專利名稱：表面展示calb的畢赤酵母工程菌及催化合成短鏈芳香酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能在畢赤巴斯德酵母表面展示南極假絲酵母脂肪酶B的基因表 達(dá)載體和展示有高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌，特別是涉及一種用全細(xì)胞酶制劑高效地 催化合成短鏈芳香酯的方法。
背景技術(shù)：
短鏈芳香酯大多具有食用水果香味，如己酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等。這些短 鏈酯不僅是香精、香料重要的組分，更作為常用的主要食品添加劑用于食品、飲料、釀造行 業(yè)，僅我國的己酸乙酯，每年產(chǎn)量就達(dá)2千多噸，產(chǎn)值數(shù)億元。目前生產(chǎn)中所使用的這些酯 類香精主要是在無機(jī)催化劑存在下通過化學(xué)法合成的，其生產(chǎn)工藝常涉及高溫、高壓及強(qiáng) 酸、強(qiáng)堿，對(duì)環(huán)境污染大。酶法催化合成短鏈芳香酯具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、催化專 一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。美國FDA認(rèn)為酶法生產(chǎn)的產(chǎn)品是"natural"(天然的)，因而酶法生產(chǎn)的短 鏈芳香酯，符合人們對(duì)天然高品質(zhì)的、有利于環(huán)境保護(hù)和可再生利用產(chǎn)品的日益增長(zhǎng)的需 求。 但是，短鏈芳香酯的脂肪酶催化生產(chǎn)停滯在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室水平，主要存在脂肪酶 的規(guī)模制備困難、回收率低、固定化酶成本較高等生產(chǎn)瓶頸以及催化反應(yīng)本省反應(yīng)周期長(zhǎng)、 產(chǎn)物產(chǎn)率低等瓶頸，其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)不可能。 來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)是 一類重要的脂肪酶，在酯化、水解、轉(zhuǎn)酯、以及其它類型反應(yīng)中都顯示了較其它脂肪酶更為 出色的催化性能?；贑ALB的優(yōu)良特性，人們對(duì)其進(jìn)行了商業(yè)化的開發(fā)，但高成本依然限 制了 CALB廣泛應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)。 利用酵母表面展示技術(shù)，外源CALB可借助于錨定在細(xì)胞壁的載體蛋白a -凝集素
固定在酵母細(xì)胞表面，類似酶的固定化，保持了脂肪酶相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和原有的生物
活性，省去了酶的分離純化以及固定化等步驟，更擁有固定化酶回收方便、可重復(fù)使用的優(yōu)
點(diǎn)，具有良好的操作穩(wěn)定性。近來，日本的研究學(xué)者嘗試將野生型CALB展示于釀酒細(xì)胞表
面，但酶在釀酒酵母細(xì)胞表面展示后表現(xiàn)出催化效率偏低，制約了應(yīng)用(T. Tanino，T. 0hno，
T. Aoki， H. Fukuda， A. Kondo， Appl. Microbiol. Biotechol. 2007， 5 :1319-1325.) 中國發(fā)明專利CN1223300公開了一種微生物脂肪酶酶法合成酯的方法，所用的
酶為自產(chǎn)華根霉脂肪酶或商業(yè)化的固定化酶Lypozyme IM脂肪酶，催化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)
10-36h，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本也較高，縮短反應(yīng)周期，降低酶制備成本是促進(jìn)短鏈芳香酯酶法
生產(chǎn)工業(yè)化的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供反應(yīng)l-6h后產(chǎn)率均可達(dá)到90%以 上、操作穩(wěn)定性好、成本低的全細(xì)胞酶制劑催化合成短鏈芳香酯的方法。
本發(fā)明的另一 目的在于提供表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌株。
利用該方法可生產(chǎn)的短鏈芳香酯包括乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、
己酸丁酯、己酸己酯、己酸辛酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和丁酸異戊酯。 —種表面展示CALB的巴斯德畢赤酵母(GS115/pKNS-CALB Pichia
pastorisGS115/pKNS-CALB)于2009年9月30日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)
為CCTCCN0 :M 209217，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)(郵編430072)。應(yīng)用表面展示CALB的畢赤酵母工程菌催化合成短鏈芳香酯的方法，包括如下步
驟 (1)將所述表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，收獲菌體，真空冷 凍干燥24h以上，制成全細(xì)胞酶制劑； (2)短鏈芳香酯的合成采用短鏈酸和短鏈醇為原料，以所述全細(xì)胞酶制劑為催 化劑，以能夠溶解短鏈酸和短鏈醇的液態(tài)物質(zhì)為溶劑，進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到短鏈芳香酯產(chǎn) 品；底物中所述短鏈酸含量為0. 2mol/L lmol/L，短鏈酸和短鏈醇的摩爾比為1 : 0. 75 1 : 2，酯化反應(yīng)溫度為20-6(TC;反應(yīng)物中全細(xì)胞酶制劑在反應(yīng)體系中的濃度為10-40g/L， 反應(yīng)時(shí)間l-6h ; 所述的溶劑選自正己烷、正庚烷、異辛烷中的一種或多種；
所述短鏈酸為C鏈長(zhǎng)度C2-C10的直鏈酸；
所述C鏈長(zhǎng)度為C2-C10的直鏈或支鏈醇。 所述的C鏈長(zhǎng)度為C2-C10的直鏈或支鏈醇為乙醇、丁醇、辛醇、己醇或異戊醇。
所述的C鏈長(zhǎng)度C2-C10的直鏈酸為乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸。
所述的全細(xì)胞酶制劑為表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉。
本發(fā)明提供了指導(dǎo)CALB在畢赤酵母表面展示實(shí)現(xiàn)展示的酵母展示表達(dá)載體 pKNS-CALB，此展示表達(dá)載體是在商用載體pPIC9K(Invitrogen公司真核表達(dá)載體)的基礎(chǔ) 上利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I將原載體上的信號(hào)肽部分基因切除，在此基礎(chǔ)上引 入南極假絲酵母脂肪酶B與來源于釀酒酵母的a凝集素的融合基因。凝集素位于融合蛋 白C端，可共價(jià)錨定在酵母細(xì)胞壁上，位于N端的CALB可借助a凝集素定位于細(xì)胞壁實(shí)現(xiàn) 在畢赤酵母細(xì)胞表面展示。該重組質(zhì)粒主要包含5' A0X1 (醇氧化酶-1基因的啟動(dòng)子)、 3'A0X1 (醇氧化酶-1基因的轉(zhuǎn)錄終止子)、CALB (南極假絲酵母脂肪酶B) 、NS ( a凝集素基 因)、HIS4(組氨酸脫氫酶基因)，以及Amp+(氨芐青霉素抗性)、Kna+(卡那霉素抗性)等元 件。 菌體干粉制備過程如下首先，針對(duì)南極假絲酵母脂肪B基因和來源于a凝集素 設(shè)計(jì)拼接引物，以南極假絲酵母基因組和釀酒酵母基因組為模板或含脂肪酶基因、a凝集 素的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，融合基因PCR產(chǎn)物與商用載體pPIC9K經(jīng) 同樣的限制性內(nèi)切酶處理，經(jīng)T4連接酶體外連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布抗性平板， 挑選鑒定陽性單克隆。陽性單克隆搖瓶培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒pKNS-CALB。重組質(zhì)粒pKNS-CALB 線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌，轉(zhuǎn)化物涂布抗性平板，28 32t:培養(yǎng)2 3d后，篩選獲得 重組轉(zhuǎn)化子。重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)BMGY擴(kuò)大培養(yǎng)24 48h后，采用6000g 10000g離心力室 溫離心收集菌體，再用同體積的B匪Y誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24h添加甲醇至終濃度為1 2%。 7000g 10000g離心力、4t:離心10 15分鐘，棄上清，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經(jīng)真空冷凍干燥24h以上收獲菌體干粉。 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果 本發(fā)明采用以展示有高活力CALB的畢赤酵母全細(xì)胞酶制劑作為催化劑，具有固 定化酶的優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)率高、操作穩(wěn)定性好。反應(yīng)后離心收集菌體即可重復(fù)利用，大 大降低生產(chǎn)成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化學(xué)載體固定脂肪酶生產(chǎn)短鏈芳香 酯，符合天然產(chǎn)物的要求。畢赤酵母全細(xì)胞酶制劑凍干粉在非水相的反應(yīng)體系中，以有機(jī)溶 劑為溶劑，能有效的催化短鏈酸和短鏈醇酯化生成短鏈芳香酯，反應(yīng)卜6h后，酸的摩爾轉(zhuǎn) 化率可達(dá)到或超過90%，經(jīng)過IO批次的連續(xù)使用，全細(xì)胞酶制劑催化的相對(duì)轉(zhuǎn)化率保持在 85%以上，具有良好的操作穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，需要說明的是，這些實(shí)施例并不構(gòu)成
對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例1 表面展示南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母全細(xì)胞酶制劑的生產(chǎn)。
首先，根據(jù)南極假絲酵母脂肪酶(calb)基因LF058的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(上游 引物為5' TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3'，引入了 EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物5' GAGGCCGTAGCAGTGGGGATGCGCATAGAGCTCAGGTCCTCCACGAG 3'，引入Mlu I酶切位點(diǎn))。以南 極假絲酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)calb， PCR程序如下95。C預(yù)變性5min，以 94°C lmin、60。C lmin、72。C lmin進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。 其次，根據(jù)a凝集素的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5'CTCCGGCATCGTCACCCC TACGCGTATCTCGAGTCCAGGAGGTGCTC 3'，引入CALB基因下游末尾19bp和Mlul酶切位點(diǎn)，下 游引物為5'ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3'，引入Not I酶切位點(diǎn)。以含有 a凝集素的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行a凝集素的PCR擴(kuò)增。PCR程序如下94。C預(yù)變性5min， 以94。C lmin、58。C lmin、72。C lmin進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。 上述兩種PCR產(chǎn)物分別取1 ii L作為模板加入新的PCR體系擴(kuò)增CALB-NS融合基因 片段(上游引物采用擴(kuò)增CALB的上游引物5'TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3'，下 游引物采用擴(kuò)增a凝集素的下游引物5'ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3')。 PCR程序如下:94。C預(yù)變性5min，95。C lmin、55。C 1. 5min、72。C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72。C延 伸10min。融合基因產(chǎn)物純化后經(jīng)Eco RI和Not I酶切，同時(shí)把20 y L質(zhì)粒pPIC9K經(jīng)Eco RI和Not I酶切，純化后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coli Top10，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pKNS-CALB經(jīng)Sac I線性化后用電轉(zhuǎn)移的方轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115。涂轉(zhuǎn)化物涂布于G418梯度平板，3(TC培養(yǎng)2d。挑取部分抗高濃度G418的轉(zhuǎn)化子接 種于5ml YPD培養(yǎng)液，3(TC，250r/min培養(yǎng)過夜，堿滴定法檢測(cè)脂肪酶活力，得到表面展示 CALB的畢赤酵母工程菌菌株(Pichia pastoris GS115/pKNS-CALB)，該菌株于2009年9月 30日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 209217，保藏地址為湖北省 武漢市武漢大學(xué)(郵編430072)。畢赤酵母工程菌菌株先經(jīng)YPD種子液培養(yǎng)，經(jīng)BMGY擴(kuò)大 培養(yǎng)24h后；6000g室溫離心收集菌體。再用同體積的B匪Y誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24h添加甲醇 至終濃度為1%。 3(TC、250rpm搖床培養(yǎng)4d。 7000rpm、4t:離心10分鐘，棄上清，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經(jīng)真空冷凍干燥24h，得菌體凍干粉。
實(shí)施例2 以乙酸和乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備乙酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入 后，無水乙醇的濃度為O. 5mol/L，冰醋酸的濃度為0.4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸 288. 6ii L，無水乙醇291. 2ii L，正庚烷9420. 2ii L，酸醇摩爾比為1 : 1. 25)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量為30g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度4(TC，然后于 200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，乙酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到92. 1 % ，反應(yīng) 時(shí)間僅為產(chǎn)率接近的報(bào)道的1/26。
實(shí)施例3 以丁酸和異戊醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備丁酸異戊酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將異戊醇和丁酸加入正庚烷中。加入后，異戊 醇的濃度為0. 88mol/L， 丁酸的濃度為0. 8mol/L。取10mL底物(其中丁酸734. 3 y L，異戊 醇957. 7iiL，正庚烷8308iiL，酸醇摩爾比為l : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含 量為20g/L的實(shí)施例l制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度5(TC，然后于200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h 后加入0.6g分子篩，反應(yīng)3h，丁酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到97X，同楊本宏報(bào)道的(楊本宏.非水 相脂肪酶催化合成丁酸異戊酯.中國食品添加劑，2005， 5 :74-79)的根霉PW358經(jīng)固態(tài)發(fā) 酵生產(chǎn)的脂肪酶催化丁酸異戊酯的合成相比，反應(yīng)時(shí)間縮短了 2h。
實(shí)施例4 以己酸與乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備己酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，無 水乙醇的濃度為1. lmol/L，正己酸的濃度為lmol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L， 無水乙醇512. 4iiL，正庚烷8487. 6iiL，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角 瓶中，加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于200rpm下 振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)1. 5h，己酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到97. 97% 。產(chǎn)率接近 目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)率(98% )，反應(yīng)時(shí)間縮短為報(bào)道的全細(xì)胞催化反應(yīng)時(shí)間的1/8(報(bào) 道的最高水平為12h，產(chǎn)率98%， Shuang-yan Han， et al. Highly efficient synthesis of ethylhexanoate catalyzed by CALB_displaying Saccharomyces cerevisiae whole—cells in non—叫ueousphaseJournal of Molecular Catalysis B :Enzymatic， 2009,59 :168-172)。在上述條件下反應(yīng)后，離心回收菌體，經(jīng)溶劑正庚烷洗滌，去除產(chǎn)物和 殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應(yīng)體系中催化酯化反應(yīng)，經(jīng)過10批次的連續(xù) 使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的轉(zhuǎn)化率保持在90%以上。
實(shí)施例5 以己酸與丁醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備己酸丁酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將正丁醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正丁 醇的濃度為0. 88mol/L，正己酸的濃度為0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L，正 丁醇805. 3iiL，正庚烷8194. 7iiL，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶中， 加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55°C ，然后于200rpm下振蕩反 應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，己酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到97. 07% 。
實(shí)施例6 以丙酸與乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備丙酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和丙酸加入正庚烷中。加入后，無 水乙醇的濃度為0. 75mol/L，丙酸的濃度為0. 6mol/L。取10mL底物(其中丙酸448. 1 y L， 無水乙醇436. 7iiL，正庚烷9115. 2iiL，酸醇摩爾比為1 : 1. 25)混合物于50mL具塞三角 瓶中，加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度50°C ，然后于200rpm下振 蕩反應(yīng)，0.5h后加入0.6g分子篩，反應(yīng)3h，丙酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到96. 19%。比報(bào)道的(葛 清秀等.堿性脂肪酶催化合成丙酸乙酯的研究.泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，22(6) :987-101) 利用擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶催化丙酸乙酯合成時(shí)，丙酸為0. 2mol/L，酸醇=1 : 1. 25的條 件下，48h丙酸轉(zhuǎn)化率為75. 7%的反應(yīng)時(shí)間縮短為1/8，產(chǎn)率提高到96%以上。
實(shí)施例7 以冰醋酸和異戊醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備乙酸異戊酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將異戊醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入后，異 戊醇的濃度為0. 5mol/L，冰醋酸的濃度為0. 4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸288. 6 y L， 異戊醇544. 1 ii L，正庚烷9167. 3 y L，酸醇摩爾比為1 : 1. 25)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量為30g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度40°C ，然后于200rpm下振蕩 反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，冰醋酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到96. 30% 。產(chǎn)率接近現(xiàn)有技 術(shù)(楊本宏.非水溶劑中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三種酯的最佳條件.中國生 物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2003，19(5) :572-575)報(bào)道的97%的同時(shí)，底物濃度提高1倍，而
反應(yīng)時(shí)間縮短了三分之二。
實(shí)施例8 以丁酸和乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備丁酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正丁酸加入正庚烷中。加入后， 無水乙醇的濃度為0.88mol/L，正丁酸的濃度為0.8mol/L。取10mL底物(其中正丁酸 734. 3iiL，無水乙醇512. 4iiL，正庚烷8753. 3iiL，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于 200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正丁酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到97. 44% 。
實(shí)施例9 以己酸和己醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備己酸己酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將正己醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正 己醇的濃度為O. 88mol/L，正己酸的濃度為0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L， 正己醇1102.9iiL，正庚烷7897. liiL，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量為30g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于200rpm下振蕩 反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正己酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到98. 01 % 。
實(shí)施例10 以正己酸和正辛醇己醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備己酸辛酯。 試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將正辛醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正 辛醇的濃度為O. 88mol/L，正己酸的濃度為0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L，正辛醇1383. 3 ii L，正庚烷7616. 7 y L，酸醇摩爾比為1 : 1.1)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量為30g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于200rpm下振蕩 反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正己酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到97. 85% 。
實(shí)施例11 以庚酸和乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備庚酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正庚酸加入正庚烷中。加入后， 無水乙醇的濃度為0.88mol/L，正庚酸的濃度為0.8mol/L。取10mL底物(其中正庚酸 1142. 9ii L，無水乙醇512. 4ii L，正庚烷8344. 7ii L，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于 200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正庚酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到96. 25% 。
實(shí)施例12 以正辛酸和乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備辛酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正辛酸加入正庚烷中。加入后， 無水乙醇的濃度為0.66mol/L，正辛酸的濃度為0.6mol/L。取10mL底物(其中正辛酸 950. 8 ii L，無水乙醇384. 3 y L，正庚烷8664. 9 y L，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量為20g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后干 200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正辛酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到94. 21 % 。
實(shí)施例13 以正癸酸和乙醇為底物，全細(xì)胞酶制劑催化非水相酯化反應(yīng)制備癸酸乙酯。
試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正癸酸加入正庚烷中。加入后， 無水乙醇的濃度為0.66mol/L，正癸酸的濃度為0.6mol/L。取10mL底物(其中正癸酸 1161. 3ii L，無水乙醇384. 3ii L，正庚烷8454. 4ii L，酸醇摩爾比為1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量為30g/L的實(shí)施例1制備的菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55t:，然后于 200rpm下振蕩反應(yīng)，0. 5h后加入0. 6g分子篩，反應(yīng)3h，正癸酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到90. 35% 。如上所述即可較好實(shí)施本發(fā)明。序列表〈110〉華南理工大學(xué)〈120〉表面展示CALB的畢赤酵母工程菌及催化合成短鏈芳香酯的方法〈130>5〈160>4〈170>PatentIn version 3.〈210>1〈211>32〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>1tgtagaattc ctgccttccg gttcggaccc tg 32〈210>1〈211>47
〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>2gaggccgtag cagtggggatgcgcatagagctcaggtcctccacgag 47〈210>3〈211>47〈212>核苷酸〈213〉人工序列〈400>3ctccggcatc gtcacccctacgcgtatctcgagtccagg3ggtgctc 47〈210>4〈211>36〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>4attegcggcc gctteg朋tegcaggtacga3權(quán)利要求
一種表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌株，其特征在于包藏號(hào)為CCTCC M 209217。
2. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述的表面展示CALB的畢赤酵母工程菌催化合成短鏈芳香酯的方 法，其特征在于包括如下步驟(1) 將所述表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，收獲菌體，真空冷凍干 燥24h以上，制成全細(xì)胞酶制劑；(2) 短鏈芳香酯的合成采用短鏈酸和短鏈醇為原料，以所述全細(xì)胞酶制劑為催化劑， 以能夠溶解短鏈酸和短鏈醇的液態(tài)物質(zhì)為溶劑，進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到短鏈芳香酯產(chǎn)品；底物 中所述短鏈酸含量為0. 2mol/L lmol/L，短鏈酸和短鏈醇的摩爾比為1 : 0. 75 1 : 2， 酯化反應(yīng)溫度為20-6(TC;反應(yīng)物中全細(xì)胞酶制劑在反應(yīng)體系中的濃度為10-40g/L，反應(yīng)時(shí) 間l-6h ;所述的溶劑選自正己烷、正庚烷、異辛烷中的一種或多種； 所述短鏈酸為C鏈長(zhǎng)度C2 C10的直鏈酸； 所述C鏈長(zhǎng)度為C2-C10的直鏈或支鏈醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用表面展示CALB的畢赤酵母工程菌催化合成短鏈芳香酯 的方法，其特征在于所述的C鏈長(zhǎng)度為C2-C10的直鏈或支鏈醇為乙醇、丁醇、辛醇、己醇或 異戊醇。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用表面展示CALB的畢赤酵母工程菌催化合成短鏈芳香酯 的方法，其特征在于所述的C鏈長(zhǎng)度C2-C10的直鏈酸為乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛 酸、癸酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用表面展示CALB的畢赤酵母工程菌催化合成短鏈芳香 酯的方法，其特征在于所述的全細(xì)胞酶制劑為表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌體凍干 粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了表面展示CALB的畢赤酵母工程菌及催化合成短鏈芳香酯的方法。該方法將表面展示CALB的畢赤酵母工程菌菌株搖瓶發(fā)酵，收獲菌體，真空冷凍干燥24h以上，制成全細(xì)胞酶制劑；采用短鏈酸和短鏈醇為原料，以全細(xì)胞酶制劑為催化劑，以能夠溶解短鏈酸和短鏈醇的液態(tài)物質(zhì)為溶劑，進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到短鏈芳香酯產(chǎn)品；酯化反應(yīng)溫度為20-60℃；反應(yīng)物中全細(xì)胞酶制劑在反應(yīng)體系中的濃度為10-40g/L，反應(yīng)時(shí)間1-6h。該方法較以往報(bào)道反應(yīng)時(shí)間大大縮短、產(chǎn)率高達(dá)98％、連續(xù)操作穩(wěn)定性好，且反應(yīng)后全細(xì)胞催化劑經(jīng)離心回收即可重復(fù)利用，大大降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101792721SQ200910192910
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者林影, 鄭穗平, 金子, 韓雙艷, 黃登峰 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)