專利名稱：：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花纖維是從胚珠外表皮細(xì)胞分化而來的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。棉花纖維是紡織工業(yè)的重要原料，具有重要的經(jīng)濟價值。纖維質(zhì)量決定其最終的長度與強度。同時，棉纖維細(xì)胞也是研究細(xì)胞伸長、分化和細(xì)胞壁合成等重要生物學(xué)現(xiàn)象的理想系統(tǒng)。所以研究纖維伸長有重要的經(jīng)濟價值和理論意義。棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育過程是細(xì)胞超常伸長和細(xì)胞壁超常加厚的過程。陸地棉長度約為3.0cm左右，陸地棉細(xì)胞壁直徑為11-22um,也就是說長寬比為1000-3000。棉花纖維細(xì)胞的形成一般可以分為四個相互有重疊的時期纖維起始，細(xì)胞伸長(初生壁形成)、次生壁沉積和成熟期。細(xì)胞壁是植物區(qū)別與動物的主要器官之一。初生細(xì)胞壁主要由纖維素、果膠、半纖維素等多糖組成。一些特殊細(xì)胞，如棉花纖維、木質(zhì)部和厚壁組織細(xì)胞，會在停止生長之后繼續(xù)在初生壁內(nèi)部淀積次生細(xì)胞壁，主要有纖維素、半纖維素和少量木質(zhì)素組成。細(xì)胞壁的沉積與改變對植物的生長、發(fā)育以及對外界環(huán)境的響應(yīng)都有重要的作用。它最終決定了細(xì)胞的大小與形狀。植物細(xì)胞壁果膠主要由三類多糖混合而成同聚半乳糖醛酸(HGA)、聚鼠李半乳糖醛酸I(RGI)和聚鼠李半乳糖醛酸II(RG11)。同聚半乳糖醛酸是半乳糖醛酸的同聚物。聚鼠李半乳糖醛酸I是重復(fù)的鼠李糖和半乳糖醛酸二糖單元組成的異聚體,其中鼠李糖殘基還連有阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。聚鼠李半乳糖醛酸II:是經(jīng)過修飾的同聚半乳糖醛酸，是連接結(jié)構(gòu)多樣化的多糖，它在細(xì)胞壁中的含量很低。植物細(xì)胞壁豐富的多糖是由尿苷二磷酸葡萄糖經(jīng)一系列的轉(zhuǎn)化成各種核苷糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶合成的，半乳糖醛酸是組成果膠多糖的主要糖單元。尿苷二磷酸半乳糖醛酸(UDP-galacturonicacid,UDP-GalA)是合成含半乳糖酸酸多糖的活化前體。UDP-GalA是在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶(UDP-D-glucuronicacid4-印imerase，GAE)的催化下由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)異構(gòu)而成的。GAE是一種可逆酶，也可催化由UDP-GalA到UDP-GlcA的轉(zhuǎn)換。2002年，Tokumoto等研究發(fā)現(xiàn)，在纖維伸長期，細(xì)胞壁基質(zhì)多糖(主要是果膠與半纖維素)占細(xì)胞壁糖總量的30-50%，而到次生壁加厚期，該比重迅速下降到3%。1999年，Chanliaud和Gidley等證實，果膠多糖可以通過參與纖維素的淀積而影響細(xì)胞壁的性質(zhì)。同年，Wen等發(fā)現(xiàn)，抑制果膠甲酯酶的表達(dá)可以改變豌豆根部細(xì)胞的性狀,從而使根變短。2003年，Jones等使用阿拉伯聚糖酶水解果膠:RGI，使離體鴨跖草葉片氣孔的開閉功能失去。2006年，Moore等研究Myrot.hamnusflabel1ifolius(經(jīng)過數(shù)次長期干旱失水依然能遇水復(fù)活)的葉子細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，富含阿拉伯聚糖的細(xì)胞壁多糖的存在賦予其多次失水和水化的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。以上研究均表明，果膠多糖對細(xì)胞的伸長和細(xì)胞壁的靈活性非常重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶,是與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)的蛋白，該蛋白命名為GhGAEl，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由431個氨基酸殘基組成。上述b)的氨基酸序列如序列2的第22-431位所示。為了使a)的GhGAEl蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的GhGAEl蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的GhGAEl蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列l(wèi)自5'末端第169-1464位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和Z或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白的編碼基因，是如下1)至5)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l(wèi);2)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第169-1464位；3)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第233-1536位；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA片段雜交且編碼與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)的蛋白的DNA分子。所述步驟5)中的基因，與1)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1584個核苷酸組成，自5'末端第169-1464位為編碼序列，編碼序列表中序列2所示的蛋白。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。擴增GhGAEl基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述GhGAEl基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌、擴增所述基因的全長及其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有GhGAEl基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pB〗:121、pBinl9、pCAMB]:A23()1、pCAMB]:A13()1-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明的GhGAEl基因的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。使用GhGAEl基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子,這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選,可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。本發(fā)明的另一目的在于提供任一上述的蛋白在作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶的應(yīng)用。本發(fā)明的又-目的在于提供任--上述的蛋白或任一上述的基因在轉(zhuǎn)化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)為尿苷二磷酸半乳糖醛酸(UDP-GalA)中的應(yīng)用或者在轉(zhuǎn)化UDP-GalA為UDP-GlcA中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育高尿苷二磷酸半乳糖醛酸含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育高尿苷二磷酸半乳糖醛酸含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到尿苷二磷酸半乳糖醛酸含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。其中，所述植物具體可為棉花。本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因可用來培育纖維長度增加的棉花。本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶編碼基因在纖維快速伸長期(開花后10天)表達(dá)豐度最高，并且快速伸長的纖維初生細(xì)胞壁含有大量的半乳糖醛酸，說明GhGAEl是合成果膠多糖中的半乳糖醛酸的關(guān)鍵步驟，對纖維伸長非常重要。將本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶編碼基因?qū)朊藁ㄖ?，從而使棉花纖維長度增加，提高棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因具有重大的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。圖1為GhGAEl在棉花不同發(fā)育時期的表達(dá)水平分析。圖2為棉纖維和胚珠的初生壁醛酸糖成分的氣相色譜分析。圖3為UDP-半乳糖醛酸對纖維伸長的影響。圖4為乙烯處理對GhGAEl基因表達(dá)水平的影響。圖5為GhGAEl蛋白的體外表達(dá)。圖6為GhGAEl蛋白的活性測定。具體實施例方式下述實施例中所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明均為質(zhì)量百分含量。實施例1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶編碼基因的克隆—、GhGAE1基因的克隆選取野生型陸地棉品種徐州142(WT)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的國家中期棉花種子庫)開花后10天的纖維，提取總RNA，總RNA的提取按Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsolationSystemkit進(jìn)行。取5g的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的一鏈，反應(yīng)體系如下總RNA10iiL(5ug)、Oligo(dT)(20umol/L)1.5iiL、10Xbuffer2.5yL、d證mix(2.5mmol/L)2iiL、滅菌水8uL。42。C水浴lmin后向反應(yīng)體系中加入1iiL(200U)S叩erScriptTMlIRT，輕輕混合，42。C保溫5()min;7()。C水浴15min，終止該反應(yīng)；獲得cDM的第一鏈。設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增，引物序列如下Pl:5'AATAAAAACTCCCCTCCCTTTTTTTC3';P2:5'TACGGAATCCTCGTCTTTCTCTTG3'。PCR擴增條件為先94。C3min;然后94。Clmin，59°C45s，72°C2min,30個循環(huán);最后72°C10min。PCR擴增出約L584bp的片段，回收后連接到pGEM-TEasy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-GhGAEl,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取酶切鑒定正確的陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，克隆得到的c:[)NA序列如序列表中序列1所示，其編碼序列是序列表中序列!自5'末端第169-1464位，編碼序列表中序列2所示的蛋白。二、GhGAEl表達(dá)水平與纖維伸長的關(guān)系選取不同發(fā)育時期的野生型陸地棉品種徐州142(WT)和無絨無絮突變體(FL)棉花(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的國家中期棉花種子庫)，利用實時定量PCR分析GhGAEl的表達(dá)水平。具體步驟如下RNA的提取根據(jù)操作手冊Micro—TO—MidiTotalRNAPurificationSystem(Invitrogen，USA)從野生型陸地棉品種徐州142開花當(dāng)天以及開花后3天的胚珠、開花后5、10、15、20和25天的纖維，以及無絨無絮突變體和野生型陸地棉品種徐州142開花后10天的胚珠中分別提取總RNA。c:[)NA模板的制備以5lig的總RNA為模板，用DNA酶]:消化基因組I)NA，然后根據(jù)操作手冊用SUPERSCRIPT第一條鏈合成系統(tǒng)合成cDNA第-一條鏈。實時定量PCR:分別設(shè)計GhUBQ7和GhGAEl基因特異引物，選取看家基因棉花泛素(Ubiquitin，UBQ)作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)DyNAmoSYBRGreenQpcrKit(Fi籠ymes,USA)操作手冊進(jìn)行實時定量PCR分析GhGAEl的表達(dá)。GhUBQ7引物5'序列:5，-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC--3，；GhUBQ7引物3，序列:5,-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3，GhGAEl引物5'序列:5，-ACGCCAGGGAAGTTCAAGGTCG--3，；GhGAEl引物3，序列:5，-GCCGTGGCTGTTAAGCAGGGAT--3，。反tei體系如下:成分量(Pi)2XMixture103'引物0.35'引物0.3模板0.3ddH209.1總體積20反應(yīng)參數(shù)95。C預(yù)變性20s，42個循環(huán)擴增(每個循環(huán)包括94。C變性10s，5『C退火2()s，72"C延伸3()s),然后讀取78-8(rC采集的熒光數(shù)據(jù)；最后延伸5min。實時定量PCR結(jié)果如圖1所示，GhGAEl表達(dá)在野生型陸地棉品種徐州142開花后10天的胚珠和無絨無絮突變體開花后10天的胚珠中豐度很低，但是在開花后10天的野生型陸地棉品種徐州142的纖維中豐度最高，這說明GhGAEl在纖維細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)，對纖維的發(fā)育可能具有重要作用。圖1中，WT-F表示野生型陸地棉品種徐州142的纖維，WT-O表示野生型陸地棉品種徐州142胚珠，F(xiàn)L-0表示無絨無絮突變體胚珠，其后的數(shù)字代表開花后的天數(shù)。三、棉纖維和胚珠的初生壁醛酸糖成分的氣相色譜分析具體步驟如下1.多糖分解:稱取lOmg細(xì)胞壁，加入1.25ml2M的三氟乙酸(TFA),加入50u1的5mg/ml肌醇作內(nèi)標(biāo)，120。C，2h;離心。2.取250li1TFA多糖裂解液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，40度水浴條件下氮氣吹干。3.加入含20mgZml甲氧胺鹽酸鹽(methoxyaminehydrochloride)的吡啶溶液100ul，37。C反應(yīng)2小時。4.加入lOOul硅烷化試劑[雙(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基硅烷(TMS)]，37。C反應(yīng)().5小時。5.取10u1反應(yīng)液用于GC-MS分析，DB-5MS柱，程序160°C，lmin，10°C/min升至172°C，5°C/min升至208°C，lOsec降到20(TC，保持2min，30sec降到160°C，保持2min。各糖成分先根據(jù)標(biāo)樣保留時間進(jìn)行鑒定，然后再用質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析，開花l()天的纖維和胚珠((WT-F1()、FL-0-10和WT-0-10)的細(xì)胞壁中沒有檢測到葡萄糖醛酸。開花IO天的纖維的細(xì)胞壁中的半乳糖醛酸含量(半乳糖醛酸1和半乳糖醛酸2)比胚珠中高二倍之多。圖2中，WT-F表示野生型陸地棉品種徐州142的纖維，WT-0表示野生型陸地棉品種徐州142胚珠，F(xiàn)L-0表示無絨無絮突變體胚珠，其后的數(shù)字代表開花后的天數(shù)。四、尿苷二磷酸半乳糖醛酸(UDP-GalA)對纖維伸長的影響胚珠培養(yǎng)液的物質(zhì)組成見表1。表1.棉花胚珠組織培養(yǎng)液成分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>開花后1天的棉花胚珠用來進(jìn)行培養(yǎng)實驗，步驟如下1)開花后1天的野生型陸地棉品種徐州142棉桃采摘下來后，用10%次氯酸鈉浸泡10-15分鐘，再用胚珠培養(yǎng)液清洗4次；2)用酒精燈燒過的小鑷子和手術(shù)刀小心將胚珠放入裝有胚珠培養(yǎng)液的50ml三角瓶中，并加入5uM的UDP-半乳糖醛酸;3)將裝有胚珠的三角瓶放到溫箱中暗培養(yǎng)，注意不要晃動三角瓶。以不加UDP-半乳糖醛酸作為對照。結(jié)果如圖3所示，1代表對照，2代表加入5uM的UDP-半乳糖醛酸；說明UDP-半乳糖醛酸可以顯著促進(jìn)纖維的伸長。五、乙烯處理對GhGAEl基因表達(dá)水平的影響野生型陸地棉品種徐州142棉花胚珠在胚珠培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加入0.1M的乙烯并密封，37度恒溫培養(yǎng)。以未加入乙烯在胚珠培養(yǎng)液中培養(yǎng)的胚珠為對照。分別于3、6、12小時收集乙烯處理和對照的胚珠，分別提取總RNA、按照(二)中的方法進(jìn)行實時定量PCR。結(jié)果如圖4所示，說明乙烯可顯著促進(jìn)GhGAEl基因的表達(dá)。六、GhGAEl的酶活性測定1)原核表達(dá)載體構(gòu)建。因為GhGAEl為高爾基體定位蛋白，考慮到信號肽可能影響蛋白的原核表達(dá)，因此設(shè)計表達(dá)的蛋白去除了N端21個氨基酸的信號肽部分。以野生型陸地棉品種徐州142cDNA為模板,用下述引物進(jìn)行PCR擴增GhGAEl-5，primer:5'-GGATCCCACAATATGAACCGTCAATTCCA-3，；GhGAE卜3，primer:5'-CTCGAGTTTCCCGTTACCTTCTATTTCATTC-3'。PCR擴增出約1316bp的片段，回收后連接到pGEM-TEasy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取酶切鑒定正確的陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，克隆得到的片段的核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端第233-1536位,其編碼氨基酸序列如序列表中序列2的第22-431位所示的蛋白。PCR擴增產(chǎn)物插入pET28a(Invitrogen)的Xhol和BamHI位點之間，獲得pET28a-GhGAEl。2)GhGAEl的誘導(dǎo)表達(dá)將pET28a-GhGAEl轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS，陽性菌株在0D6。。為0.6-0.8時加入0.8mM的IPTG，誘導(dǎo)4小時后，收集菌液。用磷酸鈉緩沖液(pH=7.6)重懸菌液，超聲破碎菌液后，4t:條件下lOOOOg離心30分鐘，取上清4"C條件下透析過夜(透析袋截留分子量為1.2-1.4kD)以除去小分子物質(zhì)，透析后菌液用于酶活分析。同時按照以上步驟得到轉(zhuǎn)pET28a空載體的菌液上清作為酶活分析負(fù)對照。如圖5所示，1代表IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pET28a空載體的菌液上清，2代表IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pET28a-GhGAEl的菌液上清，箭頭所指為表達(dá)的GhGAEl特異蛋白條帶。3)活性測定3mMUDP-GlcA或3mMUDP-GalA(UDP-GlcA購自Sigma公司，UDP-GalA購自喬治亞州立大學(xué)碳水化合物研究中心(CarboSourceServices,UniversityofGeorgia))、25]iL表達(dá)GhGAEl的蛋白菌液溶于500yLIOO慮的磷酸鉀緩沖液中(pli7.6)，3CTC反應(yīng)60min;加入5()()iiL氯仿終止反應(yīng)。用空載體菌液上清作負(fù)對照。16，()0()g離心5min;收集水相。用ZORBAXEclipseXDB-C18柱(0.46X15cm;AgilentTechnologies)分析水相，柱溫40。C;進(jìn)樣量30iiL。HPLC程序100%(體積百分比)bufferA(100mM磷酸鉀緩沖液含8mM四丁基硫酸氫銨，pH6.5)持續(xù)5min，27min內(nèi)梯度增加bufferB[70%(體積百分比)bufferA，3()%(體積百分比)甲醇，pH6.5]—直到77%(體積百分比)的bufferB，77%(體積百分比)bufferB持續(xù)5min，流速為lmL/min，254nm檢測產(chǎn)物。如圖6所示，A為HPLC檢測UDP-GlcA和表達(dá)空載體的粗提菌液的反應(yīng)產(chǎn)物；B為HPLC檢測UDP-GlcA和GhGAE1蛋白粗提菌液的反應(yīng)產(chǎn)物。可見表達(dá)GhGAE1蛋白的粗提菌液可以將UDP-GlcA轉(zhuǎn)化為UDP-GalA，空載體菌液則不能完成此轉(zhuǎn)化。C為HPLC檢測UDP-GalA和表達(dá)空載體的粗提菌液的反應(yīng)產(chǎn)物；D為HPLC檢測UDP-GalA和GhGAEl蛋白粗提菌液的反應(yīng)產(chǎn)物。可見，表達(dá)GhGAEl蛋白的粗提菌液也可以將UDP-GalA轉(zhuǎn)化為UDP-GlcA，空載體菌液不能完成此轉(zhuǎn)化。從而證明GhGAEl具有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶的活性。序列表〈no〉北京大學(xué)〈120〉尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因與應(yīng)用〈130〉CGGNARL82108〈16()>2〈210>1〈211>1584〈212>DNA〈213〉陸地棉(Gossypiumhirsut.um)〈400>1aataaaaactcccctccctttttttctgcatctgcttttatttctttacagctcaa肌tt60aat.aat.t.at.aaat.caaat.caagtctctttcttccttetcctttcgatctgctaatcaagt120catttcaagaaagaaaaatagtaggacaatgccgtccttg180tgtttccgtcg3CgCC郷gaagttcaaggtCg￡LC￡lg￡lgCgicgicaatgitg240朋ccgtc朋ttccatcgttgcttcgcttcaaccagcaccatgtttttatgggctcttttc300ttgatcgcattgacggcgtcgtatttgcgcttccagagtttcgttgattctggtagccga360tatttcagtgcttcatggggtggtatccaatggg8aaaacaagtccgtaactccgctcag420atccatcgttccggaggcatgtccgttctggtgactggagcggctggtttcgtcggteca■cacgtttcccttgccctcaaaaaacgcgg3gatgg《tcgttgggcttgac肌tttcaac540aactattacgacccttcgttgaaaaiggcgaggaaatccctgcttaacagccacggcatt600ttggtggttgaaggcgatttgaacgacgcc皿gctgttggctaagcttttcgacgtggtg660gcttttactc￡LCgtg￡ltgC￡ltttggcggctcaagctggeigtcaggtecgcceitggaaaac720cccaactcttatgttcacagcaacatcgccggtctcgtcacgcttctcga朋tttgc&i朋780tccgctaatccccag'ccag'ccgttgtctgggcctcctccagttccgtttacggtctcaac840gaaaaggttcctttctctgaggccg織ggaccgaccagccggctagtttgtatgccgcc■3CC朋g朋ggC3ggCg朋g3aataacccacatetctecggtctttcaatt960gatttttcaccgtgtacggtccatggggaaggcctgatatggcgtatttt1020tcgtttacgagaaatattctgc郷g腿gtttatcggggaaigaatcgg1080gttgatttggcccgagattttacctacattgacgatatcgtgaaaggctgtttgggatcg1140ttggatecatccgggaaaagcaccggttctggtggga卿aaaaggggaacgctccatat1200aggatttttetitttgggg&mtacgtcgccggtc朋ggtgccggagctggtg朋catcctg1260ga_aiiga_ca_tttgaaggtgaa8gccaaaaggaiita_tcgta_gatatg'cctgga_aiicggtga_c1320gttccattcactcatgcgaatatcagtttggcccaa8g8gaattcgggtacaagccctca1380accgatttgc朋accgggttg朋g朋gtttgtt卿tggtatttatcttattatggttat1440aaggtcta^ataaaa11tatttttggtttgattttcttg1500gtttcccatt8gaatgaaat8gaaggtaacgggaaaaccgaaggaaccgcaagttaaaaa1560caaga^aagacgaggattccgte1584〈210>2〈211>431〈212>:PRT〈213〉陸地棉(Gossypiumhirsut.um)〈400>2MetProSerLeuGluAspGluLeuPheProSerThrProGlyLysPhe151015LysValAspArgAlaHisAsnMet.AsnArgGinPheHisArgCysPhe202530AlaSerThrSerThrMetPheLeuTrpAlaLeuPheLeulieAlaLeu<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SerProValLysValProGluLeuValAsnlieLeuGluArgHisLeu355360365LysValLysAlaLysArgAsnlieValAspMetProGlyAsnGlyAsp370375380ValProPheThrHisAlaAsnlieSerLeuAlaGinArgGluPheGly385390395400TyrLysProSerThrAspLeuGinThrGlyLeuLysLysPheValArg405410415TrpTyrLeuSerTyrTyrGlyTyrAsnAsnArgLysGlyLeuGin420425430權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于:所述b)的氨基酸序列如序列2的第22-431位所示。3.權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第169-1464位；3)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第233-1536位；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DM片段雜交且編碼與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)的蛋白的DNA分子。5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6.權(quán)利要求1或2所述的蛋白在作為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1或2所述的蛋白或權(quán)利要求3或4所述的基因在轉(zhuǎn)化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸為尿苷二磷酸半乳糖醛酸中的應(yīng)用或者在轉(zhuǎn)化尿苷二磷酸半乳糖醛酸為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸中的應(yīng)用。8.—種培育高尿苷二磷酸半乳糖醛酸含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求3或4所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到尿苷二磷酸半乳糖醛酸含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物為棉花。10.權(quán)利要求1或2所述蛋白、權(quán)利要求3或4所述基因、權(quán)利要求5所述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育纖維長度增加的棉花中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因與應(yīng)用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸半乳糖醛酸合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了該蛋白的編碼基因。將本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶編碼基因?qū)朊藁ㄖ?，從而使棉花纖維長度增加，提高棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸異構(gòu)酶及其編碼基因具有重大的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/82GK101698838SQ20091020429公開日2010年4月28日申請日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者龐朝友,朱玉賢,王慧,秦詠梅,逄宇,靳翔申請人:北京大學(xué)