專利名稱：重組脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒樣顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經(jīng)過密碼子優(yōu)化的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型Pl基因和3CD基因，通過酵母表達系統(tǒng)制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒的方法。
背景技術(shù)：
脊髓灰質(zhì)炎作為一種疾病，兩百多年前已有文字記載，1789年Underwood首次對該病進行了描述[Underwood M. A Treatise of Children with General Directionsfor anagement of Infants from Birth, 2nd ed. London:Matthews; 1789.]。從 1948 年開始，人類開始不斷確定不同脊髓灰質(zhì)炎病毒株的數(shù)量，小兒麻痹癥國家基金委員會1951年報道了只有3型脊灰病毒可以引起脊灰，根據(jù)血清型分別命名為I、II、III型[Committee
on Typing of the National Foundation for Infantile Paralysis. Immunologicclassification of poliomyelitis viruses:a cooperative program for the typing ofone hundred strains. Am JHyg 54:191-274,1951]。脊髓灰質(zhì)炎病毒的三種抗原類型(血清I、IIJII型)除了免疫原型不同外，其他方面都非常類似。每型的基因組序列都已完全確定，包括3種Sabin 口服脊灰疫苗株。對于脊髓灰質(zhì)炎病毒來說，只有蛋白質(zhì)外殼的編碼序列是獨特的，因為在自然循環(huán)中，側(cè)面的序列經(jīng)常會通過與相近的腸道病毒(腸道病毒C種)重組而發(fā)生變化。脊髓灰質(zhì)炎病毒普遍存在、傳染性高并具有季節(jié)性(溫帶氣候國家更明顯)，未免疫人群中幾乎所有人均可感染脊髓灰質(zhì)炎病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒感染者中少數(shù)人(小于1%)可出現(xiàn)麻痹癥狀，如頓挫型、非麻痹型和麻痹型脊髓灰質(zhì)炎，也可引起無菌性腦膜炎。I型脊髓灰質(zhì)炎病毒在3種型中最具神經(jīng)侵襲性，多數(shù)脊灰流行及地方性流行病例都是由I型脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的，其次為III型和II型。傳播高峰發(fā)生在嬰兒和小年齡兒童(熱帶地區(qū))及學(xué)齡兒童(溫帶地區(qū))。脊髓灰質(zhì)炎是人傳人疾病，通過糞-口、口- 口途徑傳播，少數(shù)情況通過共同媒介(如水、牛奶)傳播。其感染性主要在麻痹出現(xiàn)前及出現(xiàn)后f 2周，因此其傳染期可能達41周，家庭易感者或其接觸者的繼發(fā)感染率很高(可能因為糞-口傳播)，大于 90%。脊髓灰質(zhì)炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae ),腸道病毒屬(Enterovirus)。其毒粒為球形正二十面體立體對稱,直徑約為27_30nm,無包膜,其核衣殼包含單股正鏈RNA基因組，約由7500個核苷酸組成。其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區(qū)，Pl區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3’端非編碼區(qū)。Pl區(qū)編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白，其轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶水解后，最終得到4個蛋白產(chǎn)物，分別為VP4(1A)，VP2(1B), VP3 (IC)及VP4 (ID)，其衣殼結(jié)構(gòu)由60個亞單位片段組成，每個片段由4種衣殼蛋白(從VPl到VP4)組成。脊髓灰質(zhì)炎病毒主要的中和抗原位點位于VP1，VP2和VP3上，通過中和單克隆抗體反應(yīng)模式已經(jīng)確定了 4個中和抗原的位點，這樣的定位已經(jīng)被高分辨率X涉嫌晶體學(xué)所證實。
脊髓灰質(zhì)炎可注射滅活疫苗(IPV)或口服減毒活疫苗(OPV)預(yù)防，盡管有兩種非常有效的疫苗可以使用，脊髓灰質(zhì)炎在世界范圍內(nèi)仍然是重要公共衛(wèi)生問題。單價OPV可以克服一些三價OPV的局限性，包括3型Sabin株之間的相互干擾。因為三價OPV中II型組分比其他組分有明顯較強的免疫原型，受種者通常II型血清首先發(fā)生陽轉(zhuǎn)。相反，單價疫苗可以根據(jù)規(guī)劃需求得到所要求的型特異性免疫應(yīng)答。在發(fā)展中國家和發(fā)達國家單價OPV均表現(xiàn)出比三價OPV有較強的誘導(dǎo)型特異性免疫應(yīng)答的免疫原型性。與OPV相關(guān)的主要不良反應(yīng)是VAPP，其發(fā)生率是每100萬OPV服疫苗中少于O. 3個病例，即< O. 3/100萬劑；年平均VAPP的發(fā)病率為每100萬人口發(fā)生O. 14例。免疫缺陷人群發(fā)生VAPP的風(fēng)險性最高，幾乎所有病例均發(fā)生在先天性或獲得性免疫缺陷患者中。最近，一個帶有歷史因素的安全性問題被提出，與OPV—樣，IPV中也含有猴病毒(SV40)，來自疫苗早期生產(chǎn)和使用過程中的原代恒河猴腎細(xì)胞[Butel JS, Lednicky JA. Cell and molecular biology of simianvirus 40: implications for human infections and disease. J Natl Canceer Inst91:119-134,1999]。研究表明，SV40可以使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，并可導(dǎo)致動物產(chǎn)生腫瘤[Dang-Tan T, Mahmud SM, PuntoniR, Franco EL. Polio vaccines, Simian Virus 40, andhuman cancer: the epideminologic evidence for a causal association. Oncogene 23:6535-6540, 2004]。根據(jù)報道，接受IPV免疫的全身性紅斑狼瘡病人中約有6%發(fā)病。病毒樣顆粒在形態(tài)上和真實的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預(yù)防性疫苗的開發(fā)提供了理想的備選方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明所提供的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒的制備方法包括如下步驟I)將脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達載體；2)用步驟I)得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細(xì)胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒。上述步驟I)中，所述Pl基因和所述3⑶基因均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒I型Pl蛋白和野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒I型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒I型Pl基因和野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒I型3CD基因的密碼子替換為酵母細(xì)胞偏好(高頻使用)的密碼子。所述優(yōu)化還包括對Pl基因序列和3CD基因序列的其他改造，以適合在酵母細(xì)胞中表達。本發(fā)明中使用的術(shù)語“偏好的密碼子”具有本領(lǐng)域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物體更偏愛使用某些同義三聯(lián)密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。在本發(fā)明的一個實施例中，上述步驟I)中所述Pl基因(經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因，命名為Polio I PlY)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3⑶基因(經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因，命名為Polio I 3CDY)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細(xì)胞中表達，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述步驟2)中，所述目的酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個實施例中，所述目的酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述Pl基因和所述3⑶基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動所述Pl基因的啟動子方向和驅(qū)動所述3CD基因的啟動子方向相反。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處得到的重組質(zhì)粒，具體可將所述3CD基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點
2(MCS2/myc)的Sal I和Kpn I之間，將所述Pl基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點I (MCS1/FLAG)的 Spe I 和 Pac I 之間。
利用本發(fā)明所提供的方法制備得到的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因和3CD基因。本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因(Polio I PlY)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的3⑶基因(Polio I 3⑶Y)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細(xì)胞中表達，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，序列I由2646個核苷酸組成，為優(yōu)化后脊髓灰質(zhì)炎病毒I型Pl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列5所示的蛋白，序列5由881個氨基酸組成；序列2由1938個核苷酸組成，為優(yōu)化后的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型3CD基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列6所示的蛋白，序列6由645個氨基酸組成。含有上述密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3⑶基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體可為將所述Pl基因和所述3⑶基因分別插入到pESC-URA質(zhì)粒的兩個多克隆位點處，得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌可為攜帶有上述密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因的重組酵母細(xì)胞。所述酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個實施例中，所述酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述表達盒由能夠啟動所述密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因表達的啟動子，所述密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因，以及轉(zhuǎn)錄終止子組成。在本發(fā)明的一個實施例中，所述啟動子具體為釀酒酵母GALl和GALlO啟動子，當(dāng)然也可以使用其他公知的酵母啟動子的任何一種，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK啟動子，或者其他真核基因啟動子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述轉(zhuǎn)錄終止子具體為ADHl和CYCl終止子。上述密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的Pl基因或3CD基因在制備下述a)或b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍a)脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒；
b)以脊髓灰質(zhì)炎病毒I型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。本發(fā)明還涉及并提供了在重組宿主細(xì)胞中同時表達Polio I Pl蛋白和3⑶蛋白的方法，該方法包括(I)將含有編碼PoliO I Pl蛋白和3⑶蛋白的編碼基因的重組表達載體導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSC1)。(2)在允許所述的PolioI Pl蛋白和3CD蛋白同時表達的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSCl)。本發(fā)明對野生型的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型(Poliovirus I，Polio I )的Pl基因或3⑶基因進行了酵母細(xì)胞偏好型密碼子優(yōu)化，從而提高了 Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細(xì)胞中的表達水平。在本發(fā)明中，Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細(xì)胞中同時表達，Polio I 3CD蛋白對Polio I Pl蛋白進行酶切后得到VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白(3⑶是3C的前體，由3⑶蛋白產(chǎn)生的3C蛋白為一種蛋白酶，可將Pl蛋白水解為VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白)。這四種結(jié)構(gòu)蛋白進而自行組裝成的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型的病毒樣顆粒(Polio I VLPs)。
實驗證明，利用本發(fā)明所提供的方法，在酵母表達系統(tǒng)(釀酒酵母INVSC1)中成功的制備了 Polio I VLPs，本發(fā)明對Pl基因和3⑶基因的密碼子優(yōu)化提高了 Polio I VLPs在酵母表達系統(tǒng)中的產(chǎn)量。所述Polio I VLPs可以用于制備基于VLP的Polio I單價預(yù)防性疫苗。


圖I為pESC-3⑶Y質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道A為15000bp DNAMarker ；泳道B為pESC-URA質(zhì)粒對照；泳道C為pESC-3CDY質(zhì)粒。圖2為pESC-3CDY質(zhì)粒的Sal I及Kpn I酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC_3⑶Y質(zhì)粒的Sal I及Kpn I酶切鑒定結(jié)果。圖3為PESC-P1Y-3CDY質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC_3CDY質(zhì)粒對照；泳道C為pESC_PlY_3CDY質(zhì)粒。圖4為PESC-P1Y-3CDY質(zhì)粒的SpeI及Pac I酶切鑒定結(jié)果。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道 B 為 pESC_PlY_3CDY 質(zhì)粒的 SpeI 及 Pac I 酶切鑒定結(jié)果。圖5為Western Blot鑒定重組Polio I衣殼蛋白的表達。其中，泳道A和泳道D為蛋白分子量對照；泳道8為INVSCl/pESC-PlY-3CDY蛋白提取物(實驗組);泳道C為PolioI陽性對照蛋白(陽性對照)AIdtE為INVSCl/pESC-URA酵母蛋白提取物(空載體對照)。圖6為通過透射電鏡技術(shù)顯現(xiàn)的Polio I病毒樣顆粒(VLPs)的代表樣品(實驗組待測樣品)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例UPolio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成以下按分步驟詳細(xì)描述Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成的流程。
UPolio I Pl基因和Polio I 3CD基因的密碼子優(yōu)化根據(jù)野生型Polio I Pl基因序列(如序列表中序列3所示，該基因命名為Polio I PlW)和野生型Polio I 3⑶基因序列(如序列表中序列4所示，該基因命名為Polio I 3CDW)，經(jīng)過設(shè)計和反復(fù)驗證得到適合于在酵母細(xì)胞中表達的優(yōu)化型Polio I Pl基因序列和優(yōu)化型Polio I 3⑶基因序列，即將Polio I病毒的Pl基因序列和3⑶基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉(zhuǎn)變成含有如Sharp PM等(Sharp PM, Cowe E. SynonymousCodon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991，7 (7) :657-678.)所描述的酵母優(yōu)選密碼子的優(yōu)化序列，從而提高Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的表達水平。根據(jù)上述方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設(shè)計的優(yōu)化型Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因，分別命名為Polio I PlY和Polio I 3⑶Y，其基因序列分別為序列表中 序列I和序列2。Polio I PlY基因(序列I)編碼的蛋白與序列3所示野生型Polio I Pl基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列5所不氣基酸序列組成的蛋白；Polio I 3CDY基因(序列2)編碼的蛋白與序列4所示野生型Polio I 3CD基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列6所示氨基酸序列組成的蛋白。2、密碼子優(yōu)化型Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的全基因合成使用序列重疊延伸PCR法全基因合成Polio I PlY和Polio I 3⑶Y，具體方法如下根據(jù)優(yōu)化Poli0 I PlY和Polio I 3⑶Y的基因序列合成多條IOObp的上下游片段，兩片段間3’端互補重疊15bp，所述上下游片段互為模板、引物進行PCR擴增，使用凝膠回收試劑盒回收擴增片段，再以此相鄰的回收片段互為引物、模板進行下一輪PCR擴增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物進行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互為模板、引物進行PCR拼接，依此類推最終合成全長的密碼子優(yōu)化型Polio I Pl基因和Polio I 3CD 基因，即 Polio I PlY 和 Polio I 3CDY。實施例2、攜帶Polio I 3⑶Y和Polio I PlY的酵母重組表達載體的構(gòu)建I、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備從37°C培養(yǎng)16 20h的新鮮平板上挑取DH5a單菌落(Takara公司，產(chǎn)品目錄號為D9057S)，接種于5ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜(12 16h)。次日從上述培養(yǎng)物中吸取O. 5ml按體積比1:100轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3h，至菌液的0D600值為3時，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一無菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清,將管倒置Imin,使殘留培養(yǎng)液流盡，以IOml用冰預(yù)冷的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30min。4°C, 4000rpm離心IOmin,棄上清，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，分裝成200 μ I每管，_80°C保存?zhèn)溆谩?、pESC-URA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌吸頭分別吸取I μ g pESC-URA質(zhì)粒(一種具有雙向啟動子的酵母表達質(zhì)粒，購自Angilent technologies，產(chǎn)品目錄號為217454)加入200 μ I上述步驟I制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I 2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購自北京欣經(jīng)科公司，NaCl購自國藥化學(xué)試劑有限公司)，將管轉(zhuǎn)移至37°C搖床上，溫育45min (轉(zhuǎn)速<150rpm)。取50 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應(yīng)抗生素的LB平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12 16h。3、pESC-URA質(zhì)粒的小量制備挑取經(jīng)上述步驟2轉(zhuǎn)化培養(yǎng)所得的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物移入I. 5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30_60s，倒去培養(yǎng)液，倒置離心管，使上清流盡，用100 μ I預(yù)冷的溶液I (終濃度為50mmol/L的葡萄糖，終濃度為25mmol/L的Tris-HCl，終濃度為10mmol/L的EDTA，pH8. O)重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ I新鮮配制的溶液II (終濃度為O. 2mol/L的NaOH，終濃度為質(zhì)量百分含量1%的SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預(yù)冷的溶液IIK配制IOOml溶液III 5mol/L KAc 60ml,冰乙酸 11. 5ml,水 28. 5ml)溫和混勻，冰浴 IOmin, 12000rpm 離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室溫晾干后,用30 μ I含 RNaseA (100μ g/ml)的 TE (pH 8.0)溶解沉淀，37°C水浴 3(T60min 后置 _20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母重組表達載體pESC-3CDY的構(gòu)建將實施例I得到的Po I i ο I 3⑶Y基因克隆到pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點2(MCS2/myc)的SalI和Kpn I之間，得到酵母重組表達載體pESC_3CDY。具體按照如下步驟進行I)將實施例I得到的Polio I 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Sal I和Kpn I (限制性內(nèi)切酶Sal I及Kpn I購自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點。具體操作如下以實施例I得到的Polio I 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Sal I和Kpn I酶切位點的Polio I 3⑶Y基因片段上游引物為5’ -ACGCGTCGACACCATGGGTCCAGGTTTTGATTATGC-3’ (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Sal I酶切位點的序列，該序列的第 14-36 位為序列 2 的第 1-23 位);下游引物為 5’ -GGGGTACCTTAAAAAGAATCCAACCATC-3>(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切位點的序列，其后的序列為序列2的第1919-1938位的反向互補序列)。2)使用限制性內(nèi)切酶Sal I和Kpn I酶切上述步驟3制備的pESC-URA質(zhì)粒，回收骨架載體(大片段，由于小片段大小僅約為45bp，瓊脂糖凝膠電泳時經(jīng)常無法顯示)與經(jīng)同樣酶切的Polio I 3⑶Y基因片段按摩爾比I :5的比例混合，依次加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(T4DNA連接酶及10XT4DNA連接酶緩沖液購自大連寶生物工程有限公司)，反應(yīng)體積為20μ 1，16°C連接過夜，取10 μ I連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到4ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒(圖I)。并用內(nèi)切酶SalI及KpnI對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示，得到大小約為6600bp和2000bp的兩個條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，進一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測序，將測序證實含有Polio I 3⑶Y基因的重組質(zhì)粒命名為pESC-3⑶Y。5、酵母重組表達載體PESC-P1Y-3CDY的構(gòu)建將實施例I制備的所述Polio I PlY基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達載體pESC-3CDY的多克隆位點I (即為pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點1，MCSI/FLAG)的SpeI和Pac I之間，得到酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y。具體按照如下步驟進行I)將實施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)的5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I (限制性內(nèi)切酶Spe I及PacI購自紐英倫生物技術(shù)北京有限公司)的酶切位點。具體操作如下以實施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I酶切位點的Polio I PlY某閔片段h.游引物為5’_GGACTAGTACCATGGGTGCTCAAGTTTCTTC-3 ’ (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Spe I酶切位點的序列，該序列的第12-31位為序列 I 的第 1-20 位)；下游引物為 5’ -CCTTAATTAAGGTTAATAAGTAGTCAAATCT-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Pac I酶切位點的序列，該序列的第13-31位為序列I的第2628-2646位的反向互補序列)。2)使用限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達載體pESC-3⑶Y，回收骨架載體(大片段)與經(jīng)同樣酶切的Polio I PlY基因片段按摩爾比I :5的比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)，依次·加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應(yīng)體積為20 μ 1，16°C連接過夜，取10 μ I連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到4ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒(圖3)。并用內(nèi)切酶Spe I及Pac I對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示，得到大小約為8600bp和2600bp的兩個條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，進一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測序，將測序證實含有Polio I PlY基因的重組質(zhì)粒命名為PESC-P1Y-3CDY。酵母重組表達載體pESC_PlY_3CDY中，啟動所述PolioI PlY基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為釀酒酵母GALlO啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子為ADHl終止子；啟動所述Polio I 3⑶Y基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為釀酒酵母啟動子GAL1，轉(zhuǎn)錄終止子為CYCl終止子。實施例3、重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達及純化I、釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備在釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落INVSc KSaccharomyces cerevisiae,產(chǎn)品目錄號C81000，購自Invitrogen)接種于IOml YPD培養(yǎng)液(購自北京欣經(jīng)科公司)中，30°C振搖培養(yǎng)16h，取合適體積的培養(yǎng)物加入IOml YB)培養(yǎng)液中混勻，使其0D600值為O. 4，30°C振搖培養(yǎng)6h后0D600值為O. 9,將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml無菌的離心管中，室溫1500rpm離心5min,棄上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit (購自 Invitrogen)中的溶液 I (試劑盒自帶)重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min,小心棄上清,用Iml溶液II (試劑盒自帶)重懸沉淀，50 μ I/管分裝滅菌的I. 5ml離心管中，置_70°C保存。2、酵母重組表達載體PESC-P1Y-3CDY轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞將4 μ I實施例2制備的酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y加入到上述步驟I制備的酵母INVSCl感受態(tài)細(xì)胞中，加入500 μ I Sc EasyComp transformation kit (購自Invitrogen)中的溶液III，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻，得到DNA/酵母混合物。將DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取100 μ I涂布URA選擇平板(選擇性培養(yǎng)液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) 1.92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20% (w/v)葡萄糖。)，置30°C孵箱中倒置培養(yǎng)2_4天。隨機挑取5個單克隆菌落接種于IOml URA選擇培養(yǎng)液中，30°C振搖培養(yǎng)16h，離心收集酵母細(xì)胞。將經(jīng)過上述鑒定表明成功轉(zhuǎn)入重組表達載體PESC-P1Y-3CDY的酵母INVSCl細(xì)胞命名為INVSCl/PESC-P1Y-3CDY。同時設(shè)置轉(zhuǎn)入pESC-URA空載體的酵母INVSCl細(xì)胞的對照，將該酵母細(xì)胞命名為INVSCl/pESC-URA ;設(shè)置轉(zhuǎn)入PESC-P1W_3CDW載體的酵母INVSCl細(xì)胞的對照，將該酵母細(xì)胞命名為 INVSCl/pESC-PlW-3CDW (pESC_PlW_3CDW 載體與 pESC_PlY_3CDY 載體相t匕,將其Polio I PlY基因替換為Polio I PlW基因，將Polio I 3CDY基因替換為PolioI 3CDW 基因)。3、重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達及純化I)重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達將經(jīng)過上述步驟2獲得的 INVSCl/pESC-PlY-3CDY (實驗組)、INVSCl/pESC_PlW_3CDW (野生型對照組)和 INVSCl/pESC-URA (空載體對照組)單菌落分別接種于50ml URA選擇培養(yǎng)液(選擇性培養(yǎng)液(Ura_):YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20% (w/v)葡萄糖。)中，30°C振搖培養(yǎng)16h， 取合適體積的培養(yǎng)液接種于500ml URA選擇培養(yǎng)液中，使0D600值為O. 4，30°C振搖培養(yǎng)4h，取合適體積的培養(yǎng)液接種3L URA誘導(dǎo)培養(yǎng)液(YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g,溶于800ml去離子水中，高壓滅菌,冷卻至50°C,加入IOOml無菌的20% (w/v)半乳糖和IOOml無菌的20%麥芽糖)，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養(yǎng)48h，離心收集菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，APV高壓均質(zhì)儀以1500bar循環(huán)破碎3次，4°C 8000g離心15min，收集上清(破碎菌液上清)，置-70°C保存。將I倍體積的50%PEG溶液(50%PEG溶液50g PEG6000 (Ameresco公司)溶于100ml ddH20)緩慢加入到4倍體積的上述破碎菌液上清中，4°C攪拌過夜。第二日，4°C 8000rpm，30min離心，去除上清，收集沉淀。用無菌PBS重懸沉淀，濃縮至樣品原體積的1/10，得到濃縮樣品。2)重組Polio I病毒樣顆粒的純化在離心管中由下至上依次小心加入I. 4g/ml、I. 32g/ml和I. 2g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步驟I)中得到的濃縮樣品)置CsCl不連續(xù)密度梯度(CsCl購自北京欣經(jīng)科公司)，4°C用BeckmanSW32Ti轉(zhuǎn)頭IOOOOOg離心21h，PBS緩沖液重懸沉淀，4°C 13000g離心15min，收集上清液置_70°C保存，得到待測樣品。對純化后的待測樣品通過BCA法(BCA蛋白濃度測定試劑盒購于海門市碧云天)進行蛋白產(chǎn)量測定，結(jié)果顯示利用本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化后的重組表達載體PESC-P1Y-3⑶Y (實驗組)，在酵母表達系統(tǒng)中，每升發(fā)酵液可以制備得到約1-1. 5mg的重組Polio I病毒樣顆粒，遠高于野生型對照組，而空載體對照組沒有包裝出重組Polio I病毒樣顆粒。這一結(jié)果說明，密碼子優(yōu)化有效的提高了 Polio I病毒樣顆粒在酵母表達系統(tǒng)中的產(chǎn)量。實施例4、重組Polio I病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察I、Western Blot鑒定重組Polio I衣殼蛋白的表達利用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒(增強型)(P0010S)，按照說明書操作步驟，對實施例3得到的純化后的待測樣品(實驗組待測樣品或空載體對照組待測樣品)進行蛋白定量。根據(jù)定量結(jié)果，對三種待測樣品各取適量的懸液(保證三種樣品的上樣蛋白總量相等)進行10%SDS-PAGE電泳。用識別Polio I、II、111全蛋白的羊多克隆抗體為一抗(一抗購自ProSci，產(chǎn)品目錄號為35-341)，熒光標(biāo)記兔抗羊抗體為二抗(二抗購自KPL，產(chǎn)品目錄號為072-07-13-06)進行Western Blot分析(蛋白Marker購自Fermentas公司，產(chǎn)品目錄號為SM0671)。同時設(shè)置脊髓灰質(zhì)炎病毒I型sabinl株(poliovirus sabinlstrain) (AKIO N0M0T0, TOSHIKO OMTA, HARUKA TOYODA, et al. Compelte nucleotidesequence of the attenuated poliovirus Sabin lstrain genome. Prac. Natl. Acad.Sci.，1982(79) :5793-5797.)為陽性對照。結(jié)果如圖5所示，實驗組待測樣品和陽性對照樣品均檢測到大小約為27KD (VP3)的Polio I特異性條帶，且實驗組(密碼子優(yōu)化后)所檢測到的Polio I特異性條帶與陽性對照條帶一致；而空載體對照組待測樣品未檢測到Polio I的特異性條帶。2、重組Polio I病毒樣顆粒的電鏡觀察將實施例3得到的純化后的三個待測樣品(實驗組待測樣品或空載體對照組待測樣品)調(diào)整蛋白濃度一致，各取10 μ I懸液滴加在覆蓋鍍碳支持膜上靜止lmin，吸干鍍碳支持膜(購自中鏡科儀，編號BZ110223)表面殘余液體，用2%磷鎢酸(購自中鏡科儀，編號GZ02536)染色lmin，吸干鍍碳支持膜表面殘液，室溫放置干燥后用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，實驗組待測樣品(圖6)可見直徑約30nm左右的病毒樣顆粒的存在。而空載體對照組待測樣品則沒有在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的存在。本實施例的結(jié)果表明，攜帶有密碼子優(yōu)化后的Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的重組表達載體在酵母系統(tǒng)中，成功的包裝出Polio I的病毒樣顆粒。
權(quán)利要求
1.脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟 1)將脊髓灰質(zhì)炎I型的Pl基因和3CD基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達載體； 2)用步驟I)得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細(xì)胞； 3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型脊髓灰質(zhì)炎I型Pl蛋白和野生型脊髓灰質(zhì)炎I型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型脊髓灰質(zhì)炎I型Pl基因和野生型脊髓灰質(zhì)炎I型3CD基因的密碼子替換為酵母細(xì)胞偏好的密碼子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目的酵母細(xì)胞為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動所述Pl基因的啟動子方向和驅(qū)動所述3CD基因的啟動子方向相反。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處各由一個啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄得到的重組質(zhì)粒。
7.利用權(quán)利要求1-6中任一所述方法制備得到的脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒。
8.密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎I型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；和/或 密碼子優(yōu)化型的脊髓灰質(zhì)炎I型的3CD基因，其特征在于所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
9.含有權(quán)利要求8所述Pl基因和/或3CD基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
10.權(quán)利要求8所述Pl基因和/或3CD基因在制備下述a)或b)產(chǎn)品中的應(yīng)用 a)脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒； b)以脊髓灰質(zhì)炎I型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟1)將脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型的P1基因和3CD基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達載體；2)用所述重組表達載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達所述P1基因和所述3CD基因的重組酵母細(xì)胞；3)裂解所述重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒樣顆粒。實驗證明，利用本發(fā)明所提供方法，在酵母表達系統(tǒng)中制備了脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型的病毒樣顆粒，同時較野生型P1基因和3CD基因相比，本發(fā)明對P1基因和3CD基因的密碼子優(yōu)化大大提高了脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型的病毒樣顆粒在酵母表達系統(tǒng)中的產(chǎn)量，可將其進一步用于生產(chǎn)嬰幼兒手足口病候選預(yù)防性疫苗和藥物組合物。
文檔編號C12N1/21GK102876688SQ20121039094
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者盛望, 王曉雯, 趙淼, 張瀟, 曾毅, 李澤琳, 劉偉 申請人:北京工業(yè)大學(xué)