專利名稱：：一種降解纖維素的曲霉及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一種纖維素降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，是利用微生物的方法降解纖維素，對(duì)于農(nóng)田秸稈腐熟及竹林地稻殼促腐具有較好的應(yīng)用前景。二
背景技術(shù)：
：纖維素是世界上最豐富的可再生資源，但一直沒有得到充分利用。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，但秸稈直接還田后在土壤中分解轉(zhuǎn)化的周期長(zhǎng)，難以作為當(dāng)季作物的肥源。同時(shí)，每年約有30%的剩余作物秸稈不能有效處理和利用，在收割季節(jié)秸稈被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出，污染空氣并危害人們的身體健康。上世紀(jì)90年代以來(lái)，浙江省富陽(yáng)、臨安等竹林地采取稻殼覆蓋早出技術(shù)，生產(chǎn)反季節(jié)竹筍，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。但隨著該技術(shù)使用年限的延長(zhǎng)，也出現(xiàn)了一些問題。長(zhǎng)期使用稻殼覆蓋的竹林地，竹子地下鞭的生長(zhǎng)受到影響，引起爛鞭、爛芽，造成竹林地退化，嚴(yán)重影響竹筍的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此研究農(nóng)田秸稈、竹林地稻殼的人工快速促腐技術(shù)具有重要的意義。使用傳統(tǒng)的物化方法，如酸處理、堿處理以及蒸汽加熱等方法處理秸稈等纖維素，存在反應(yīng)條件劇烈、設(shè)備昂貴、成本較高、帶來(lái)新的環(huán)境污染等問題。而利用投加纖維素高效降解菌的方法經(jīng)濟(jì)、有效，正逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本專利是一株曲霉屬真菌，既可以高效降解秸稈，對(duì)稻殼也有一定降解能力，對(duì)農(nóng)田秸稈腐熟及竹林地稻殼促腐具有較好的應(yīng)用前景。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的降解纖維素的微生物菌劑，使用本菌劑可以在7d內(nèi)降解41.87%的秸稈，31.59%的稻殼，生產(chǎn)和使用成本較低。使用該降解菌劑可以縮短秸稈直接還田后在土壤中被微生物降解的周期，其代謝物可作為作物的肥源。技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供一種纖維素降解菌，其特征在于，該菌株YN1分類命名為曲霉(Aspergillussp.)，2009年11月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3446。用上述的纖維素降解菌生產(chǎn)的纖維素降解菌劑，是通過(guò)以下方法生產(chǎn)而成1〕將權(quán)利要求1所述的菌株YN1接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天，取自PDA平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)2天；PDA平板培養(yǎng)基配制為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，水1000毫升；PDA液體培養(yǎng)基配制為，馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接種入0.5噸種子罐，培養(yǎng)至l億個(gè)/ml，種子罐所用的質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為蛋白胨0.3%，朋4冊(cè)30.2%，酵母粉0.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐溫-800.02%，羧甲基纖維素鈉CMC-Na1%，pH6.0;33)將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的體積10%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4〕在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為0.6-1.2，攪拌速度為160-170轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為28-32°C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體的有效活菌數(shù)達(dá)到1億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有有如下優(yōu)點(diǎn)YN1菌株既可以高效降解秸稈，對(duì)稻殼也有一定降解能力，對(duì)農(nóng)田秸稈腐熟及竹林地稻殼促腐具有較好的應(yīng)用前景。YN1菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，內(nèi)切酶、外切酶、13_糖苷酶、木聚糖酶活及總纖維素酶活性分別為95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。YN1菌株經(jīng)固體發(fā)酵培養(yǎng)，內(nèi)切酶、外切酶、P_糖苷酶、木聚糖酶活和總纖維素酶活性分別為1192.2U/g、100.6U/g、136.9U/g、1118.OU/g禾P210.7U/g。YN1在7d內(nèi)可降解41.87%的秸稈，31.59%的稻殼。發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，操作方便，成本低廉，易于擴(kuò)大化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。本發(fā)明提供一種纖維素降解菌，其菌株YN1分離于采自堆肥的土壤樣品，經(jīng)鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)。主要形態(tài)學(xué)特性為YN1在查氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落平坦并具有輻射狀溝紋，質(zhì)地絲絨狀；菌落呈紫黑色，反面無(wú)色，后呈不同程度的黃色；分生孢子頭為球形至輻射形；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，近頂囊部分帶淡黃褐色，壁平滑；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，分生孢子球形，壁顯著粗糙，具剌。(—)纖維素降解菌YN1的液、固體發(fā)酵酶活測(cè)定液體酶活測(cè)定將YN1接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天，菌餅接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基(同種子罐培養(yǎng)基)中3(TC，160r/min培養(yǎng)5天。發(fā)酵液離心后上清液即為粗酶液，分別以1%(W/V)羧甲基纖維素鈉、1%的微晶纖維素、1%水楊苷、1%木聚糖及50!^濾紙為底物，測(cè)定纖維素內(nèi)切酶、外切酶、P-糖苷酶、木聚糖酶和總纖維素酶活性。用擰檬酸緩沖液稀釋酶液，于5(TC下反應(yīng)30min(測(cè)木聚糖酶活反應(yīng)10min，總纖維素酶活反應(yīng)lh)，加3mL的3，5-二硝基水楊酸(DNS)，煮沸5min，紫外分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并計(jì)算酶活。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，以lmL液體發(fā)酵液(或lg固體發(fā)酵物)lmin內(nèi)催化產(chǎn)生1yg葡萄糖量所需要的還原能力作為1個(gè)酶活力單位(U)。固體酶活測(cè)定將YN1接種于PDA斜面上培養(yǎng)3-5天；用3ml無(wú)菌水清洗斜面曲霉孢子接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基(秸稈50g，KH2P040.05g，MgS047H200.025g，(NH4)2S04lg，蒸餾水lOOmL)中3(TC靜置培養(yǎng)7天，取發(fā)酵培養(yǎng)物20g加蒸餾水100ml，4(TC恒溫水浴浸提lh，其間每15min攪拌一次，過(guò)濾即得粗酶液。立即按DNS法(同液體酶活測(cè)定)測(cè)定還原糖含量，并計(jì)算酶活。結(jié)果見表1，液體培養(yǎng)條件下，5種酶活均在第3天達(dá)到最大值，內(nèi)切酶、外切酶、P-糖苷酶、木聚糖酶活及總纖維素酶依次為95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。在固體培養(yǎng)條件下，5種酶活在第5天達(dá)到最大值，依次為1192.2U/g、跳6U/g、136.9U/g、1118.0U/g和210.7U/g。表1:菌株YN1液、固體發(fā)酵酶活測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(二)纖維素降解菌YN1降解天然纖維素的失重測(cè)定將秸稈、稻殼在105t:下烘至恒重。分別以烘干的lg秸稈、稻殼、濾紙為唯一碳源配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接入降解菌YN1，30°C，160r/min搖培7天，將發(fā)酵液過(guò)濾并將殘留纖維素烘干稱重，用減重法計(jì)算失重率。結(jié)果見表2，通過(guò)減重法測(cè)得YN1在7d內(nèi)對(duì)秸稈的降解率為41.78%，相同條件下對(duì)稻殼的降解率為31.59%，該試驗(yàn)結(jié)果表明YN1對(duì)秸稈和稻殼具有較強(qiáng)的分解能力。表2纖維素降解菌YN1對(duì)秸稈、稻殼及濾紙失重測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1〕將菌株YN1接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3_5天，取自PDA平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)2天；PDA平板培養(yǎng)基配制為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，水1000毫升；PDA液體培養(yǎng)基配制馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接種入0.5噸種子罐，培養(yǎng)至l億個(gè)/ml，種子罐所用的質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為蛋白胨0.3%，朋4冊(cè)30.2%，酵母粉0.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐溫-800.02%，羧甲基纖維素鈉CMC-Na1%，pH6.0;3)將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的體積10%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4〕在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為0.6-1.2，攪拌速度為160-170轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為28-32°C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體的有效活菌數(shù)達(dá)到1億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型'權(quán)利要求一種纖維素降解菌，其特征在于，該菌株YN1分類命名為曲霉(Aspergillussp.)，2009年11月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3446。2.—種用權(quán)利要求1所述的纖維素降解菌生產(chǎn)的纖維素降解菌劑，是通過(guò)以下方法生產(chǎn)而成1〕將權(quán)利要求1所述的菌株YN1接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天，取自PDA平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)2天。PDA平板培養(yǎng)基配制為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，水1000毫升；PDA液體培養(yǎng)基配制馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接種入0.5噸種子罐，培養(yǎng)至1億個(gè)/ml，種子罐所用的質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為蛋白胨O.3%，NH4N030.2%，酵母粉O.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐溫-800.02%，羧甲基纖維素鈉CMC-Na1%，pH6.0;3)將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的體積10%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4〕在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為0.6-1.2，攪拌速度為160-170轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為28-32°C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體的有效活菌數(shù)達(dá)到1億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。全文摘要本發(fā)明提供一種纖維素降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，YN1菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)基、生產(chǎn)罐培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后菌體的有效活菌數(shù)達(dá)到1億個(gè)/ml以上。YN1菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，內(nèi)切酶、外切酶、β-糖苷酶、木聚糖酶活及總纖維素酶活性分別為95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。YN1菌株經(jīng)固體發(fā)酵培養(yǎng)，內(nèi)切酶、外切酶、β-糖苷酶、木聚糖酶活和總纖維素酶活性分別為1192.2U/g、100.6U/g、136.9U/g、1118.0U/g和210.7U/g。YN1在7d內(nèi)可降解41.87％的秸稈，31.59％的稻殼。文檔編號(hào)C12N1/14GK101724570SQ20091023252公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月7日優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日發(fā)明者朱建春,李順鵬,范寧杰,趙方圓,黃星申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)被以下專利引用(1),