框的一部分、篩選標(biāo)記和編碼LDH的基 因連接，獲得F1DCl基因敲除及LDH插入片段，記為Prom_pdcl-〇RF_LDH-Ter_pdcl-Marker_ URA3-0RF-pdcl_f'，簡記為APDCl::LDH;
[0031] 構(gòu)建ADHl基因敲除及LDH插入片段：
[0032] 將編碼ADHl的啟動子、終止子、開放閱讀框的一部分、篩選標(biāo)記和編碼LDH的基 因連接，獲得ADHl基因敲除及LDH插入片段，記為Prom_adhl-〇RF_LDH-Ter_pdcl-Marker_ URA3-0RF_pdcl_f'，簡記為AADHl::LDH;
[0033] 將rocs基因敲除片段、roce基因敲除片段轉(zhuǎn)化入釀酒酵母中，去掉篩選標(biāo)記，獲 得MATaAPDC5APDC6 ;
[0034] 將HO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MATaATOC5ATOC6,改變交配型，獲得二倍體菌株MATa/ alphaAPDC5APDC6 ;
[0035] 將ADH4基因敲除片段、PDC1基因敲除及LDH插入片段、ADHl基因敲除及LDH 插入片段轉(zhuǎn)化入二倍體菌株MATa/alphaAroC5ATOC6,去掉篩選標(biāo)記，獲得菌株記為 alLa4plp5p6_D，制備單倍體菌株，獲得釀酒酵母工程菌株，記為MATaAadhl::Padhl-LDHA adh4Apdc6Apdc5Apdcl::Ppdcl-LDH。
[0036] 作為優(yōu)選，篩選標(biāo)記為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記或抗生素抗性基因篩選標(biāo)記。
[0037] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記為URA3 (尿啼啶）標(biāo)記。
[0038] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，乳酸脫氫酶基因LDH來源于牛屬Bovine。
[0039] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，構(gòu)建H)C5基因敲除片段、H)C6基因敲除片段、 ADH4基因敲除片段、PDCl基因敲除及LDH插入片段、ADHl基因敲除及LDH插入片段所用的 啟動子、終止子、開放閱讀框、篩選標(biāo)記是以釀酒酵母菌株BY4741的基因組為模板，經(jīng)PCR 反應(yīng)擴增得到的。
[0040] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，釀酒酵母為釀酒菌株BY4741。
[0041] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母工程菌株在生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
[0042] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母工程菌株的發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法為：本發(fā)明釀酒酵 母工程菌株以葡萄糖為碳源進行發(fā)酵。
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