專利名稱：核糖核苷酸標(biāo)記核酸檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了具有多^卩接序列段的多核苷酸，其中^t^序列段的5'-末端核苷酸 是,列段中獨(dú)特的并在每個(gè)序列段中是相同的，且提供了所述多核苷翻于檢測(cè)耙核酸的方法。
背景技術(shù)：
已知?jiǎng)堲薅鄼z測(cè)耙核酸的方法(如SNP基因型分型)。目前可用于SNP基因型分型的均相測(cè)定包括TAQMAN， AMPLIFLUOR，染料結(jié)合、等位基因選擇動(dòng)態(tài)PCR (allele-selective kinetic PCR)以及SCORPION⑧引物測(cè)定。這些觀啶在每個(gè)反應(yīng)孔中提供一個(gè)或至多兩iX如果應(yīng)用四種不同的熒光染料)SNPs(如染料結(jié)合動(dòng)態(tài)PCR對(duì)于一個(gè)SNP需要兩個(gè)孔)。SNP基因型分型的可用方法在/A^些在反應(yīng)孔中允許單個(gè)SNP基因型分型的方法，至娜些允許單個(gè)孔中數(shù)千個(gè)SNPs基因型分型的方法(如GOLDEN GATE⑧測(cè)定，Hlumina)的范圍內(nèi)。目前的基因型分型測(cè)定程序不易多重化，這歸因于每種類型的等位基因需要不同的染料，并因耐艮制了其改善的可能。GOLDEN GATE^測(cè)定需要復(fù)雜的分析設(shè)備，諸如纖維光學(xué)陣列讀數(shù)器。SNP基因型分型的讀取分析儀在從板讀數(shù)器(任選地，帶有包含的PCR機(jī)器)至測(cè)序儀(如毛細(xì)管測(cè)序儀)、陣列讀數(shù)器以及質(zhì)譜儀的范圍內(nèi)。此外，在質(zhì)譜儀已用于基因型分型的程度上，目前可用的fOT不允許真實(shí)的多重化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于一個(gè)或多個(gè)革巴核酸的有效且高靈敏度的并行檢測(cè)的多核苷酸。所述的多核苷酸設(shè)計(jì)為具有包含一個(gè)、兩個(gè)或更多^瞎序列段的5'部分，從而序列段或其互補(bǔ)體的質(zhì)量，鑒別靶核酸鄉(xiāng)E核酸內(nèi)的耙核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述的序列段是等質(zhì)量的。等質(zhì)量的序列段可以但不需要具有相同的序列。序列段切割自多核苷酸的互補(bǔ)體，并且其質(zhì)量被測(cè)量，測(cè)以鑒另脾巴核酸的存在、不存在或存在的水平。
因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)序列段的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷離含5'部分和3'部分，其中
a) 5'部他含至少一個(gè)或至少兩W階序列段，其中每個(gè)序列段包含至少三個(gè)核苷酸堿基，具有相等質(zhì)量，并且每個(gè)序列段的5'-末端核苷酸堿 —個(gè)序列段中是獨(dú)特的并在^h序歹暇中是相同的；并且
b) 3'部^S含至少5個(gè)核苷酸，其中所述的多核苷酸的長(zhǎng)度少于約100個(gè)核苷酸堿基。在一些實(shí)施方案中，所述的多核苷酸的長(zhǎng)度少于約75、 50或25個(gè)核苷酸。
在雌的實(shí)施方案中，^h序列段具有相同的核苷辦列。在其它優(yōu)選的實(shí) 案中，5，部分包含至少3、 4、 5、 6、 7或8^K階序列段。在一，選實(shí)施方案中，^序列段包含至少3、 4、 5、 6、 7或8個(gè)核苷酸。
在同樣雌的實(shí)施方案中，3'-末端包含可去除的封閉部分，其基本上阻止多核苷酸的延伸。在特別雌的實(shí)施方案中，3'-末端包含2'終止子部分。
在另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)靶核酸的方法。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括
a) 將耙核酸與多核苷酸、核苷酸集以及核苷酸^生物催化組分接觸，
其中
(0所述的多核苷,含5'部分和3'部分，所述的5'部*含至少一個(gè)或至少兩個(gè)鄰接序列段，其中每個(gè)序列段包含至少三個(gè)核苷酸堿基，并且每個(gè)序列段的5'-末端核苷酸堿基在一個(gè)序列段中是獨(dú)特的并在每個(gè)序列段中是相同的；并且3'部他含足以與耙核麟交并在擴(kuò)增條件下延伸的基本上互補(bǔ)的序列段；
(u)所述的核苷,包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 ，并且至少一種核苷酸M的大多數(shù)是核糖核苷酸(rNTP)形式，其中所
述的核糖核苷酸m與所述多核苷酸^h序列段的獨(dú)特5'核苷酸堿基互補(bǔ)；以
及
(iii)所述核苷酸M生物催化組^含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷M合活性；
b) 在擴(kuò)增條件下擴(kuò)增耙核酸以產(chǎn)生包含與該多核苷酸5'-部分互補(bǔ)的3'序歹暇(即3'-部分)的擴(kuò)增子，其中所述3'序列段包含至少一個(gè)或至少兩個(gè)序列段，其中齡序列段的3'末端核苷酸堿基是具有和核苷酸集中NTP相同堿基 的核苷一磷酸(NMP);
c) 將針NMP3'的擴(kuò)增子切害U為片段，其中所述切割釋放作為個(gè)別片 段的序列段；以及
d) 檢測(cè)擴(kuò)增子片段，其中檢測(cè)的序列段的片段指示耙核,列的擴(kuò)增， 從而檢測(cè)耙核,列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，5'部分序列段是等質(zhì)量的。
在其它優(yōu)選的實(shí)船案中，至少一種核苷酸堿基的至少80%是核糖核苷酸 (rNTP)的形式。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使擴(kuò)增子經(jīng)受堿性溶液進(jìn)行所述切割。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，堿性溶液包含下面的至少一種:NaOH、 KOH、 RbOH、
Mg(OH)2、 Ca(OH)2或NH4OH。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，堿性溶液包含下面的
至少一種NaOH、 KOH或NH(OH。
在同樣優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括將耙核酸序列與多核苷
W"相接觸的步驟，其中所述多核苷f(shuō)et中的^多核苷酸包含等質(zhì)量的5'部
分序列段。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括將靶核酸與至少一個(gè)多 核苷酸相接觸的步驟，其中從多核苷酸或其互補(bǔ)微測(cè)到序列段片尉旨示革巴核 酸序列中存在多態(tài)性核苷酸等位基因。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括將耙核酸與至少兩個(gè)不
同多核苷酸相接觸的步驟，其中所述多核苷酸僅在3'-末端核苷酸鵬上不相同，
其中每個(gè)多核苷酸的3'-末端核苷酸i^對(duì)應(yīng)于獨(dú)特質(zhì)量的序列段，并且，其中 從至少一個(gè)多核昔酸或其互補(bǔ)皿測(cè)到序列段片段指示靴核酸序列中多態(tài)性核
苷酸的等位基因的存在。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，許多不同耙核酸序歹i」與許多不同多核苷酸相接 觸，每種不同的多核苷酸包含獨(dú)特質(zhì)量的序列段，其中多核苷酸的序列段是許 多不同靶核酸序列之一的鑒定劑(identifier),由此，從至少一個(gè)多核苷酸或其 互補(bǔ)體中檢測(cè)到序列段片段指示許多不同靶核酸序列中至少一個(gè)的存在。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸整合生物催化組分包含單個(gè)催化結(jié) 構(gòu)域，所述的催化結(jié)構(gòu)域包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整合活性。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的是，核苷酸整合生物催化組分包含第一和第二催化結(jié)構(gòu)域， 其中第一催化結(jié)構(gòu)域包含脫氧核糖核苷酸整合活性，且第二催化結(jié)構(gòu)域包含核 糖核苷酸M^活性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)質(zhì)譜分析法進(jìn)行所述檢測(cè)。在一靴選的實(shí)施 方案中，通過(guò)氣相離子質(zhì)譜分析法進(jìn)行檢測(cè)或備選地，通過(guò)激光解吸電離質(zhì)譜 分析法進(jìn)行檢測(cè)。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸包含基本上阻止多核苷酸延伸的封閉 部分，并且其中所述的方法進(jìn)一步包括在擴(kuò)增前從多核苷酸中去除封閉部分的 步驟。
在另一方面，本發(fā)明提供了反應(yīng)混合物，如用于進(jìn)4于上文所述檢測(cè)的創(chuàng)造 性方法的反應(yīng)混合物。在 的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部，含至少一個(gè) 或至少兩^卩接序列段，其中每個(gè)序列段包含至少三個(gè)核苷酸堿基，其中每個(gè) 序列段的5'-糊核苷酸^SE—個(gè)序歹暇中是獨(dú)特的并在^^序列段中是相同 的；并且3'部他含足以與靶核麟交并在擴(kuò)增條件下延伸的基本上互補(bǔ)的序 列段；
b) 核苷酸集，其包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTP)形式的核苷酸M， 且至少一種核苷酸堿基的大多數(shù)是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作 為核糖核苷酸提供的核苷酸堿基互補(bǔ)于^^序歹煅的獨(dú)特5'核苷酸鵬；以及
c) 核苷酸齡生物催化組分，其包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷,合活性。
在，的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含至少一個(gè)耙核酸序列。 在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了試劑盒。在雌的實(shí)施方案中，試劑盒包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部他含至少 一個(gè)或至少兩^K卩接序列段，其中*序列段包含至少三個(gè)核苷酸堿基，且每 個(gè)序歹暇的5'-末端核苷酸堿驗(yàn)一個(gè)序列段中是獨(dú)特的并在針序歹暇中是相 同的；并且3'部他含足以與耙核酸雜交并在擴(kuò)增斜牛下延伸的基本上互補(bǔ)的 序列段；
b) 核苷,，其包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 tt，且至少一種核苷酸M的相當(dāng)大多數(shù)是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作為核糖核苷酸提供的核苷酸f藤互補(bǔ)于每個(gè)序列段的獨(dú)特5'核苷酸 堿基；以及
c) 核苷酸整合生物催化組分，其包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整 合活性。
反應(yīng)混合物和試劑盒的實(shí)施方案如上文對(duì)于多核苷酸和方法的描述以及如 此處所描述。根據(jù)本發(fā)明的1腿試劑盒例如是這樣的試劑盒其中齡5'部分 序列段是等質(zhì)量的，并且所述多核苷酸的5'部分序列段包含至少三個(gè)序歹煅， 更優(yōu)選的至少四個(gè)核苷酸堿基，以及最優(yōu)選的至少七個(gè)核苷酸堿基。在試劑盒 的其它雌實(shí)施方案中，所述的3'-末端包含可去除的封閉部分，其基本上阻止 多核苷酸的延伸，更{ 地多核苷酸的3'- 包含2'終止子部分。
在其它方面，本發(fā)明提供了擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增子包含雙鏈 多核苷酸，所述雙鏈多核苷酸包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一鏈，其中5'部^含至少一個(gè)或至少兩^P接序 列段，其中每個(gè)序列段包含至少三個(gè)核苷酸堿基，具有相等質(zhì)量，并且針序 列段的5'-末端核苷酸堿 —個(gè)序列段中是獨(dú)特的并在每個(gè)序列段中是相同 的；并且3，部，含至少五個(gè)核苷酸，以及
b) 與第^S補(bǔ)并且包含3'部分的第二鏈，所述3'部分包含這樣的序列段，所 鵬列段包含至少一個(gè)或至少兩W階序列段，其中每個(gè)序列段的3'-末端核苷 酸鸝是NMP。
在另一方面，本發(fā)明提供了系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，所述的系統(tǒng)包含至 少一個(gè)容器救持物，其包含
a) 包含本發(fā)明擴(kuò)增子的組合物；
b) 至少一個(gè)配置來(lái)與所述容器或支持物熱交流以調(diào)節(jié)容器內(nèi)或支持物 上、溫度的熱調(diào)節(jié)器；
c) 至少一個(gè)轉(zhuǎn)移試劑至容器或支持物和/或從容器^s:持物轉(zhuǎn)移試劑的
試劑轉(zhuǎn)移部件；以及
d) 至少一個(gè)配置來(lái)檢測(cè)容器中或支持物上產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)序列段質(zhì) 量的檢測(cè)器。
在雌的實(shí)施方案中，所述的檢測(cè)器包含氣相離子光譜觀啶儀。 在 的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含至少一個(gè)控制器，所述控制器可操作
10鵬接于
-實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)容器中^S:持物上溫度的熱調(diào)節(jié)器， -實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移試劑至容器救持物和/或從容器救持物轉(zhuǎn)移試劑的試劑轉(zhuǎn)移 部件，和/或，
-實(shí)現(xiàn)檢測(cè)容器中鼓持物上產(chǎn)生的序列段質(zhì)量的檢測(cè)器。
定義
術(shù)語(yǔ)"核酸或"多核苷酸'可互換地應(yīng)用于對(duì)應(yīng)于核糖核酸(RNA)或脫氧 核糖核酸(DNA)聚合物或其類似物的聚合物。這包括核苷酸聚合物諸如RNA 和DNA及其修飾形式、肽核酸(PNAs)、鎖定核酸(LNATM)等等。在某些實(shí) 施方案中，核酸可以是包括多個(gè)單體類型，例如包括RNA亞單位和DNA亞單 位兩者的聚合物。核酸可以是或可包括如染色體或染色體區(qū)段、載體(如表達(dá) 載體)、表達(dá)盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合^l連反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物、寡核 苷酸、探針、引物等等。核酸可以是如單鏈、雙鏈、三鏈等等并且其不限于任 何特定長(zhǎng)度。除非另有指定，除明確指明的任意序列之外，特定核酸序列還任 ^i也包含或編碼互補(bǔ)序列。
核酸不限于具有天然存在的多核苷酸序列或結(jié)構(gòu)、天然存在的主鏈、和/或 天然存在的核苷酸間鍵的分子。例如，含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括這 一定義之內(nèi)(Jenkins等(1995) C/^w. 他v. 169-176頁(yè))。為進(jìn)一步說(shuō)明， 盡管核酸將通常包含磷酸二酯鍵，但在一些情況下，包括那些具有另外的主鏈 的核酸類似物。這^括但不限于磷酰胺(Beaucage等(1993) r欲"/^ra" 49(10):1925及其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger (1970) J. 0《.Ctew. 35:3800; Sprinzl 等(1977) Ew/:J歷oc/^m.81:579; Letsinger等(1986) iVwc/. A:幼/feU4:3487; Sawai等(1984) O^w.丄成805; Leteinger等(1988)J J附.5bc.ll0:4470; 以及Pauwels等(1986) C/ 柳/ca&n》to26:1419)、硫代磷酸酯(Mag等(1991) M^to'cA^i^. 19:1437以及美國(guó)專利No. 5,644,048)、 二硫t代磷酸酯(Briu等
111:2321 )、 O-甲基亞磷,鍵(Eckstein. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. Oxford University Press(1992))、以及肽核酸 主鏈和鍵(Egholm (1992) J. 4m. O 柳.114:1895;Meier等(1992) Ozew. /脫 M 31:麵;Nielsen (1993)油詢365:566;以及Carlson等(1996)淑,380:207)。
另外的類似t/t亥,括具有正電荷主鏈(Denpcy等(1995) AM &/. USA 92:6097);非離子主鏈(美國(guó)專利Nos. 5,386，023、 5,637，684、 5,602,240、 5,216,141以及4,469,863; Angew(1991)Chem. Intl. Ed. English 30:423; Letsinger 等(1988) J. 乂附.O/ew. 110:4470; Letsinger等(1994)M^feas/6fe &7Vwc/e^<ie 13:1597;第二章和第三章，ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y S. Sanghvi禾口 P Dan Cook; Mesmaeker 等(1994 )及owg朋/c & A/o/,c/ra/ O^m. 4:395; Jeffs等(1994 )J.說(shuō)owo/ecw/ar 泌漢34:17; 7^ra/^ah "Z成37:743(1996))以及非核糖主鏈的那些，包括那些 描述于美國(guó)專利Nos. 5,235,033和5,034,506，以及第6和第7章，ASC Symposium Series 580 ， Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed Y S. Sanghvi禾口 P. Dan Cook中的。幾禾中核酸類似物還描述于，如Rawls, C & E News 1997年6 月2日，第35頁(yè)。可進(jìn)行核糖磷酸主鏈的修飾以，附加部分(諸如標(biāo)記部 分)的添加，或改變?cè)撫樤谏憝h(huán)境下的穩(wěn)定性和半衰期。
除了天然存在的通常發(fā)現(xiàn)于核酸的雜環(huán)堿基(如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核酸類似物還包括那些非天然存在的雜環(huán)或其它 修飾的堿基。為了說(shuō)明，任選地包括用于核苷酸中作為解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)物 的某些堿基。例如，這些鵬中的一鮑括7-脫氮嘌呤(如7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑[3，4-d]嘧啶、丙'J^S-dN (如丙炔基-dU、丙'^S-dC等) 等等。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 5,990,303。其它fW性雜環(huán)M^括如次黃嘌 呤、肌苷、黃嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、 肌昔和黃嘌呤的8-M^衍生物；腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、 2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6-氮雜胞
嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞啼啶；5-
丙'J^S胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶(5-bromovinyluracil); 5-MM嘧啶；5-繊嘧
啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿噴啶；5-乙
'^S尿嘧啶；5-丙'^S尿嘧啶等等。許多非天然存在的 也描述于例如Seela 等(1991 ) //e/v (3^.爿cto 74:1790,Grein等(1994)歷cwg A/ed C/iew. Leff.4:971-976，以及Seela等(1999)//e/v CA,m.爿cto 82:1640。修飾的堿凝口核 苷酸的其它實(shí)例也描述于例如美國(guó)專利Nos. 5,484,908、 5,645，985、 5,830,653、6,639,059、 6,303,315以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2003/0092905。
"核苷酸指的是核苷的酯，如核苷的磷酸酯。為了說(shuō)明，核苷酸可包括l、 2、 3個(gè)或更多共j條接至所述核苷的糖部分(如5'位、3'位、2'位等等)的磷 酸基團(tuán)。
"核苷酸整合生物催化劑"指的是催化核苷酸整合入核酸的催化劑。核苷酸 整合生物催化劑通常是酶。"酶"是基于蛋白質(zhì)的催化劑，其發(fā)揮作用以減少涉 及其它化合物或'底物'的化學(xué)反應(yīng)的活化能。"核苷M合酵'指的是催化核苷酸 M入核酸的酶。實(shí)例性核苷1 ^,括，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、 終端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶、多核苷酸磷酸化酶等等。其它的生物催化劑 可以是基于DNA的("DNA核酵0或基于RNA的("核酶')。"耐熱酵'指的 是對(duì)熱穩(wěn)定的酶，當(dāng)經(jīng)，擇的時(shí)間段的升高的溫度時(shí)是熱抗性的，并保留足 夠的催化活性。例如，當(dāng)經(jīng)受實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸變性所需時(shí)間的升高纟顯度時(shí)，耐熱 聚合謝呆持足夠的實(shí)現(xiàn)隨后的弓卿延伸反應(yīng)的活性。核酸變性必需的加熱條件 是本領(lǐng)域所熟知的，并且例示于題為"PROCESS FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、1987年7月28日授權(quán)給Mullis的美國(guó)專利No. 4,683,202， 以及題為"PROCESS FOR AMPLIFYINQ DETECTINQ AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、 1987年7月28日授豐又給Mullis等的美國(guó)專利 No. 4,683,195中。本發(fā)明所使用的耐熱聚合酶通常適合在溫度循環(huán)反應(yīng)諸如 PCR或5'-核酸酶反應(yīng)中應(yīng)用。對(duì)于耐熱聚合酶，酶活性指的是以正確的方式催 化核苷酸聚合以形成互補(bǔ)于模板核酸的弓l物延伸產(chǎn)物。
示例性的核苷酸齡生物催化齊抱括，如G46E E678G CS5 DNA聚合酶、 G46EL329AE678GCS5 DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F CS5 DNA聚 合酶、G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS6 DNA聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、Hffi熱菌(77^^t^ 聚合酶、TMA-25聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、E678G TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、棲熱菌屬(7^emmO物種SPS-17聚合酶、 E615G Taq聚合酶、棲熱菌屬Z05R聚合酶、T7 DNA聚合酶、科恩伯格 (Komberg) DNA聚合酶、克列諾(Klenow) DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、 微球菌DNA聚合酶、a DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、M- MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、大腸桿菌(EcW) RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA聚合 酶n、末端轉(zhuǎn)移酶、多核苷酸磷酸化酶、核糖核苷酸齡DNA聚合酶，等等。
術(shù)語(yǔ)"序列段"指的是本發(fā)明多核苷酸的5'-部分的多核苷酸子序列(即5' 尾)。5'-部分包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)序列段，每個(gè)序列段具有位于5'-末端的 獨(dú)# ，它們?cè)谝环N多核苷酸5'-尾J^t于所有序列段是相同的。序列段可具 有約3-10個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)度，例如，約3-8、 3-6、 4~6、 4-8或7-8 M的長(zhǎng) 度，并且5'-部分可包含2個(gè)至約10個(gè)或更多序列段。序列段可以是但不需要 是等質(zhì)量的。等質(zhì)量的序列段可以是但不需要具有相同的序列。共享相同核酸 序歹啲5'-尾中的序歹煅是重復(fù)。
術(shù)語(yǔ)"5'-末端"和"3'-末端"可互換指代多核苷^h的核苷酸位置，其處于5'-端或3'-端(即5'-或3'-^ )，鄉(xiāng)巨離核酸或其子序列^的一個(gè)或兩個(gè)核 苷酸鵬位置(即，處于距5，-或3，-末端(-1)或(-2)的位置)。
術(shù)語(yǔ)"封閉部分"或'封閉基團(tuán)"指的是附著至多核苷酸3'-末端的化學(xué)基團(tuán)或 部分，其阻止核酸的延伸，如通過(guò)至少一個(gè)核苷M合生物催化齊啲延伸。示 例性的封閉部分包括在3'-末端核苷酸鵬的2'位的取代基即2'終止子核苷酸。
"2'終止子核苷酸"指的是在核苷酸糖部分2'位包含封閉基團(tuán)(BG)的核苷 酸類似物。2'終止子核苷酸可以是不可被一個(gè)或多個(gè)核苷酸齡生物催化劑延伸 的。那就是， 一旦2，終止子核苷酸被^入核酸(如在核酸的3，終末端)，封閉 基團(tuán)就阻止通過(guò)至少一個(gè)核苷酸整合催化齊啲核酸的進(jìn)一步延伸。示例性的封 閉基團(tuán)是磷酸基團(tuán)。示例性的2'終止子核苷,括2'-單磷酸-3'-羥基-5'-三磷酸 核苷和2，-單磷酸-3，-羥基-5，-二磷酸核苷。2'終止子核苷酸詳細(xì)描述于，例如美 國(guó)專利公開(kāi)Nos. 2007/0219361和2007/0154914。
術(shù)語(yǔ)"耙核酸'指的是任何包括待檢子序列的核酸。耙核酸可以是DNA或 RNA。靶核酸可以是任意來(lái)源，包括基因組DNA、 mRNA、 cDNA。革巴核酸可 以是天然存在的或合成的(如擴(kuò)增子、載體等等)。耙核酸可以是但不需要是純 化或分離的。取決于檢測(cè)測(cè)定的性質(zhì)，靶核酸可以是來(lái)源于植物或動(dòng)物組織， 或取自反應(yīng)混合物。耙核酸在長(zhǎng)度上沒(méi)有限制，盡管耙核酸可以在由目前的方 法檢測(cè)或鑒定之前暴露于限制性內(nèi)切核酸酶。對(duì)于本發(fā)明方法的目的而言，靶 核麟用本領(lǐng)域己知的方法制備。
術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增劍牛"指的是擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR擴(kuò)增、RT-PCR擴(kuò)增)的割牛，
14所述的擴(kuò)增反應(yīng)允許可延伸多核苷瞰例如，引物)與靶核苷酸的雜交，以及可延 伸多核苷酸的模板依賴的延伸。如本發(fā)明所〗頓的，"擴(kuò)增條件"鵬于擴(kuò)增靶
核酸的充足^f牛是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如K^Pr/mwJI^orato^Mwwa/, Dieffenbach和Dveksler,編輯,20(B, Cold Spring Harbor Press;以及尸O 尸ratoco&， Bartlett和Stirling,編輯,20(B, Humana Press 。


圖1示例說(shuō)明了本發(fā)明的多核苷酸以及方法的示意^。在lt際例性實(shí)施 方案中，多核苷酸包含具有3個(gè)相同序列段(即"重復(fù)")的5'-部分或5'-尾 (5'-NTAATAATAAT-3';SEQ ID NO:l )。所述的多核苷酸用于檢測(cè)耙核酸內(nèi)的多 態(tài)性核苷酸。所述的核苷,可包含約50%至100%的核糖核苷酸，所述的核糖 核苷酸互補(bǔ)于每個(gè)序列段的5'-末端位置的核苷酸(如rATI^A)。核糖核苷酸被 整合入互補(bǔ)于多核苷酸的擴(kuò)增子鏈。使擴(kuò)增子經(jīng)受片段化，從而釋放序列段。 接著，檢測(cè)釋放的序列段的質(zhì)量。核糖核苷酸也將齡入耙核酸的互補(bǔ)鏈(3，-^ATTATTATTA-5，;SEQIDN0:2)。因此，革巴核酸的擴(kuò)增鏈也將在核糖核苷酸 被M^的位置經(jīng)受切割。
圖2示例說(shuō)明了應(yīng)用于此以及實(shí)施例1所描述的方法在H19基因內(nèi)SNP的 C等位基因的成功基因型分型。"GTCTTA"指的是詢問(wèn)弓,(interrogating primer) 中重駄聚體的反向互補(bǔ)核辦列。"噪聲表明沒(méi)有檢觀倒可辨另啲信號(hào)。
圖3示例說(shuō)明了應(yīng)用于此以及實(shí)施例1所描述的方法在H19基因內(nèi)SNP的 T等位基因的成功基因型分型。"GCTCTA"指的是詢問(wèn)引物中重復(fù)六聚體的反 向互補(bǔ)核,列。"噪聲表明沒(méi)有檢測(cè)到可辨別的信號(hào)。
圖4示例說(shuō)明了應(yīng)用于此以及下面的實(shí)施例1所描述的方法在H19基因內(nèi) SNP的C和T等位基因的成功并行基因型分型。"噪聲表明沒(méi)有檢測(cè)至何辨別 的信號(hào)。
圖5示例說(shuō)明了應(yīng)用80%或90%核糖核苷酸(此處是rATP)以及脫氧核糖 核苷酸dU和dC對(duì)HIV轉(zhuǎn)錄物的成功鑒定。未從不具有纟鎌的樣品中獲得信號(hào)。 參見(jiàn)實(shí)施例2。 "CCUA"指的是上游引物中重復(fù)四聚體的反向互補(bǔ)核酸序列 (4xCCUA=SEQ IDNO:6)。 "GUGA"指的是下游引物中重復(fù)四聚體的反向互補(bǔ) 核Mi^列(4xGUGA=SEQIDNO:7)。"噪聲表明沒(méi)有檢觀倒可辨別的信號(hào)。
圖6示例說(shuō)明了應(yīng)用80%或90%核糖核苷酸(此處是rATP)以及脫氧核糖核苷酸dU和5-Me-dC對(duì)HIV轉(zhuǎn)錄物的成功鑒定(4xCmeCmeUA= SEQ ID NO:8; 4xGUGA=SEQIDNO:7)。未從不具有模板的樣品中獲得信號(hào)。參見(jiàn)實(shí)施例2。
"噪聲表明沒(méi)有檢測(cè)到可辨另啲信號(hào)。
圖7總結(jié)了圖5和圖6示例說(shuō)明的測(cè)i辦品的結(jié)果(4xCmeCmeUA: SEQ ID NO:8; 4xCCUA=SEQ ID NO:6)。
圖8A-C示例說(shuō)明了 N0S1_361的SNP R的ATP核糖-PCR的7-聚體區(qū)域 的質(zhì)譜。A，對(duì)應(yīng)于純合子A的3片段GTTTCTA(3xGTTTCTA-SEQIDNO:9)。 B，對(duì)應(yīng)于雜合子AG的3片段GTTTCTA和GTTTTTA(3xGTTTTTA= SEQ ID NO:IO)。 C，對(duì)應(yīng)于純合子G的三片段GTTTTTA。
具體實(shí)施例方式
1、導(dǎo)言
本發(fā)明提供了多重檢測(cè)程序，其要求最小數(shù)目的反應(yīng)步驟并允許方便和真 實(shí)的多重化。該禾旨利用M^核糖核苷酸堿基的反應(yīng)(如包含四種核苷酸(A、 C、 G、 T)至少之一全部或部分作為核糖堿基(ribobase) (rNTP)的擴(kuò)增反應(yīng))。 采用了對(duì)耙核Mf寺異的引物。弓卿中的一個(gè)或兩個(gè)具有5'-尾，所述5'-尾帶有一 個(gè)、兩個(gè)或更多^^勺3-10個(gè)或更多個(gè)鵬的序列段，并且?guī)в形挥邶g序列段 5'-末端的與核糖堿基互補(bǔ)的堿基。序列段可以但不需要是等質(zhì)量的。擴(kuò)增導(dǎo)致 引物序列包括其5'部他括入擴(kuò)增子(即擴(kuò)增產(chǎn)物)。擴(kuò)增子也將包含齡的核 糖堿基。為了通過(guò)質(zhì)譜分析法進(jìn)行分析，使擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)歷片段化，例如，通過(guò) 暴露于堿。所述的鵬擇性地切害螺在齡的核糖堿基3'的DNA主鏈。因此， 擴(kuò)增產(chǎn)物中的弓l物序列的整合，以游列段，使得可通過(guò)檢測(cè)序列段的不同質(zhì) 量而檢測(cè)產(chǎn)物的存在。弓l物的使用轉(zhuǎn)化為具有拷貝并擴(kuò)增的序列段的質(zhì)量的產(chǎn) 物的存在。
為用于多重化，用于多個(gè)革E核酸(如不同的等位基因)的引物尾端具有不 同的5，部分序列段，其在切害U后生成不同質(zhì)量的產(chǎn)物。所有新合成的DNA含有 整合的核糖堿基并因而在經(jīng)受堿的時(shí)候產(chǎn)生片段。為方便解釋，可設(shè)計(jì)整個(gè)系 統(tǒng)，從而使得從引物以及其他核酸的雜交部分通常出現(xiàn)的質(zhì)量信號(hào)不同于5'-尾 序列段或其互補(bǔ)體的質(zhì)量。單個(gè)尾中的序列段可以是等質(zhì)量的，并且可以是相 同序列的(即重復(fù))。重餅歹暇的重復(fù)導(dǎo)致了鵬衍生自弓卿與耙核酸退火或 拷貝耙核酸的部分的序列的信號(hào)的清晰信號(hào)。根據(jù)權(quán)禾腰求1的方法，其中每個(gè)5'部分序列段是等質(zhì)量的，因而是本發(fā)明的 實(shí)施方案。
禾聘允許單個(gè)孔中具有最少數(shù)目的反應(yīng)步驟的10個(gè)或更多個(gè)樣品的有效多
重基因型分型。所述的步驟通常需要DNA模板和主混合物(mastermix)的混
合。在熱循環(huán)之后，加入堿溶液，且測(cè)量片段化的序列段的質(zhì)量，例如，通過(guò)
質(zhì)譜分析法?？刹捎萌我庖阎糜谫|(zhì)量測(cè)量的方法。當(dāng)應(yīng)用質(zhì)譜分析法時(shí)，任
一種類的質(zhì)譜儀都適合用于分析。
弓,可任逝也包含可去除的3'-末端封閉劑(即，"熱啟動(dòng)")以使得相同的
耐熱DNA聚合酶能實(shí)現(xiàn)'熱啟動(dòng)'，從而提高特異性以及允許更^f呈度的多重化。
在實(shí)施目前方法的一個(gè)實(shí)例中，核糖PCR (ribo PCR)可用對(duì)于旨耙核 酸(如^SNP，每個(gè)等位基因)的DNA樣品、兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向 引物實(shí)施。正向弓卿設(shè)計(jì)為特異于一個(gè)耙核酸(如一個(gè)SNP， 一個(gè)等位基因)， 其3'-末端或3'-末端倒數(shù)第二個(gè)^S特異互補(bǔ)于耙核社的識(shí)別堿基。針正向 弓卿具有特異的5'-尾，其包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)具有相同質(zhì)量的序歹暇，其 中針序列段的5'-末端鵬互補(bǔ)于PCR擴(kuò)增混合物中的核糖核苷酸(NTP)。 序列段的質(zhì)量設(shè)計(jì)為在不同的等位基因、SNP以及其他可檢測(cè)耙核酸中是不相 同的并且可區(qū)別的。
為生成具有可區(qū)別質(zhì)量的序列段，弓l物的5，-尾可包含，例如，約2-10個(gè)約 為3-10個(gè)^^長(zhǎng)度的序列段，或約4-7 ^i勺為4^6個(gè)^^長(zhǎng)度的序列段，或約 2-3個(gè)約為7-8個(gè) 長(zhǎng)度的序列段。
核糖陽(yáng)PCR (Ribo-PCR)或核糖擴(kuò)增(ribo國(guó)amplification)是具有脫氧核苷酸 以及至少一個(gè)核苷酸(核糖核苷酸或rNTP)的混合物的PCR反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)。 這種反應(yīng)的例子是包含dGTP、核糖核苷酸rTTP (即5-甲蟇UTP)、 dCTP以 及dATP，以及在合適緩沖液中有效整合及延伸核糖核苷酸的DNA聚合酶的 PCR混合物。所述的反應(yīng)可fflil任意延伸反應(yīng)包括熱循環(huán)反應(yīng)來(lái)實(shí)施。熱循環(huán) 之后，可以用堿處理反應(yīng)混合物。所述的堿可以是強(qiáng)堿，例如NaOH或KOH。 所述的堿切害螺在齡的核糖M3'的DNA主鏈，并導(dǎo)致片段的生成。革巴核酸 的存在導(dǎo)致特異于耙核酸的正向弓嫩的應(yīng)用并且因此存在擴(kuò)增的5'-尾序列?？?貝并切害啲尾的互補(bǔ)體具有獨(dú)特的質(zhì)量。所述的質(zhì)量用于確定測(cè)試樣品中靶核 酸的存在。對(duì)應(yīng)于被切割的互補(bǔ)，歹啲質(zhì)量信號(hào)的存在被用于鑒定測(cè)試樣品
17中靶核酸的存在。為用于多重化，應(yīng)用了許多不同的尾序列，旨尾序列具有
切割后產(chǎn)生特定質(zhì)量的DNA的M組成。 2、多核苷酸
本發(fā)明的多核苷酸包含5，-部分或5，-尾，所述5'-部分或5，-尾包含一個(gè)、兩 個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)序列段，以及設(shè)計(jì)為足夠互補(bǔ)以與靶核酸退火以允許核苷酸基 于模板延伸的3'部分。
a 5,-部分
5，-部分或5，-尾包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)(即鄰接的)序列段，M序 列段包含獨(dú)特的核苷酸堿基(即在該段中僅用一次)，其位于每個(gè)序列段的5，-末端。在 的實(shí) 案中，5'-部分或5'-尾中的每個(gè)序列段具有相等的質(zhì)量。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，5'-部分或5'-尾中的每個(gè)序列段具有相同的(意味 著同樣的)的核苷l(shuí)i^列。將具有相同的核苷,列的串辦列段稱為重復(fù)。 獨(dú)特的核苷酸堿基可接著最后一個(gè)(第二個(gè)職三個(gè)鄉(xiāng)四個(gè)，等等)串辦 列段。例如，具有3個(gè)相同質(zhì)量、每一個(gè)4個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的序列段的5'-部分或 5'-尾的序列可以是5'-TAGCTAGCTAGCT-3，(SEQIDNO:3)，其中核苷酸 "T"互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中的核糖堿基。
如同上文的示例，在一些實(shí)施方案中，5'-部分或5'-尾的3'-末端核苷酸堿 基互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中的核糖鵬。因?yàn)閴A性溶液切害螺在齢的核糖M 3' 的鍵，包括在5'-部分的3'-末端，互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中核糖M的核苷酸^S使 得所有序列段釋放。保留在切割的擴(kuò)增子3'-末端的是齢的具有2'或3'磷酸的 核糖鵬。參見(jiàn)圖l。如果5'-部分僅包含一個(gè)序列段，貝腰求位于5'-部分3'-末端的互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中核糖堿基的核苷酸堿基。如果兩個(gè)鞭多個(gè)序列段 具有不同質(zhì)量，則也要求位于5'-部分3'-末端的互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中核糖 的 核苷酸堿基。然而，如果靶互補(bǔ)部分的末端5'-核苷酸也是相同盼'獨(dú)特"核苷酸 鵬，或者如果5'-部始有兩個(gè)或更多個(gè)相等質(zhì)量的序列段，貝啦于5'-部分3'-末端的互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中核糖M的核苷酸M是任選的。
在雌的實(shí)船案中，附加的核苷酸 &含于5'-部分的5'-末端。附力啲 5'-末端核苷酸堿基可以是任意的堿基。示例性的具有附加5'-末端核苷酸 的 5'-部分可以是5'-NTAGCTAGCTAGCT-3'(SEQIDNO:4)。包括附加的5:末端 核苷酸堿基增加了釋放的片段質(zhì)量的均勻性與準(zhǔn)確性。這是因?yàn)?，?dāng)堿性溶液切割緊在齡的核糖堿基3'的鍵時(shí)，2'或3'磷酸部分保持附著于核糖 。參 見(jiàn)圖1 。當(dāng)應(yīng)用不進(jìn)行模板非 性延伸的核苷,合生物催化劑時(shí)，包含在5'-部分5'-末端的附加核苷酸堿基找到了用途。
在其它雌的實(shí)施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段具有相同的質(zhì)量但序 列不同。例如，具有3個(gè)相同質(zhì)量、每一個(gè)四個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的序列段的5'-部分 或5'-尾的序列可以是5'-TAGCTCAGTGCAT-3'(SEQIDNO:5)，其中所述的核 苷酸M^'T'互補(bǔ)于反應(yīng)混合物中的核糖堿基。
在進(jìn)一步4，的實(shí)施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段可以是不同長(zhǎng)度 (如3、 4和/或5個(gè)核苷酸堿基)和不同質(zhì)量的，但當(dāng)擴(kuò)增子進(jìn)行切割時(shí)，齡 5，-部分或5，-尾產(chǎn)生可被例如質(zhì)譜分析法鑒定的可區(qū)分的"特征"模式。
5'-部分或5'-尾可包含有如所需的2到約10個(gè)序列段，或更多個(gè)，例如， 約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或更多個(gè)串聯(lián)序列段。每個(gè)序列段可以是約3 個(gè)到約10個(gè)核苷酸M長(zhǎng)度，或更長(zhǎng)，例如，約3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或 更多個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度。通常，序列鵬長(zhǎng)，需要包含于5'-尾中的就越少。相 忠也，序列鵬短，將包含于5'-尾內(nèi)的就越多。例如，5'-尾可以包含約24個(gè) 約7-8個(gè)核苷酸鵬長(zhǎng)度的序列段，或約4-6 ^^勺4-6個(gè)核苷酸m長(zhǎng)度的序列 段，或約5-8個(gè)約3-5個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的序列段。
多核苷酸用作耙核膨趙申以及擴(kuò)增反應(yīng)中的引物。位于每個(gè)5'-尾序列段的 5'-末端的獨(dú)特核苷酸堿基互補(bǔ)于包括在反應(yīng)混合物中的核糖核苷酸itt，所述 反應(yīng)混合物用于被本發(fā)明的多核苷酸雜交的耙核酸的延伸或擴(kuò)增。
b, 3,-部分
多核苷酸的3'-部分被設(shè)計(jì)為具有足夠互補(bǔ)以與耙核,列雜交并延伸的核 ,列。3'-部分如所需的至少是5個(gè)核苷酸鵬長(zhǎng)度，且可以更長(zhǎng)，例如，約 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度。3，畫(huà)部分的3，陽(yáng)末端 或3'-末端的(-1)爽-2)位核苷酸 ，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，用于區(qū)分耙核 酸中的特定等位基因或SNPs。示例性的例如用于弓卿延伸或熱循環(huán)的反應(yīng)^f牛 包括約50mMA42-羥-U-二羥甲基乙基]甘氨酸-KOH (丁ricine-KOH)， pH7.5， 100mMKOAc， 3.0mMMg(OAc)2，以及200nM的各種dNTP;退火或雜交 鵬 可以為約5(TC-70°C，例如為約60^5"C。
在iM的實(shí)施方案中，3'-部分的3'-末端任選地具有封閉基團(tuán)^m閉部分，
19其可鄉(xiāng)也阻止多核苷酸的延伸。示例性的可3l^t閉部他括附著于3'-鄉(xiāng)核苷 酸的2'位置的取代基(即2'終止子)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，2'-終止子部分 是磷酸或磷酸類似物，例如甲基氨基磷酸。
通常，在糖部分2'位置利用的封閉基團(tuán)(BG)可包括各種不同的實(shí)施方案。
的，例如，所述的BG是負(fù)電荷基團(tuán)柳駄^IR基團(tuán)。為進(jìn)一步解釋說(shuō)明， BG任iMki^自如CN、 N02、 N3、卣基團(tuán)、醚基、縫、羧酸基團(tuán)、酯基團(tuán)、 氨基基團(tuán)、OCH3、 OCH2COOH、 O-甲硅烷醚基團(tuán)、酮基基團(tuán)、O內(nèi)酯基團(tuán)、 0-烷基基團(tuán)、O-環(huán)烷基基團(tuán)、0-| ;?；鶊F(tuán)、O-'鵬(alkynl)基團(tuán)、氮基甲酸 酯基團(tuán)、 胺基團(tuán)、醐安基團(tuán)及其組合。更特別地，BG任;^i也包含式(I):
其中Q是O、 S或NH; X是H、 OH、 CH3、 BH3、 F或SeH;并且Z是O、 S或Se。為進(jìn)一步解釋說(shuō)明，BG任選地包含式(m):
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se;并且R是烷 基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)或炔基基團(tuán)。在另一個(gè)示例性雌的實(shí)施方案中，BG包含 式(IV):
在其它 的實(shí) 案中，BG包含式(E):Z
X——L-R
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se; L是 -CONH(CH2)nNH-、國(guó)國(guó)CO(CH2)nNH-誦、或-CONH(CH2CH20)nCH2CH2NH-; n 是大于零的整數(shù)，并且R是NH2、 SH、 COOH、猝滅部分、報(bào)道部分、生物素 或親和部分。
示例性有用的2'-終止子核苷飽括2'-單磷酸-3'-羥基-5'-三磷酸核苷以及 2，-單磷酸-3，-羥基-5，-二磷酸核苷。2'-終止子可逆封閉基團(tuán)詳細(xì)描述于，例如美 國(guó)專利公開(kāi)Nos. 2007/0219361以及2007/0154914。
本發(fā)明的多核苷酸可任選地含有非天然存在的核苷酸主鏈鍵、核苷酸堿基 以及核苷酸堿基類似物，如本發(fā)明所述。多核苷酸可以是單鏈^5l鏈的。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，多核苷酸在它們的全長(zhǎng)均是單鏈。多核苷酸可以含有但時(shí)常 不含有任何標(biāo)記，例如附著的熒光團(tuán)、放射性同位素、酶或其它鑒定劑。多核 苷酸可以是分離的、合成的或重組的。多核苷酸，包括5'-和3'-部分，可以是任 意長(zhǎng)度的并且通常是約200個(gè)核苷酸頗短，例如，約150、 125、 100、 75、 50 或25，或更少的核苷酸長(zhǎng)度。
3、檢測(cè)方法
a 4吏革巴核酸與本發(fā)明的多核苷酸接角蟲(chóng)
實(shí)施檢測(cè)方法的第一步涉及將耙核酸與本發(fā)明的多核苷酸、核苷酸集以及 核苷M合生物催化組分接觸。 i.核苷,
用于本方法的核苷 包含至少一個(gè)核糖核苷酸 形式的 (如A、U、 G或C或另一個(gè)核糖核苷酸，rNTP)。在一些實(shí)施方案中，核苷麟含有至少 兩個(gè)核糖核苷酸堿基形式的堿基。所述的一個(gè)或多個(gè)作為核糖核苷酸 被包 括的MS，可以是全部(如100%的核糖核苷酸)或部分地(如少于100%的核 糖核苷酸，如堿基的殘余部分是脫氧核苷酸或dNTP)作為核糖核苷酸^S被包 括在核苷酸集中的。在 的實(shí)施方案中， 一個(gè)或多個(gè)核苷酸t(yī)t以大部分作
21為核糖核苷酸(rNTP)存在，即 150%，如60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%，以及以小部分作為脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在(即少于50%)。在特 別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種核苷酸堿基的至少80%是核糖核苷酸的形式。 一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸一起被包括在內(nèi)以完成完整的核苷酸 集(A、 T、 C和G核苷酸存在)。 ii.生物催化組分
本發(fā)明的方法采用的核苷,合生物催化組分包含脫氧核糖核苷酸和核糖 核苷M合活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相同的催化結(jié)構(gòu)域可催化脫氧核糖核 苷酸禾啦糖核苷酸齡活性。在其它雌的實(shí)施方案中，生物催化組分包含至 少兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域， 一個(gè)具有脫氧核糖核苷酸整合活性，另一個(gè)具有核糖核苷
適合用于本發(fā)明方法的示例性生物催化組分包括，但不限于，作為修飾的 Z05、 CS5、 CS6或Taq聚合酶的聚合酶。CS5、 CS6嵌合聚合酶進(jìn)一步描述于， 如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2004/0005599。棲熱菌屬(7 2emm)物種Z05已在PCT 國(guó)際專利公開(kāi)No. WO 92/06200中公開(kāi)。示例性的修飾酶包括，如G46EE678G CS5DNA聚合酶、G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329AT606S D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46EE678GCS6DNA聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶等等。 例如相對(duì)于缺乏一個(gè)或多個(gè)這些突變的酶，這些修飾的酶包括增強(qiáng)核糖核苷酸 齡的、以及增強(qiáng)核糖核苷酸2'-斷布類似物齡的、禾口/或減少或消除5'-3'外 切核酸酶活性的突變，。
涉及有用的核苷酸整合生物催化劑的其它細(xì)節(jié)也在如美國(guó)專利申請(qǐng)Na 11/873,896以及美國(guó)專利Nos. 5,939,292、 4,889,818、 5,374,553、 5,420,029、 5,455,170、 5,466,591、 5,618,711、 5,624,833、 5，674,738、 5，789,224、 5,795,762、 7,148,049以及7,179,590中提供。
可通過(guò)各種方法，如位點(diǎn)定向誘變、化學(xué)修飾等，來(lái)完成具有如整合核糖 核苷酸以及2'-終止子核苷酸的增強(qiáng)效率或其他所需性質(zhì)的修飾酶的生產(chǎn)。更具 體地，位點(diǎn)定向誘變通常通過(guò)位點(diǎn)特異性弓,指導(dǎo)的誘 完成。這種技術(shù)可 采用除了代表所需突變的都艮錯(cuò)配外互補(bǔ)于待誘變的單鏈?zhǔn)删wDNA的合成 寡核苷酸引物來(lái)實(shí)施。簡(jiǎn)而言之，合成的寡核苷酸用作引物以指導(dǎo)互補(bǔ)于質(zhì)?；蚴删w的鏈的合成，并且將所得的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入支持噬菌體的宿主細(xì) 菌。所得的細(xì)菌可艦如DNA序列分析或探針雜交來(lái)測(cè)定，以鑒定那些攜帶所 需突變基因序列的噬菌斑。為進(jìn)一步解釋說(shuō)明，也可利用許多其它的修飾核酸 的方法，諸如"重組PCR"方法。
在本發(fā)明的實(shí)踐方面(如生產(chǎn)修飾的酶、實(shí)施測(cè)序反應(yīng)等等)，任i^t也應(yīng)用 ^f生物學(xué)以及重組DNA的許多常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是公知的并且解釋于，例 如，Q/w加尸ratoco^ /" Mo/ecw/ar 5,o/ogy,1997-2007(F.M.Ausubel編輯),Wiley Interscience;Sambrook等,2001jM /ecw/ar C/o"/"- /aZ)orato y Mo^wa/,第三 脫Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y;Berger禾卩Kimmel, GW<afe to M /ecw/ar C7o"/"g 7fec/2"—es A/e&Ofis1 ￡h^>wo/ogv巻152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)^DA64 C7cra) g:^4尸rac"ca/ ^4pjwoac/7,巻I禾卩 n,1985(D.N.Glover ed);(9//gowwc/eofefe S>^/2a^,1984(M.L.Gait ed); 7Viwc/e/c爿c/d /^^r/<^a^'ow, 1985,(Hames禾口 Higgins);rraracn)^o" <m/ 7h3m7af/ow, 1984(Hames禾口 Higgjns eds.);4幽a/ Ce〃 Q^,，1986(R.I.Freshney ed); //w膨緣!ze(i Oto朋d E^was,1986(IRL Press); Perbal,1984^4尸rac"c"/ Gw/(ie to M /ecw/ar C7ow/"g;系 歹U 5Mef/20<is 五"^ymo/ogv(Academic Press,Inc.);Ge"e 7hm^r Kctora Afomma//^ Ceto,1987(J.H.Miller禾卩MPCalos編輯，Cold Spring Harbor Laboratory); A/e^o^fe ￡> ^vmo/ogy巻154禾口巻155(分另lj為Wu禾口 Grossman,以 及Wu，編輯)。
ni.多核苷酸
用于本方法的5'-加尾的多核苷酸如上文和此處描述。在 的實(shí)施方案中， 耙核酸與許多(如兩個(gè)或更多個(gè))5'-加尾的多核苷酸相接觸。在其它優(yōu)選的實(shí) 施方案中，這些許多多核苷酸中的每一個(gè)通過(guò)具有包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)等 質(zhì)辦列段的5'-部分分另哋可識(shí)別。在此情況下，齡5'-加尾的多核苷,補(bǔ) 序列的擴(kuò)增子或互補(bǔ)體的片段化產(chǎn)生不同的質(zhì)量信號(hào)或牛寺征質(zhì)量概況。在迸一 步優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸作為一個(gè)或多個(gè)弓卿對(duì)與耙核酸相接觸。弓卿 對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸可包括包含串聯(lián)序列段的5'-尾。還可以提供作為一 個(gè)或多個(gè)弓l物對(duì)與耙核酸接觸的多重多核苷酸，其中弓l物對(duì)中的每個(gè)弓卿包含 含有相同質(zhì)量的串聯(lián)序列段的5'-部分。在此情況下，用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的引物對(duì) 中每個(gè)引物的5'-部分的互補(bǔ)體的片段化生產(chǎn)更大(如，約兩倍)強(qiáng)度的單質(zhì)量信號(hào)。備選地，引物對(duì)中的每個(gè)弓卿可包含一個(gè)序列段，引物對(duì)中每個(gè)引物中 的序列段是相同質(zhì)量的。
在方法的 實(shí)施方案中，5'-加尾的多核苷酸可包含具有不同質(zhì)量的一個(gè) 序列段以產(chǎn)生可檢測(cè)的切害U產(chǎn)物。 iv.耙核酸
革巴核酸可來(lái)源于任意來(lái)源，如來(lái)源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌鵬毒的組織樣品，
或者可以是例如從反應(yīng)混合物合成的。耙核酸可以是，如基因組DNA、染色體 或染色體節(jié)段、mRNA、 cDNA、載體(如表達(dá)載體)、表達(dá)盒、裸DNA或RNA 聚合物、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物、寡核苷酸、探針、引物等等。靶核酸 可以是，如單鏈、雙鏈、三鏈等等，并且不限于任何特定的長(zhǎng)度。用于本發(fā)明 方法的靶核酸時(shí)常地將包含一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入、缺失、 置換或其它辨別特征。革巴核酸通常在樣品中提供。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以辨別一個(gè)或多個(gè)SNPs的目的接觸革E核酸(即實(shí)施 的方法)。在這樣的應(yīng)用中，采用了至少兩個(gè)不同的等位基因-辨別性5'-加尾的 多核苷酸，它們的3'-部分不相同，從而使得它們特異性地與特定等位基因退火， 并且，它們的5'-部分也不相同，從而使得一個(gè)或多個(gè)序列段具有對(duì)應(yīng)于并獨(dú)特 地鑒別被3'-部分結(jié)合的等位基因的質(zhì)量。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，以檢測(cè)靶核酸中一個(gè)或多個(gè)稀有突變的目的接 觸靶核酸。在這樣的應(yīng)用中，存在一個(gè)或多個(gè)具有特異性與靶核酸中特定位置 的突變退火的3'-部分的多核苷酸(具有特異性與野生型在相同位置退火的3'-部分的多核苷酸，可任選地存在于相同或分開(kāi)的反應(yīng)中)。當(dāng)評(píng)估耙核,列中 的一個(gè)突變時(shí)，可以應(yīng)用一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)分不同突變的5'-加尾的多核苷 酸，其在3'-部分不同，從而使得它們特異性與野生型或一個(gè)或多個(gè)突翅退火， 并且，它們?cè)?'-部分也不同，從而使得一個(gè)或多個(gè)序列段具有這樣的質(zhì)量，所 艦量對(duì)應(yīng)于并獨(dú)特地鑒別被3'-部分結(jié)合的等位基因。在評(píng)估一個(gè)耙核酸中的 兩個(gè)或更多個(gè)突變的應(yīng)用中，具有特異性檢測(cè)耙核酸中第一位置的突變的3'-部 分的多核苷酸，可以具有全部是第一質(zhì)量的5'-部分序歹煅；具有特異性檢測(cè)耙 核酸中第二位置的突變的3'-部分的多核苷酸，可以具有全部是第二質(zhì)量的5'-部分序列段。備選地，多核苷酸5'-部分序列段的質(zhì)量可以彼此不同，作為獨(dú)特 的鑒定劑操作。在其它 的實(shí)施方案中，如那些涉及多重?cái)U(kuò)增^伸的，作為兩個(gè)或更
多個(gè)弓,對(duì)提供多核苷酸。在第一引物對(duì)中，引物對(duì)中的齡弓l物的5'-部始 有第一質(zhì)量的序列段;第二弓卿對(duì)中針弓l物的5'-部始有第二質(zhì)量的序歹峨， 其可檢測(cè)地不同于第一質(zhì)量；第三弓,對(duì)中針弓胸的5，-部船有第三質(zhì)量的 序列段，其可檢測(cè)地不同于第一和第二序列段的質(zhì)量；后續(xù)引物對(duì)中每個(gè)引物 的5'-部，含具有可檢測(cè)地不同于前面所有的或其它弓l物對(duì)的質(zhì)量的序列段。 弓l物對(duì)的數(shù)目以及擴(kuò)增或延伸反應(yīng)受反應(yīng)混合物中游離核苷酸堿基可用度的限 制。在一M^的實(shí)驗(yàn)案中，反應(yīng)混合物可包含有2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對(duì)。這種策略允許多個(gè)耙核酸或單個(gè)耙核酸當(dāng)中的多個(gè) 靶的并行檢測(cè)。
b.擴(kuò)增革E核酸以生產(chǎn)擴(kuò)增子
l擴(kuò)增方法
可采用一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸，應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任意的多核苷酸 延伸或擴(kuò)增的方法來(lái)擴(kuò)增耙核酸。應(yīng)用聚合M反應(yīng)(PCR)的任意己知變化， 包括RT-PCR、定量PCR、多重以及實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增在本發(fā)明的方法中是有用 的。擴(kuò)增也包括了等溫?cái)U(kuò)增方法和本領(lǐng)域已知的多核苷ME伸方法。實(shí)施PCR 的規(guī)程是本領(lǐng)域所熟知的，且其描述于，例如PO 尸hmerv4I^orato^M朋^^ Dieffenbach禾口 Dveksler,編輯,2003,Cold Spring Harbor Laboratory Press;爿-Z q/" 0/07 故加've尸C尺,Bustin，編輯,2004,Intemational University Line; EdwardsrRea/-7l, 尸C7 .vlw _&扁如/ Gw/cfe，2004，Taylor& Francis; Wea/ 7 ,尸C尺Do喊ed.,2006, Taylor & Francis;尸CA尸rotoco&:爿Gw/<afe to Me^o<iy朋c/ ^4p/ //caft'ora, Innis,等,編 輯，1990,Academic Press, San Diego;PO Srrategz^,Innis,等,編輯,1995,Academic
編輯，1999,Academic Press,San Dieg。耙核酸擴(kuò)增跑正伸足夠的時(shí)間量或足夠 數(shù)目的循環(huán)以產(chǎn)生可檢測(cè)量的擴(kuò)增子。
如上文所討論那樣，可擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)耙核酸，或者可擴(kuò)增單個(gè)耙核酸中 的一個(gè)或多個(gè)耙位置。由于基本上對(duì)具有可區(qū)別質(zhì)量的序列段的不同5，-部分的 數(shù)目沒(méi)有限制，所以方法特別適合于多重?cái)U(kuò)增測(cè)定。 一個(gè)或多個(gè)用于擴(kuò)增靶核 酸或耙核酸中特異位置的多核苷酸可具有不同的帶有唯一可識(shí)別質(zhì)量序列段的 5'-部分。用作引物對(duì)的多核苷酸對(duì)可具有帶有相同質(zhì)量的序列段的5'-部分。在
25具體的實(shí)施方案中，序列段共有相同的序列。多重?cái)U(kuò)增測(cè)定可并行確定至少5、 10、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100個(gè)頗多個(gè)不同革巴核酸鄉(xiāng)巴核 酸中的位置的存在(或不存在)，如同所需的那樣。
本發(fā)明的擴(kuò)增以及多核苷酸延伸反應(yīng)采用生物催化單位(如聚合酶)，其包 括齡核糖核苷I^A待延伸核勝連的酶活性(如，"核糖-PCR"、"核糖-擴(kuò)增"或'核 糖-延伸(ribo-extension)")。示例性的具有核糖核苷酸整合活性的生物催化單 位包括G46E CS6R DNA聚合酶以及KB17 DNA聚合酶，其可從Roche Molecular System獲得，并描述于，例如Mauger等^wcfe/c爿c/A 仏warc/2(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c她尺e犯arc/2 (2006)34(3):el8。 可用的其它生物催化組分在上文以及此 行了討論。也可參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5，939，292。
ii.擴(kuò)增子產(chǎn)生
耙核苷,歹啲擴(kuò)增將產(chǎn)生雙鏈的擴(kuò)增子，其中互補(bǔ)于多核苷酸5'-部分的 擴(kuò)增《將包括含有一個(gè)或多個(gè)序列段的3'-部分，其中序列段的3'-^核苷酸 M^含有^的核糖核苷單磷酸(rNMP)。
c.切割jf增子
可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任意方法切割擴(kuò)增子的序列段。在根據(jù)本發(fā)明的ttit 實(shí)施方案中，通過(guò)使擴(kuò)增子經(jīng)受堿(即堿性溶液)，在整合的NMP3，的鍵切割 擴(kuò)增子。擴(kuò)增子tt^暴露于堿性溶液以被切割，特別地是暴露足以實(shí)現(xiàn)切害蝤 合的NMP3'的鍵的時(shí)間段和溫度。通常，溫度越高，堿處理所需的時(shí)間,短。 例如，切割或片段化步驟可在7(TC施行約1.5小時(shí)，或在約55。C施行約8小時(shí) (即過(guò)夜)。堿鵬纟鵬可以低至冷凍、鵬(如4"C)以及高至鄰近沸點(diǎn)纟鵬(如 約95。C)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，堿性溶液可以是pH大于約8.5的任意溶液， 例如，pH至少是約9.0、 9.5、 10.0、 10.5、 11.0、 11.5、 12.0、 12.5、 13.0頓高。 在一些實(shí)施方案中，堿性溶液將包含至少約0.2M、 0.3M、 0.5M、 0.8M、 1.0M 或更多的堿性化合物。
堿性溶液將通常含有至少一種強(qiáng)堿。在一些實(shí)施方案中，可采用弱堿，例 如，如果以較高濃度包含在堿性溶液中的話。通常，堿性溶液將包含至少一個(gè) 具有約5.0或更小pKb的堿性化合物，例如，約4.5、 4.0、 3.5、 3.0、 2.5、 2.0、 1.5、 1.0、 0.5或更小的pKb。示例性的用于在M的NMP3'的鍵片段化擴(kuò)增子的堿性化合物包括，例如NaOH、 KOH、 RbOH以及NH4OH， tfci^NaOH、 KOH 或NH4OH。其它的自堿性化合物也可^ffl。參見(jiàn)例如Mauger等Wwcfe/"d^/ i^earc/z(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c/A Ae犯arc/z (2007)34(3):el8的
堿鵬呈序。
d.檢測(cè)擴(kuò)增子片段
可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增子片段或切割且釋放的序列段。 在 的實(shí)施方案中，通過(guò)質(zhì)量鑒定來(lái)檢觀徹割的片段。序列段也可在切割之 前或之后例如用熒光團(tuán)或放射性同位素進(jìn)行可1^測(cè)地標(biāo)記?？稍?'-末端或3'-末端或在從頭到尾的任意的核苷酸 標(biāo)記片段。示例性的檢測(cè)方法包括但不
限于質(zhì)譜分析法、電泳分離、時(shí)間分辨熒光檢測(cè)、自旋共振檢測(cè)以及帶有之
后的檢測(cè)的與固相(如陣列)雜交。
在 的實(shí)施方案中，采用質(zhì)譜分析法檢測(cè)從擴(kuò)增子釋放的切害啲序列段。
質(zhì)譜分析法方法是本領(lǐng)域所熟知的。任何質(zhì)譜分析法技術(shù)均可應(yīng)用，包括例如
激光解吸電離質(zhì)譜分析法(如基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析法(MALDI)， 以及表面增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì)譜分析法SELDI)、氣相離子光譜測(cè)定法、氣相層 析質(zhì)譜分析法、串聯(lián)質(zhì)譜分析法以及其他質(zhì)譜分析法技術(shù)。質(zhì)譜分析法方法是 本領(lǐng)域所熟知的，并描述于例如Gross^oxs S,/r騰吵:」7MooA:,2006, Springer Verlag; 以 及 Dass斥"6famewtoZy q/" Co"tew/ ora^v Mks1 ^ec加膨吵,2007,Wiley Interscience。
檢測(cè)的擴(kuò)增子片段可以是AAS補(bǔ)于或擴(kuò)增自多核苷酸5'-部分的擴(kuò)增子的切 割的序列段。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解可切害啲序列段可從擴(kuò)增子長(zhǎng)度從頭至幅產(chǎn)生。 在堿性條件下，緊在已齡核糖核苷酸處3'的HJS行切割。在雌的實(shí)施方案 中，擴(kuò)增子片段可從擴(kuò)增的耙核酸檢測(cè)(如，AAS補(bǔ)于多核苷酸3'-部分的序列 段)。如所需的，可檢測(cè)從多核苷酸的5'-部分和/或3'-部分或其互補(bǔ)體切害啲序 列段。來(lái)自檢測(cè)的擴(kuò)增子片段的信號(hào)產(chǎn)生指示待鑒定耙核酸的,寺征。
4、反應(yīng)混合物
本發(fā)明也提供了本發(fā)明方法涉及的反應(yīng)混合物?？僧a(chǎn)生上文所描述的任意 反應(yīng)混合物。示例性的反應(yīng)混合物包括，例如 一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸， 其包括包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及設(shè)計(jì)為足夠 互補(bǔ)以與耙核酸退火的3'-部分；包含dNTP的核苷,，其中至少一種M的
27大多數(shù)是核糖核苷酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物催化組分。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含一個(gè)或多個(gè)革巴核,列。本發(fā)明的反應(yīng)混合物還可包含通過(guò)本發(fā)明方法所生產(chǎn)的擴(kuò)增子，所述的擴(kuò)增子包含具有互補(bǔ)于本發(fā)明多核苷酸5'-部分的序列段的3'-部分，其中每個(gè)序列段的3'-末端核苷酸 是核苷一磷酸(NMP)。本發(fā)明的反應(yīng)混合物ttit包含含有與多核苷酸相同的5'位置的擴(kuò)增子。反應(yīng)混合物中的許多多核苷酸可以作為多核苷酸對(duì)提供，如引物對(duì)，其中每個(gè)多核苷酸對(duì)中的每個(gè)多核苷IM^包含等質(zhì)量的5'位置序列段。反應(yīng)混合物中組分的實(shí)M案在上文以及此處描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含兩個(gè)或更多個(gè)引物對(duì)。在第一引物對(duì)中，引物對(duì)中的每個(gè)弓嫩的5'-部分包含具有第一質(zhì)量的序列段；第二引物對(duì)中齡弓l物的5'-部他含具有第二質(zhì)量的序列段，其可檢測(cè)地不同于第一質(zhì)量-,第三弓,對(duì)中每個(gè)弓卿的5，-部他含具有第三質(zhì)量的序列段，其可檢測(cè)地不同于第一和第二序列段的質(zhì)量；后續(xù)弓卿對(duì)中針弓卿的5'-部他含具有可檢測(cè)地不同于前面所有的或其它弓l物對(duì)的質(zhì)量的序列段。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對(duì)。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括核苷酸集，其包含非常規(guī)或非天然存在的核苷酸鵬或標(biāo)記的核苷酸堿基，如帶有熒光團(tuán)^^鄉(xiāng)性同位素。反應(yīng)混合物也可如需要的那樣包含緩沖組分和鹽。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含堿性組分，如上文所述，例如NaOH或KOH。與此處描述的方法相一致， 一般已將含有高濃度的堿性組分(如約0.1M-0.2M或更高)的反應(yīng)混合物進(jìn)行擴(kuò)增。
進(jìn)一步im地，反應(yīng)混合物包含由本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的擴(kuò)增子以及堿性組分，如本文所描述。5、試劑盒
本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的試劑盒。 一般地，為使用方便，試劑盒進(jìn)行了區(qū)室化并含有提供實(shí)施本發(fā)明方法的組分的容器，例如， 一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核苷酸，其包括包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及設(shè)計(jì)為足夠互補(bǔ)以與耙核酸退火的3'-部分；包含dNTPs的核苷酸集，且其中至少一種減基的大多數(shù)是核糖核昔酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物
催化組分。在^她的實(shí)施方案中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)耙核,列，包括對(duì)照核酸序列(用于陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照)。試劑盒可以提供實(shí)施分離的對(duì)照反應(yīng)的試劑，包括對(duì)照多核苷酸和對(duì)照靶核酸序列。試劑盒中許多多核苷酸可以作為多核苷f(shuō)et如弓l物對(duì)而提供。試劑盒中組分的實(shí)施方案如上文和此處所述。
在4，的實(shí)旅方案中，試劑盒包含兩個(gè)或更多個(gè)引物對(duì)。在第一引物對(duì)中，引物對(duì)中的齡弓胸的5'-部她含具有第一質(zhì)量的序列段；第二引物對(duì)中齡弓卿的5，-部他含具有第二質(zhì)量的序歹暇，其可檢測(cè)地不同于第一質(zhì)量；第三弓嫩對(duì)中齡弓嫩的5'-部分包含具有第三質(zhì)量的序列段，其可檢測(cè)地不同于第一和第二序歹暇的質(zhì)量；后續(xù)弓l物對(duì)中針弓嫩的5'-部他含具有可檢測(cè)地不同于前面所有的或其它引物對(duì)的質(zhì)量的序列段。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對(duì)。
還可以包括一個(gè)或多個(gè)附加的提供附加試齊啲容器。這樣的附加容器可包括被熟練技術(shù)人員識(shí)別的、用于根據(jù)上文所述方法的引物延伸或擴(kuò)增程序的任意試劑或其它成分，包括用于如核酸擴(kuò)增程序(如PCR、 RT-PCR)、 DNA測(cè)序禾，或DNA標(biāo)記程序所用的試劑。在其它的非互斥的變體中，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)提供游離核苷酸(常規(guī)的和/或非常規(guī)的)的容器。在具體的實(shí)歸案中，試劑盒包括a^t代磷酸酯dNTPs、 dUTP、 dTTP禾口/或標(biāo)記的dNTPs諸如，如熒光素-或花,染料家族dNTPs。在其它的非互斥變體中，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)提供適合弓l物延伸反應(yīng)的緩沖液的容器。在 的實(shí)施方案中，試劑盒包含堿性組分，如上文所述，例如NaOH或KOH。
6、 擴(kuò)增子
本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子。PCR擴(kuò)增子，例如，通常皿鏈的并且包含互補(bǔ)于本發(fā)明多核苷酸的鏈。擴(kuò)增^&含互補(bǔ)于本發(fā)明多核苷酸5'-部分的3'序列段，其中所述擴(kuò)增子的3'序列段包含至少一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)序列段，其中所述序列段的3'-末端核苷酸鵬是具有與用于生產(chǎn)擴(kuò)增子的核苷自中的NTP相同的itt的核苷一磷酸(NMP)。
7、 系統(tǒng)
本發(fā)明進(jìn)一步提供了自動(dòng)實(shí)施本發(fā)明方法的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含至少一個(gè)包含組合物的容器或支持物，所述組合物含有本發(fā)明的多核苷酸或擴(kuò)增子或反應(yīng)混合物；配置以在一個(gè)或幾個(gè)溫度與包含所述多核苷酸或擴(kuò)增子的組合物熱交流的熱調(diào)節(jié)器(如核酸熱循環(huán)纟幾器；培養(yǎng)箱)；至少一個(gè)轉(zhuǎn)移試劑至容^l^:
29持物或從容器或支持物轉(zhuǎn)移試劑的試劑轉(zhuǎn)移裝置；以及至少一個(gè)配置以檢測(cè)片段化的序列段質(zhì)量的檢測(cè)器(如質(zhì)譜儀；熒光計(jì))。在雌的實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含至少一個(gè)與熱調(diào)節(jié)器、試劑轉(zhuǎn)移裝置和配置以檢測(cè)質(zhì)量的1^測(cè)器的至少一個(gè)可操作交流的控制器。
實(shí)施例
下面的實(shí)施例提供來(lái)解釋說(shuō)明而不限制本發(fā)明。實(shí)施例1-用于高通量SNP基因型分型的Flag-標(biāo)簽
制備含有人類H19基因中SNP的擴(kuò)增子用于分析。靶序列是gtgagga卿ggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc(SEQ IDNO:ll)(小寫(xiě)字母指示與弓l物退火的序列，'y'指示SNP位置，C或T)。在20^1的總體積中實(shí)施PCR，其中2^1來(lái)源于稀釋至10ng/Ml的基因組DNA樣品。PCR擴(kuò)增含有下述組分50mM A42-羥-l,l-二羥甲基乙基]甘氨酸,pH7.5、 100mMKOAc、 2.75mMMg(OAc)2、以及1.6%的存儲(chǔ)緩沖液，其依次含有50%體積比的甘油、100mM KC1、 O.lmM EDTA、 20mM Tris pH8.0、 ImM DTT以及0.5yoTween20。還包括在PCR內(nèi)的是各0.2mM的5-甲基-dCTP和dGTP、0.4mMdUTP、 0.18mMrATP、 0.02mM dATP以及0.1mM焦磷酸。核苷酸MS混合物含有90%rATP和10%dATP。 PCR擴(kuò)增中應(yīng)用的酶是0.02U/|nl尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)以及20nMGLTDSEDNA聚合酶。參見(jiàn)例如，PCT
發(fā)明者D·H·蓋爾芬德, F·莫杰, I·G·古特, K·A·鮑爾 申請(qǐng)人:法國(guó)國(guó)家基因中心;霍夫曼-拉羅奇有限公司