3-差向異構(gòu)酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，以及一種編碼所述蛋白的 核酸分子。本發(fā)明還涉及一種載體和一種含所述核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種 用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按這種方式制造的阿洛酮糖。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿洛酮糖是一種"零熱量"甜味劑，并有認(rèn)為與葡萄糖類似的甜度。其還具有類似 于其他醣類的填充和褐變屬性。阿洛酮糖的主要目標(biāo)市場(chǎng)是食品和飲料制造商，在其產(chǎn)品 中，目前所用為葡萄糖、果糖或高果糖漿，而且正尋求顯著減少熱量卻不顯著改變糖成分所 賦予的其他屬性，如：填充作用、褐變、質(zhì)地和甜度。
[0003] 在美國，阿洛酮糖并非通常認(rèn)為是安全（GRAS)的物質(zhì)，但目前有一項(xiàng)待定的GRAS 通知（GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、經(jīng)蒸汽處理的咖啡、小麥植物產(chǎn)品 和高果糖玉米糖漿。阿洛酮糖的典型日總攝入量估計(jì)為每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是 D-果糖的C-3差向異構(gòu)體，而阿洛酮糖和果糖結(jié)構(gòu)的差異使得阿洛酮糖不能被人體代謝， 因而其熱量為零。由于阿洛酮糖不含熱量，因此，認(rèn)為其是一種有前途的候選甜味填充劑， 而且，據(jù)稱在具有甜味的同時(shí)還能保持與典型單糖相似的性質(zhì)。
[0004] 酮糖-3-差向異構(gòu)酶可使果糖和阿洛酮糖互相轉(zhuǎn)化。號(hào)為8030035的美國專利和 公布號(hào)為W02011/040708的PCT公開了可將來自農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)并 具阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白與D-果糖反應(yīng)，從而制造D-阿洛酮糖（阿洛酮糖 的另一名稱）。
[0005][0006] 號(hào)為100832339的韓國專利公開了一種中華根瘤菌（Sinorhizobium)YB-58菌株， 該菌株能夠?qū)⒐寝D(zhuǎn)化成阿洛酮糖，并公開了一種用中華根瘤菌YB-58菌株的真菌體制造 阿洛酮糖的方法。
[0007] 號(hào)為1020090098938的韓國專利申請(qǐng)公開了一種用大腸桿菌制造阿洛酮糖的方 法，其中，大腸桿菌是表達(dá)一種編碼阿洛酮糖-3異構(gòu)酶的多核苷酸。
[0008] 本發(fā)明的目的是改進(jìn)阿洛酮糖的現(xiàn)有制備技術(shù)。本發(fā)明的目的是提供一種酮 糖-3-差向異構(gòu)酶，其在全細(xì)胞系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化率和體積產(chǎn)率高于之前報(bào)導(dǎo)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明源于對(duì)三種酮糖-3-差向異構(gòu)酶的鑒別及表征，其示例性氨基酸序列分別 示于編號(hào)2、4和6的序列?？捎迷撏?3-差向異構(gòu)酶將果糖轉(zhuǎn)化成阿洛酮糖。之前已將 這些蛋白確定為假想蛋白，或確定為具有塔格糖異構(gòu)酶活性。然而，本發(fā)明人現(xiàn)驚奇地發(fā)現(xiàn) 這些酶有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性。
[0010] 本發(fā)明的第一方面提供一種含多肽序列的蛋白，該序列與編號(hào)2的序列、編號(hào)4的 序列或編號(hào)6的序列有至少70%的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向異 構(gòu)酶活性。
[0011] 方便而言，該多肽序列與編號(hào)2的序列，編號(hào)4的序列或編號(hào)6的序列有至少 80%、90%、95%或99%的序列同一性，或有100%的序列同一性。
[0012] 優(yōu)選地，該多肽序列含編號(hào)13的序列。
[0013] 優(yōu)選地，該蛋白固定于固體基質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的第二方面提供一種本發(fā)明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。
[0015] 本發(fā)明的第三方面提供一種核酸分子，該核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述 蛋白的多核苷酸序列。
[0016] 優(yōu)選地，該核酸分子包含多核苷酸序列，其中：
[0017] i)該多核苷酸序列與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3的序列有至少70%、80%、90%、95% 或99%的序列同一性，或是100%的序列同一性；或
[0018] ii)該多核苷酸序列在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到一種多核苷酸，該多核苷酸具有 與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3所不序列互補(bǔ)的序列。
[0019] 本發(fā)明的第四方面提供一種載體，其特征在于載體包含本發(fā)明第三方面所述的核 酸分子。
[0020] 本發(fā)明的第五方面提供一種宿主細(xì)胞，其特征在于宿主細(xì)胞包含本發(fā)明第三方面 所述的重組核酸分子。
[0021] 方便而言，該宿主細(xì)胞是一種酵母、細(xì)菌或其他微生物，或一種哺乳動(dòng)物、植物或 其他細(xì)胞的培養(yǎng)物。
[0022] 優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0023] 本發(fā)明的第六方面提供一種由本發(fā)明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。
[0024] 本發(fā)明的第七方面提供一種制造阿洛酮糖的方法，包括：
[0025] i)提供本發(fā)明第一方面所述的蛋白；并
[0026] ii)在可將果糖基質(zhì)轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的條件下將蛋白與果糖基質(zhì)接觸。本發(fā)明亦 提供一種制造阿洛酮糖的方法，所述方法包括：在可將果糖基質(zhì)轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的條件下， 將本發(fā)明第一方面所述蛋白與果糖基質(zhì)接觸。
[0027] 優(yōu)選地，所述蛋白存在于宿主細(xì)胞中。
[0028] 可選地，該蛋白呈分離形式。
[0029] 為方便起見，這些條件包括將蛋白與果糖基質(zhì)保持在25°C至75°C之間，優(yōu)選保持 在50°C至60°C之間，更優(yōu)選保持在52°C至55°C之間，更優(yōu)選為55°C。
[0030] 優(yōu)選地，所述條件包括將蛋白和果糖基質(zhì)保持在pH4至pH10之間。
[0031] 優(yōu)選地，所述條件包括將果糖基質(zhì)濃度保持在75%至95% (W/V)之間。
[0032] 本發(fā)明的第八方面提供一種含多核苷酸序列的核酸分子，其中：
[0033] i)所述多核苷酸序列與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3的序列有至少70%的序列同一,性； 或
[0034]ii)所述多核苷酸序列在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到一種多核苷酸，其具有與編號(hào) 5、編號(hào)1或編號(hào)3所示序列互補(bǔ)的序列。
[0035] 該核酸分子編碼一種具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的多肽。如本發(fā)明的一方面所 述，該核酸分子可呈分離形式。
[0036] 本發(fā)明的第九方面提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含重組核酸分子，所述核酸 分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的多肽，其 中該多核苷酸序列的特征在于：
[0037] i)與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3的序列有至少70%的序列同一性；或
[0038] ii)在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到一種多核苷酸，該多核苷酸具有與編號(hào)5、編號(hào)1 或編號(hào)3所示序列互補(bǔ)的序列。
[0039] 本發(fā)明的第十方面提供一種載體，所述載體包含核酸分子，所述核酸分子包含多 核苷酸，所述多核苷酸編碼具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的多肽，其中該多核苷酸序列的 特征在于：
[0040] i)與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3的序列有至少70%的序列同一,性；或
[0041] ii)在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到一種多核苷酸，所述多核苷酸具有與編號(hào)5、編號(hào) 1或編號(hào)3所示序列互補(bǔ)的序列。
[0042] 本發(fā)明的第十一方面提供一種制備阿洛酮糖的方法，該方法包括下列步驟：
[0043] i)提供一種包含核酸分子的載體，所述核酸分子具有多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列編碼具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，其中該多核苷酸序列的特征在于：a)與 編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3的序列有至少70%的序列同一性，或b)在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得 到一種多核苷酸，所述多核苷酸具有與編號(hào)5、編號(hào)1或編號(hào)3所示序列互補(bǔ)的序列；
[0044] ii)合成具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性并被多核苷酸序列編碼的蛋白；
[0045] iii)將果糖與具有酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白接觸，并將果糖和蛋白保持在 可將果糖轉(zhuǎn)化成阿洛酮糖的條件下；并
[0046] iv)至少對(duì)步驟iii)制造的阿洛酮糖進(jìn)行部分純化。
[0047] 在本文中，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"可互換使用，用以指代氨基酸殘基聚合物。 這些術(shù)語亦適用于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)修飾或殘基非天然存在的氨基酸聚合物，例如 天然存在氨基酸及天然存在氨基酸酸聚合物的相應(yīng)人工化學(xué)模擬物。多肽未必呈"分離"形 式，即未必處于天然存在時(shí)其周圍組分之外。
[0048] 本文所用術(shù)語"氨基酸"指天然存在和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基 酸功能類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基 酸，以及在細(xì)胞中翻譯后經(jīng)修飾的氨基酸（例如：羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸絲氨 酸）。短語"氨基酸類似物"指與天然存在的氨基酸基本化學(xué)結(jié)構(gòu)U碳與氫、羧基、氨基、 R基團(tuán)結(jié)合）相同，但有一個(gè)經(jīng)修飾的R基團(tuán)或經(jīng)修飾的骨干（如絲氨酸、亮氨酸、蛋氨酸亞 砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短語"氨基酸模擬物"指一類與天然存在的氨基酸結(jié)構(gòu)不同 但有類似功能的化合物。應(yīng)當(dāng)理解為：由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，編碼特定多肽的核酸分子可 能會(huì)具有一系列多核苷酸序列。例如：密碼子GCA、GCC、GCG和GCT都編碼丙氨酸這種氨基 酸。
[0049]使用BLASTP算法第 2.2.2 版（Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden，AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller，andDavid J.Lipman(1997)， "GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofprotein databasesearchprograms"，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)及默認(rèn)參數(shù)，可確定兩 個(gè)序列的百分比"同一性"。尤其是，可用URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/訪問 互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行BLAST算法評(píng)價(jià)。
[0050] 本文所用術(shù)語"酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性"指一種能催化酮糖的立體化學(xué)轉(zhuǎn)化，特 別是果糖向阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化的酶。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，"酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性"指與 相同條件下不含酶的反應(yīng)混合物相比，所加每毫克酶（〇. 1單位/毫克）使果糖與阿洛酮糖 的互變率增加至少10微摩爾/分鐘的能力。在其他實(shí)施例中，認(rèn)為使果糖與阿洛酮糖的互 變率增加至少〇. 05單位/毫克或0. 2單位/毫克即具有"酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性"。以下 提供了一種測(cè)定酶使D-果糖向阿洛酮糖轉(zhuǎn)化的活性的適宜方法。將