專利名稱：穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK細(xì)胞系及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工程細(xì) 胞系MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl及其構(gòu)建方法，所構(gòu)建細(xì)胞系可用于禽流感疫苗株的大規(guī)模細(xì)胞化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
流感病毒表面的血凝素(HA)通過與宿主細(xì)胞表面的唾液酸寡糖受體結(jié)合從而起始病毒感染宿主細(xì)胞，禽源和馬源流感病毒偏嗜結(jié)合α 2，3-唾液酸寡糖受體(Neu5Aca2，3Gal)，而人源和豬源流感病毒偏嗜結(jié)合α2，6_唾液酸寡糖受體(Neu5Ac α 2，6Gal)。因此，細(xì)胞表面唾液酸受體的類型及豐度，影響流感病毒對不同宿主的適應(yīng)性。不同的唾液酸受體對流感病毒在宿主細(xì)胞中感染、復(fù)制和擴(kuò)散產(chǎn)生重要的影響。目前獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)的是雞胚來源的滅活疫苗。哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗在動物模型中表現(xiàn)出較好的保護(hù)性作用，當(dāng)前Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞系(MDCK)被認(rèn)為是培養(yǎng)A型和B型流感病毒最適合的細(xì)胞系。傳統(tǒng)的流感病毒疫苗是依靠雞胚生產(chǎn)的，病毒經(jīng)過培養(yǎng)增殖、濃縮、滅活、進(jìn)一歩純化，配制、無菌灌裝，最后檢測和放行。除了研發(fā)使用高產(chǎn)重組毒株作為A型流感的種毒，基本生產(chǎn)エ藝在過去的60年幾乎沒什么變化。不僅成本代價(jià)高，而且雞胚的殘留物質(zhì)還可能引起過敏反應(yīng)，此外，當(dāng)面臨高致病流感病毒導(dǎo)致的全球大流行時(shí)，傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)方法可能不足以滿足全球疫苗市場的需求。因此，研究機(jī)構(gòu)和疫苗公司正在合作開發(fā)新的生產(chǎn)技木，以達(dá)到省時(shí)高效的目的。為了獲得流感疫苗生產(chǎn)的替代方法，疫苗公司已經(jīng)嘗試了許多新的途徑。組織培養(yǎng)的細(xì)胞系作為雞胚生產(chǎn)方式的一種補(bǔ)充或替代方法，已經(jīng)引起了人們的重視。細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)勢1)可以應(yīng)用許多在雞胚生產(chǎn)系統(tǒng)中得到臨床驗(yàn)證的基本方法(如全病毒的生產(chǎn)、多步裂解、純度更高的流感抗原或減毒活疫苗)，同時(shí)，縮短雞胚生產(chǎn)的供應(yīng)時(shí)間，穩(wěn)定產(chǎn)品供應(yīng)鏈；2)可以應(yīng)用更加先進(jìn)可控的種毒生產(chǎn)系統(tǒng)，由于生產(chǎn)用細(xì)胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的風(fēng)險(xiǎn)；3)提供了一種更加高效、穩(wěn)定、可重復(fù)的疫苗生產(chǎn)方式，使用一種規(guī)格可變且封閉的生物反應(yīng)器，可以在任意時(shí)間起始反應(yīng)，并可以根據(jù)需要延長生產(chǎn)周期；4)提高了部分禽流感毒株生產(chǎn)疫苗的能力。除了上述優(yōu)點(diǎn)，以哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗至少具有一種理論上的優(yōu)點(diǎn)在雞胚中進(jìn)行的流感病毒的分離和復(fù)制通常會產(chǎn)生特定表型的選擇，而這種選擇往往不同于正確的人類分離株。相反，在細(xì)胞中進(jìn)行的流感病毒的分離復(fù)制不會產(chǎn)生這種傳代依賴性的表型選擇。從而有利于表達(dá)天然構(gòu)象的血凝素抗原，優(yōu)化抗體的特異性。Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞系(MDCK)來源于ー只成年獵犬的腎臟組織。關(guān)于MDCK細(xì)胞來源的季節(jié)性流感疫苗的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，MDCK細(xì)胞來源的病毒經(jīng)過連續(xù)傳代之后，可以保持抗原的穩(wěn)定性，此類疫苗的安全性和免疫原性與雞胚來源的疫苗相當(dāng)。人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV (hST3GalIV)能將唾液酸(Neu5Ac)轉(zhuǎn)移到糖蛋白的末端的2型糖鏈(Gal β l-4GlcNAc)，或者I型糖鏈(Gal β l_3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之間連鍵是α 2-3。hST3GalIV優(yōu)先作用于2型糖鏈(Gal β l_4GlcNAc)，其次才是 I 型糖鏈(Gal β l_3GlcNAc)。人源β 1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I (UDP-半乳糖Ν-こ酰氨基葡萄糖基β 1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱為β l_4GalTl，EC2.4. I. 38)，是ー組II型膜結(jié)合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)轉(zhuǎn)移到糖鏈的N-こ酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal與GIcNAc之間的連鍵是β 1-4。

發(fā)明內(nèi)容
本研究首次建立了提高禽流感病毒α 2，3-唾液酸豐度的MDCK細(xì)胞系一MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 細(xì)胞。通過穩(wěn)定共表達(dá) hST3GalIV 和 β l_4GalTl，可以增強(qiáng)β l-4GalTl催化半乳糖與N-こ酰葡萄糖以β 1-4連鍵連接的效力，hST3GalIV催化唾液酸與半乳糖以α 2-3連鍵連接的效力，從而提高M(jìn)DCK細(xì)胞表面α2，3_唾液酸豐度。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞表面α 2，3-唾液酸顯著高于母本MDCK細(xì)胞系，與母本MDCK細(xì)胞系相比，禽流感病毒的分離株和疫苗候選株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系上形成更大的 噬斑，生長滴度更高。穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK細(xì)胞系建立之后，更適合禽流感病毒的生長，無論是病毒滴度還是噬斑形成能力都要更高，也證明了禽流感病毒對α 2，3-唾液酸的偏嗜性，不僅為研究α 2，3-唾液酸受體提供了方便的工具，對于實(shí)時(shí)監(jiān)測禽流感病毒進(jìn)行受體結(jié)合特性、檢測禽流感病毒變異株的出現(xiàn)、發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合特性發(fā)生變化的禽流感毒株具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。此外，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系在抗禽流感病毒藥物、疫苗株篩選以及細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的生產(chǎn)方面都展示出較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明穩(wěn)定表達(dá)人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV(hST3GalIV)和β 1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β l-4GalTl)的MDCK細(xì)胞系，是MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl ;保藏號為CGMCC No. 5967。所述的 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞系同時(shí)含有編碼 hST3GalIV 的基因和編碼β l_4GalTl的基因。所述編碼hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No:l所顯示，其所編碼的hST3GalIV的氨基酸序列如SEQ ID No:3所顯示；所述編碼β l_4GalTl的基因序列如SEQ ID No:2所顯示，其所編碼的β l_4GalTl的氨基酸序列如SEQ ID No:4所顯示。所述編碼hST3GalIV基因序列和β l_4GalTl基因序列來自于人。本發(fā)明的另ー個(gè)方面，提供構(gòu)建MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系的方法，所述方法包括將hST3GalIV和β l_4GalTl的基因重組到MDCK細(xì)胞的基因組中。所述MDCK-hST3Gal IV-MGalTl細(xì)胞系的構(gòu)建方法，是將帶有編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和帶有編碼β l_4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl基因的細(xì)胞系MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl。在本發(fā)明的另ー個(gè)方面中，提供ー種提高禽流感病毒生長滴度的方法，該方法包括，將H5N1亞型或H9N2亞型禽流感病毒株接種于本發(fā)明構(gòu)建的MDCK-hST3GalIV-^4GalTl細(xì)胞系中，病毒在所述細(xì)胞系上的培養(yǎng)條件為35°C、5%C02。毒株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系中生長滴度的提高，為禽流感疫苗的細(xì)胞化生產(chǎn)提供了有利條件。更具體地說，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼hST3GalIV基因的真核表達(dá)載體和β l_4GalTl基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞系中，構(gòu)建穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和 β l-4GalTl 的MDCK細(xì)胞系，本發(fā)明中一株表達(dá)hST3GalIV和 β l_4GalTl 的Madin-Darby犬腎細(xì)胞系MDCK-hST3GalIV-β 4GalTl細(xì)胞克隆株于2012年4月10保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 5967。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，所述MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞中α 2，3_唾液酸受體含量顯著高于母本MDCK細(xì)胞，禽流感病毒在本發(fā)明MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞系上繁殖的能力顯著高于母本MDCK細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV，禽流感病毒在MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl細(xì)胞上測定的滴度均高于在母本MDCK細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV細(xì)胞上的滴度。使用MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系可用于提高禽流感病毒產(chǎn)量并且避免了雞胚來源滅活疫苗中雞胚的殘留物帶來的副反應(yīng)效應(yīng)，可用于具有α 2，3-唾液酸受體能力的病毒疫苗株的大規(guī)模細(xì)胞化培養(yǎng)和生產(chǎn)。


圖I:不同G418濃度下MDCK細(xì)胞生存曲線橫坐標(biāo)時(shí)間(天數(shù))縱坐標(biāo)細(xì)胞存活率(%)選擇在1(Γ14天內(nèi)把細(xì)胞全部殺死的濃度作為G418的篩選濃度，即O. 8mg/mL。圖2:MDCK 與 MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 細(xì)胞 RT-PCR 鑒定結(jié)果(A)ST3GalIV 基因的電泳結(jié)果，I :MDCK_hST3GalIV-β 4GalTl 細(xì)胞，2 :母本 MDCK細(xì)胞，M 200bp Marker ；(B) β l_4GalTl 基因的電泳結(jié)果，I :MDCK_hST3GalIV-β 4GalTl 細(xì)胞，2 :母本MDCK細(xì)胞，M 200bp Marker。圖3:流式細(xì)胞術(shù)檢測不同MDCK細(xì)胞表面α 2，3_唾液酸受體與特異性凝集素MAA的結(jié)合。(A)MDCK細(xì)胞空白對照；MDCK細(xì)胞與MAA結(jié)合；MDCK_ST細(xì)胞與MAA結(jié)合；MDCK-STGT細(xì)胞與MAA結(jié)合；(B)不同MDCK細(xì)胞表面α 2，3_唾液酸受體與MAA的結(jié)合3次檢測果平均值的比較。(*)表示與MDCK-MAA組相比具有顯著差異(ρ〈0· 05)；(#)表示與MDCK MAA和MDCK-ST MAA組相比均具有顯著差異(ρ〈0· 05)。注MDCK-ST 代表 MDCK_ST3GalV 細(xì)胞系；MDCK-STGT 代表 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞系。圖4:禽流感病毒在 MDCK 細(xì)胞、MDCK-ST3GalV 細(xì)胞和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl細(xì)胞上的繁殖曲線。(A) LH5N1在三種細(xì)胞上的繁殖曲線；(B) LR38/H5N1在三種細(xì)胞上的繁殖曲線；(OF/H9N2在三種細(xì)胞上的繁殖曲線。
注M代表MDCK細(xì)胞系；ST 代表 MDCK_ST3GalV 細(xì)胞系；STGT 代表 MDCK-hST3GalIV_P 4GalTl 細(xì)胞系。圖5:不同禽流感病毒毒株在母本MDCK細(xì)胞、MDCK_ST3GalIV細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl 細(xì)胞上的感染滴度(TCID50)。(*)表示MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞與母本MDCK細(xì)胞測定結(jié)果相比具有顯著差異(ρ〈0· 05)；(#)表示 MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl 細(xì)胞與母本MDCK 細(xì)胞和 MDCK_ST3GalV 細(xì)胞
注MDCK-ST3 代表 MDCK_ST3GalIV 細(xì)胞；MDCK-STGT2 代表 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞。圖6:禽流感病毒在在母本MDCK細(xì)胞、MDCK_ST3GalIV細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 細(xì)胞上的 PFU 測定。(*)表示MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞與母本MDCK細(xì)胞測定結(jié)果相比具有顯著差異(ρ〈0· 05)；(#)表示 MDCK-hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞與母本 MDCK 細(xì)胞和 MDCK_ST3GalIV 細(xì)胞相比均具有顯著差異(p〈0.05)。注MDCK-ST 代表 MDCK_ST3GalIV 細(xì)胞；MDCK-STGT 代表 MDCK-hSTXallV- β 4GalTl 細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)說明本發(fā)明，所述實(shí)施僅僅g在舉例說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例lMDCK-hST3GalIV 細(xì)胞系和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞系的構(gòu)建I.材料與方法I. I試劑與儀器含人源ST3GalIV和β l_4GalTl開放閱讀框的真核表達(dá)質(zhì)粒購自Genecopoeia公司(貨號EX-C0523-M02和EX-C0234-M02) ；DMEM培養(yǎng)基和無血清Opti-MEM購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Hyclone公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒Plasmid MiniprepKit購自Qiagen公司；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；FuGENEP; HD轉(zhuǎn)染試劑、購自Roche公司；G418(40mg/mL)溶液購自上海生エ生物工程有限公司。MDCK細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。普通倒置顯微鏡和突光倒置顯微鏡為Leica產(chǎn)品；分光光度計(jì)為NanoDrop公司NDlOOO ;凝膠成像系統(tǒng)為基因公司產(chǎn)品。I. 2引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV (hST3GalIV)的引物
3G4F :5，-ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’ (SEQ ID No:5)3G4R :5，-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’ (SEQ ID No:6)用于擴(kuò)增人源β 1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶I (β l_4GalTl)的引物B4G1F :5，-ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’ (SEQ ID No:7)B4G1R :5’ -CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’(SEQ ID No:8)。I. 3確定篩選培養(yǎng)基中合適的G418濃度MDCK細(xì)胞接種48孔細(xì)胞培養(yǎng)板待長至80_90%豐度時(shí)加入含不同濃度的geneticin (G418)培養(yǎng)基:0、0· 1,0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 5 和 2mg/mL，置 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)14天后繪制細(xì)胞生長曲線確定G418的篩選濃度。
I. 4 FuGENE' HD轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞及抗性細(xì)胞克隆的篩選接種約2 X IO-5MDCK細(xì)胞至6孔細(xì)胞板，細(xì)胞密度至80% 90%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。將FuGENEk HD轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒溶液平衡到室溫，在離心管內(nèi)準(zhǔn)備以下混合液將編碼β-半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒hST3GAL4和編碼β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶I基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒β l_4GalTl (均購自Genecopoeia公司)各I μ g加入100 μ L無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻之后，再添5 μ L FuGENEit HD轉(zhuǎn)染試劑至上述混合液中，充分混勻之后，室溫孵育15分鐘，同時(shí)用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌兩次。將上述復(fù)合物覆蓋于細(xì)胞表面，補(bǔ)加無血清Opti-MEM培養(yǎng)基至總體積為2mL，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后移除培養(yǎng)物，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。36小時(shí)后用胰酶消化細(xì)胞，按1:10的比例傳代至48孔細(xì)胞板中，繼續(xù)用含O. 8mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200 μ L，每3天換一次篩選培養(yǎng)基，G418持續(xù)篩選10-14天后，可見有抗性細(xì)胞生長。不進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組作為陰性對照，細(xì)胞在含有G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至死亡。選擇生長狀態(tài)良好的抗性細(xì)胞集落，繼續(xù)用于單克隆細(xì)胞篩選用含O. 8mg/mL G418的篩選培養(yǎng)基將細(xì)胞密度稀釋至I個(gè)/100 μ L，鋪于96孔細(xì)胞板中50 μ L，每孔補(bǔ)加50 μ L篩選培養(yǎng)基。持續(xù)篩選10天后選擇表達(dá)水平最高的克隆再次按有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，以確保篩選出單克隆抗性細(xì)胞。篩選出的細(xì)胞依次于96孔、24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存于液氮中。1.5RT-PCR 鑒定篩選出的細(xì)胞株和母本MDCK細(xì)胞分別在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每株細(xì)胞鋪ー個(gè)孔，以2. 5mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞長至90-100%匯合度吋，收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，加入ImLO. 25%胰酶，37°C消化5分鐘，加入lmL10%DMEM吹打，將吹勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心IOOOrpm離心10分鐘，棄去上清液，加入PBS吹勻，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管內(nèi)，2000rpm離心5分鐘,棄去上清液,并吸干PBS,加入ImL Trizol,混勻,冰上放置10分鐘。加入200 μ L預(yù)冷氯仿，震蕩15秒，室溫放置2分鐘；4°C 12000rpm離心10分鐘；吸取上層水相約500 μ L至I. 5mL離心管，加入500 μ L預(yù)冷異丙醇，混勻，_20°C放置15分鐘；4°C 12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入lmL75%預(yù)冷こ醇洗滌沉淀；40C 12000rpm離心3分鐘；棄去上清液,加入ImL預(yù)冷無水こ醇再次洗漆沉淀；4°C 12000rpm離心3分鐘；吸盡液體，室溫10分鐘晾干沉淀；加入50 μ L ddH20溶解RNA。以上試驗(yàn)所有的槍頭、離心管、ddH20和75%預(yù)冷こ醇均用DEPC處理并且高壓，全程戴手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取2yL溶解的RNA，以分光光度計(jì)ND1000檢測RNA濃度和A260/A280。提出的總RNA按如下體系反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，步驟如下首先加入提取的總RNA溶液22 μ L、OligodT3 μ L，吹勻之后，置于70°C金屬浴作用5分鐘后置冰浴上，再加入下列試劑RNA酶抑制劑
2μ L、5 X緩沖液8 μ L,M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶I μ L和dNTP Μ χ4 μ L，總反應(yīng)體積為40 μ L，置于37°C水浴孵育2 3小時(shí)，然后開始RT-PCR反應(yīng)，使其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以3G4F和3G4R為引物通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV(hST3GalIV)基因;B4G1F和B4G1R為引物擴(kuò)增βト4半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(β l_4GalTl)基因。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94 °C預(yù)變性3分鐘；94 °C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸90秒，共30個(gè)循環(huán)。配制1%的瓊脂糖凝膠，并以EB染色，每孔加入10 μ LPCR產(chǎn)物，在100V電壓下進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收之后，送上海生エ生物工程有限公司去測序。2.結(jié)果2. I培養(yǎng)基G418工作濃度的確定 我們選擇10-14天內(nèi)能夠全部殺死MDCK細(xì)胞的G418濃度作為篩選濃度。根據(jù)細(xì)胞生長曲線(圖1)，6418濃度在0.8 1.011^/111し之間時(shí)，細(xì)胞在10 14天內(nèi)全部死亡。因此，我們選擇O. 8mg/mL為本實(shí)驗(yàn)中壓力篩選培養(yǎng)基中G418的濃度。2. 2RT-PCR 鑒定結(jié)果由RT-PCR結(jié)果(圖2)可見，一株篩選的細(xì)胞株擴(kuò)增出1002bp的條帶，條帶單一而且清晰，與目的基因(hST3GalIV)大小一致；另ー株篩選的細(xì)胞株可擴(kuò)增出兩個(gè)條帶1002bp的條帶和1197bp的條帶，分別與目的基因(hST3GalIV和β HGalTl)大小一致。而對照組中母本MDCK細(xì)胞未見到有擴(kuò)增的條帶。說明我們已經(jīng)將目的條帶已經(jīng)整合到MDCK細(xì)胞中。將這兩株MDCK細(xì)胞按照常規(guī)方法擴(kuò)增凍存。我們分將只擴(kuò)增ー條基因的MDCK細(xì)胞定名為MDCK-ST3GalIV細(xì)胞，而擴(kuò)增出兩條基因的MDCK細(xì)胞定名為MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 細(xì)胞。2.3目的細(xì)胞的篩選正常MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒之后，使用含有O. 8mg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得具有抗性的細(xì)胞克隆。在含有G418的培養(yǎng)基中，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞死亡。將獲得的抗性細(xì)胞混合克隆用G418進(jìn)行有限稀釋、鑒定選擇之后得到單克隆抗性細(xì)胞株。本發(fā)明中，我們對構(gòu)建好的MDCK_ST3GalIV細(xì)胞和MDCK_hST3GalIV_β 4GalTl細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR鑒定，同時(shí)可在無G418壓カ篩選下，持續(xù)傳代細(xì)胞株，結(jié)果表明外源基因可穩(wěn)定表達(dá)至少10代以上。這些鑒定結(jié)果表明，所得到的MDCK-ST3GalIV細(xì)胞單克隆細(xì)胞株中，ST3GalIV基因開放閱讀框序列cDNA已經(jīng)整合到MDCK細(xì)胞基因組中，能夠隨著MDCK細(xì)胞系傳代而穩(wěn)定持續(xù)地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞中，人源ST3GalIV和人源β l_4GalTl基因開放閱讀框序列cDNA已經(jīng)整合到MDCK細(xì)胞基因組中，能夠隨著MDCK細(xì)胞系傳代而穩(wěn)定持續(xù)地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本發(fā)明首次成功構(gòu)建ー株穩(wěn)定表達(dá)人源ST3GalIV基因的MDCK_ST3GalIV細(xì)胞系和一株穩(wěn)定表達(dá)人源ST3GalIV和人源β l_4GalTl的MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl細(xì)胞系，以期提高細(xì)胞表面的α 2，3-唾液酸豐度。MDCK-hST3GalIV_i3 4GalTl穩(wěn)定細(xì)胞系的建立，不僅為禽流感病毒α 2，3-唾液酸傾向性研究提供重要的研究工具，對于禽流感病毒受體結(jié)合特異性變異株監(jiān)測、抗禽流感病毒藥物篩選、中和抗體的測定以及大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)禽流感病毒疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。實(shí)施例2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面α 2，3_唾液酸的表達(dá)I材料與方法I. I試劑與儀器地高辛標(biāo)記糖鑒別試劑盒(DIGGlycan Differentiation Kit)和 Anti-Digoxigenin-Fluorescein (Anti-DIG FITC)購自 Roche 公司；流式細(xì)胞儀 FACSAria 為美國 BD 公
司產(chǎn)品。I. 2流式細(xì)胞檢測細(xì)胞表面唾液酸的表達(dá)母本MDCK與轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞分別鋪于6孔細(xì)胞板各3個(gè)孔。細(xì)胞長至90%豐度時(shí) (約I. 5X IO6個(gè)細(xì)胞/孔)，胰酶消化，再加入少量10%DMEM，分別收集每孔細(xì)胞至EP管中，1400rpm離心8分鐘，收集細(xì)胞沉淀。以PBS重懸洗漆兩次,再用Buffer I (50mM Tris-HCl>O. 15M NaClUmM MgCl2UmM MnCl2UmM CaCl2,pH7. 5)洗一次。用配置好的封閉稀釋液封閉稀釋液的配制10倍稀釋封閉液于TBS (O. 05M Tris-HCUO. 15M NaCl，pH7. 5)均勻重懸細(xì)胞沉淀，在冰上封閉I小吋。之后按上述方法重復(fù)洗滌步驟，再分別用ー抗DIG標(biāo)記的MAA處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)ー組空白對照，即不加ー抗。一抗處理的方法為加4yL MAA于30yLBuffer I中均勻重懸細(xì)胞沉淀,冰浴I小時(shí)。重復(fù)洗漆步驟，再加入ニ抗，即I μ L Anti-DIGFITC于30 μ I Buffer I中均勻重懸細(xì)胞沉淀，冰浴I小時(shí)，最后PBS洗滌3次用于流式細(xì)胞儀檢測。2.結(jié)果為了檢測α 2，3-唾液酸受體在母本MDCK細(xì)胞、MDCK_ST3GalIV細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞上的含量，我們使用地高辛(DIG)標(biāo)記的α 2，3-唾液酸特異性凝集素，朝鮮槐凝集素(MAA)作為ー抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗DIG抗體作為ニ抗。朝鮮槐凝集素(MAA)能特異性地結(jié)合SAa-2，3Gal。檢測結(jié)果顯示，MDCK_ST3GalIV細(xì)胞中α 2，3_唾液酸受體的含量顯著高于母本MDCK細(xì)胞，而MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞中α 2，3-唾液酸受體的含量均顯著高于母本MDCK細(xì)胞和MDCK-ST3GalIV細(xì)胞(圖3)。熒光強(qiáng)度道數(shù)區(qū)峰圖也顯示，與母本MDCK細(xì)胞相比，MDCK-ST3GalIV細(xì)胞和MDCK_hST3GalIV- β 4GalTl細(xì)胞的道數(shù)區(qū)均向右偏移，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞的偏移量更多(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ST3GalV基因在MDCK-hST3GalIV細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，提高了細(xì)胞表面α 2，3-唾液酸受體的豐度，而人源ST3GalV基因與β l-4GalTl基因在MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞中共表達(dá)(圖3)，進(jìn)ー步提高了其表面的α 2，3-唾液酸受體豐度。實(shí)施例3TCID5(i的測定以及病毒噬斑的測定I材料與方法I. I毒株與試劑H5N1:野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005 (L株)由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室保存(Zhang W J, Xue T, Wu X W, Zhang P H, Zhao G, Peng D X，Hu S L, WangX Qj Liu X W，Liu W B，Liu X F. Increase in viral yield in eggs and MDCK cells ofreassortant H5Nlvaccine candidate viruses caused by insertion of 38amino acidsinto the NA stalk. Vaccine，2011，29:8032-8041.)申請人承諾自申請日起向公眾提供20年。
LR38(H5N1)疫苗候選株為揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建的重組弱毒株(Zhang W J, Xue T, Wu X W，Zhang P H, Zhao G, Peng DX, Hu S L, Wang X Q, Liu X ff, Liu W B, Liu X F. Increase in viral yield in eggs andMDCK cells of reassortant H5Nlvaccine candidate viruses caused by insertion of38amino acids into the NA stalk. Vaccine, 2011，29:8032-8041.) ,HA 和 NA 基因來源于野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005.申請人承諾自申請日起向公眾提供20年。H9N2:野毒株A/Chicken/Shanghai/F/98 (F株)由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室保存(Shi Huoying, Liu XiuFan, ZhangXiaorong, et al. Generation of anattenuated H5Nlavian influenza virusvaccme with all eight genes from avianviruses, Vaccine, 25:7379-7384.)申請人承諾自申請日起向公眾提供20年。TPCK修飾的胰蛋白酶購自Sigma公司。I. 2TCID50 的測定母本MDCK、MDCK-ST3GalIV 和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞分別鋪于 96 孔板，待細(xì)胞密度至90%時(shí)用無血清DMEM洗兩遍，洗去死細(xì)胞以及殘留的血清，然后接種病毒。在冰浴的離心管中用無血清DMEM將病毒液作10倍梯度稀釋，從10_卜10_1(1。同時(shí)在病毒稀釋液中加入TPCK修飾的胰蛋白酶，使其終濃度為I μ g/mL。將病毒稀釋液接種到96孔板中，每ー稀釋度接種8個(gè)孔，100 μ L/孔，然后置于35°C、5%C02培養(yǎng)箱吸附I小吋，每隔20分鐘就晃勻一次。吸附I小時(shí)之后，吸棄接種的病毒稀釋液，加入無血清DMEM，每孔200 μ L，同時(shí)也加入TPCK修飾的胰蛋白酶，使其終濃度為I μ g/mL。H5N1亞型野毒株培養(yǎng)48小時(shí)、H5N1亞型重組弱毒株和H9N2亞型野毒株培養(yǎng)72小時(shí)之后分別吸取上清50 μ L至96孔血凝板中，加入等體積1%雞紅細(xì)胞懸液，30分鐘后觀察每孔的血凝結(jié)果，以血凝活性的有無代表細(xì)胞病變的有無，按Reed-Muench法計(jì)算出半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue cultureinfective dose, TCID50)結(jié)果。I. 3病毒噬斑母本MDCK 細(xì)胞、MDCK_ST3GalIV 細(xì)胞和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞分別鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞密度至90%時(shí)，棄去生長液，用無血清DMEM洗兩遍，洗去死細(xì)胞以及殘留的血清，然后接種病毒。以無血清DMEM稀釋病毒貯存液(10—1 10_8)，加入終濃度I μ g/mL TPCK修飾的胰蛋白酶，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)孔，輕輕晃動6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使加入的病毒稀釋液均勻鋪于細(xì)胞表面上，置于35°C、5%C02培養(yǎng)箱吸附I小時(shí)。吸附I小時(shí)之后，吸棄接種的病毒稀釋液，以無血清DMEM洗兩遍；加入第一層覆蓋液(I. 6%瓊脂2倍2%DMEM=1 :1)，混勻之后鋪于細(xì)胞表面使之完全覆蓋，H5N1亞型重組弱毒株和H9N2亞型野毒株凝膠液中添加終濃度I μ g/mL TPCK修飾的胰蛋白酶，I. 5mL/孔，凝固之后，將細(xì)胞培養(yǎng)板倒置，置于35°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 72小時(shí)之后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入第二層覆蓋液(16%瓊脂'2倍2%DMEM : 1%。中性紅=9 9 2),每孔I. 5mL,凝固之后，將細(xì)胞培養(yǎng)板倒置，置于35°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2Γ48小時(shí)之后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，計(jì)數(shù)空斑，以噬斑形成單位(Plaque forming unit, PFU)表示病毒的感染滴度。2.結(jié)果2. ITCID5c^iJ定結(jié)果為了檢測提高表面α 2，3-唾液酸的MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl細(xì)胞是否更適合禽流感病毒的増殖，我們選擇在H5N1亞型和H9N2亞型毒株中選擇幾株測定TCID5tl (圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不論是H5N1亞型還是H9N2亞型毒株在MDCK_hST3GalW_ β 4GalTl細(xì)胞上測定的滴度均高于在母本MDCK細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV細(xì)胞上的滴度(p〈0. 05)，初步說明我們構(gòu)建的MDCK-hST3GalIV_i3 4GalTl細(xì)胞系因?yàn)楸砻娴摩?2，3_唾液酸豐度提高而比母本MDCK細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV細(xì)胞更適合禽流感病毒的増殖。2. 2病韋嗤斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三株禽流感病毒在母本MDCK細(xì)胞、MDCK-ST3GalIV細(xì)胞和MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 細(xì)胞上均能形成噬斑，但在 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞上比另兩種細(xì)胞形成的噬斑個(gè)體更大，相同病毒稀釋度的孔，出現(xiàn)噬斑的數(shù)量更多，時(shí)間也更早。PFU測定的結(jié)果顯示，同種病毒在MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞上測定的結(jié)果最高(圖6)。病毒噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)ー步表明我們構(gòu)建的MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞系更適合禽流感病毒的増殖。 TCID50和噬斑形成試驗(yàn)的結(jié)果均表明，共表達(dá)人源ST3GalIV和β l_4GalTl基因的MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl細(xì)胞對禽流感病毒的敏感性顯著高于母本MDCK細(xì)胞系和單表達(dá) hST3GalIV 的 MDCK_hST3GalIV 細(xì)胞系，MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞系更適合禽流感病毒的増殖。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK細(xì)胞系，是MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl，其含有 hST3GalIV 和 β l_4GalTl 基因序列；所述hST3GalIV 的基因序列如SEQ ID No: I所示,所述β l-4GalTl的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述細(xì)胞系的保藏號是CGMCC No. 5967。
2.權(quán)利要求I所述的穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和βl_4GalTl的MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，是將帶有編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和帶有編碼β l_4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl基因的細(xì)胞系 MDCK-hST3GalIV- β 4GalTl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述MDCK-hST3GalIV-04GalTl細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下具體步驟 1)MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及抗性細(xì)胞克隆的篩選 轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞密度在6孔板至80% 90%密度時(shí)用于轉(zhuǎn)染；將編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和編碼β l-4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒各I μ g質(zhì)粒于100 μ L無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后添加5 μ L FuGENEeHD轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻之后室溫孵育15分；將上述復(fù)合物覆蓋于細(xì)胞表面，補(bǔ)加無血清Opti-MEM培養(yǎng)基至總體積為2 mL，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后移除培養(yǎng)物，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； 抗性細(xì)胞克隆的篩選轉(zhuǎn)染后36小時(shí)后用胰酶消化細(xì)胞，按1:10的比例傳代至48孔細(xì)胞板中，繼續(xù)用含O. 8 mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200 μ L，每3天換一次篩選培養(yǎng)基，G418持續(xù)篩選10-14天后，可見有抗性細(xì)胞生長；選擇生長狀態(tài)良好的抗性細(xì)胞集落，繼續(xù)用于單克隆細(xì)胞篩選用含O. 8 mg/mL G418的篩選培養(yǎng)基將細(xì)胞密度稀釋至I個(gè)/100 μ L，鋪于96孔細(xì)胞板中50 μ L，每孔補(bǔ)加50 μ L篩選培養(yǎng)基；持續(xù)篩選10天后選擇表達(dá)水平最高的克隆再次按有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，以確保篩選出單克隆抗性細(xì)胞；選出的細(xì)胞依次于96孔、24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存于液氮中； 2)MDCK-hST3GalIV-^4GalTl 細(xì)胞系的鑒定 提取上述所獲具有抗性細(xì)胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，用PCR方法分別通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增人源β -半乳糖苷α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV基因和β 1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶I基因；擴(kuò)增結(jié)果表明MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系已成功構(gòu)建， 用于擴(kuò)增人源半乳糖苷0 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1￥0^136&11￥)的引物3G4F :5’ - ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’3G4R :5’ -TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’ 用于擴(kuò)增人源β 1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(β l-4GalTl)的引物B4G1F :5’ - ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’B4G1R:5’ - CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’。
4.權(quán)利要求I所述MDCK-hST3GalIV-i3l_4GalTl細(xì)胞系用于提高禽流感病毒分離株的生長滴度以及噬斑形成能力。
5.權(quán)利要求I所述MDCK-hST3GalIV-0l_4GalTl細(xì)胞系在生產(chǎn)疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，具體涉及將編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和將編碼β1-4GalT1基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK細(xì)胞系MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1，該細(xì)胞系可用于禽流感病毒疫苗株的大規(guī)模細(xì)胞化培養(yǎng)和生產(chǎn)。
文檔編號C12N7/00GK102839157SQ20121037449
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者劉秀梵, 孫慶, 張文俊, 王曉泉, 胡順林 申請人:揚(yáng)州大學(xué)