用于增強纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法和用于從纖維素材料產(chǎn)生物質(zhì)的方法。NRRLB-3087820050920【專利說明】用于增強纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法[0001]本發(fā)明是基于申請日為2006年9月29日，申請?zhí)枮?200680044575.7"（國際申請?zhí)枮镻CT/US2006/038556)，發(fā)明名稱為"用于增強纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法"的專利申請的分案申請。[0002]對于在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下所進行發(fā)明的權(quán)利聲明[0003]本發(fā)明依據(jù)能源部（DepartmentofEnergy)授予的基本合同（PrimeContract)DE-AC36-98G010337、NREL轉(zhuǎn)包合同（Subcontract)No.ZC0-30017-02在政府支持下完成。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。[0004]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域[0005]本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法和用于從纖維素材料生產(chǎn)物質(zhì)的方法。[0006]相關(guān)領(lǐng)域描述[0007]纖維素是單糖葡萄糖通過β-l，4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開（openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊（attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0008]將纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢：大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的愿望，和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。[0009]改進轉(zhuǎn)化纖維素原料的能力在本領(lǐng)域中將是有利的。[0010]美國公開專利申請序列號2003/0113734公開了鑒定為EGVII的分離的纖維素酶蛋白，和編碼EGVII的核酸。[0011]本發(fā)明的目的是提供具有增強纖維素分解的活性（celluolyticenhancingactivity)的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列以改進纖維素原料的轉(zhuǎn)化。[0012]發(fā)明簡述[0013]本發(fā)明涉及：[0014]1.用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括：在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：[0015](a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0016](b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或（ii)的互補鏈；[0017](C)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0018]⑷變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0019]2.項1的方法，其中所述纖維素材料選自下組：草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。[0020]3.項1或2的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組：纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。[0021]4.項1-3中任一項的方法，還包括用有效量的選自下組的一種或多種酶處理所述纖維素材料：半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。[0022]5.項1-4中任一項的方法，其中所述方法是預(yù)處理方法，是同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中的步驟，或是混合水解和發(fā)酵方法（HHF)中的步驟。[0023]6.項1-5中任一項的方法，還包括回收降解的纖維素材料。[0024]7.項6的方法，其中所述降解的纖維素材料是糖。[0025]8.項1-7中任一項的方法，其中所述纖維素分解蛋白和/或具有增強纖維素分解的活性的多肽以含有或不含細胞的發(fā)酵液的形式存在。[0026]9.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含的氨基酸序列與SEQIDΝ0:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一'丨生，甚至更優(yōu)選至少85%同一'丨生，甚至更優(yōu)選至少90%同一'丨生，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。[0027]10.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含SEQIDNO:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段，或者由SEQIDN0:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段組成。[0028]11.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈。[0029]12.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽是變體，所述變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0030]13.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在大腸桿菌NRRLB-30878中含有的質(zhì)粒pTr3337中。[0031]14.項1或11的方法，其中所述SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0032]15.項1、9、10和12中任一項的方法，其中所述SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。[0033]16.項1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。[0034]17.用于生產(chǎn)物質(zhì)的方法，其包括：[0035](A)在有效量具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白將纖維素材料糖化，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：[0036]⑴多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0037](ii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：(a)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（b)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（c)(a)或（b)的互補鏈；[0038](iii)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0039](iv)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；[0040](B)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟（a)中糖化的纖維素材料；和[0041](C)從發(fā)酵回收所述物質(zhì)。[0042]18.項17的方法，其中所述纖維素材料選自下組：草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。[0043]19.項17或18的方法，其中所述一種或多種纖維素分解蛋白選自下組：纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[0044]20.項17-19中任一項的方法，還包括用有效量的選自下組的一種或多種酶來處理纖維素材料：半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。[0045]21.項17-20中任一項的方法，其中以同時糖化和發(fā)酵同時進行步驟（a)和（b)。[0046]22.項17-21中任一項的方法，其中所述物質(zhì)是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。[0047]23.項17-22中任一項的方法，其中所述纖維素分解蛋白和/或具有增強纖維素分解的活性的多肽以含有或不含細胞的發(fā)酵液的形式存在。[0048]24.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。[0049]25.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含SEQIDNO:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段，或者由SEQIDN0:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段組成。[0050]26.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈。[0051]27.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽是變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0052]28.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在大腸桿菌NRRLB-30878中含有的質(zhì)粒pTr3337中。[0053]29.項17或26的方法，其中所述SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0054]30.項17、24、25和27中任一項的方法，其中所述SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。[0055]31.項17的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含[ILMV]-P_x(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。[0056]32.洗滌劑組合物，其包含具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述多肽選自下組：[0057](a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0058](b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列；（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或（ii)的互補鏈；[0059](c)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0060](d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0061]33.項32的洗滌劑組合物，其中所述多肽包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。[0062]34.項32的洗滌劑組合物，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含SEQIDN0:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段，或者由SEQIDN0:2或其成熟多肽或它們具有增強纖維素分解的活性的片段組成。[0063]35.項32的洗滌劑組合物，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈。[0064]36.項32的洗滌劑組合物，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽是變體，所述變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0065]37.項32的洗滌劑組合物，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在大腸桿菌NRRLB-30878中含有的質(zhì)粒pTr3337中。[0066]38.項32或35的洗滌劑組合物，其中所述SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0067]39.項32、33、34和36中任一項的洗滌劑組合物，其中所述SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。[0068]40.項32的洗滌劑組合物，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。[0069]本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括：在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：[0070](a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；[0071](b)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0072](C)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈；和[0073](d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0074]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生物質(zhì)的方法，包括：[0075](A)在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白將纖維素材料糖化，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：[0076](i)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0077](ii)多肽，其包含與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0078](iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與以下雜交：(a)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（b)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（c)(a)或（b)的互補鏈；和[0079](iv)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；[0080](B)用一種或多種發(fā)酵微生物來發(fā)酵步驟（a)的糖化纖維素材料；和[0081](C)從所述發(fā)酵回收物質(zhì)。[0082]在優(yōu)選的方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。在另一個優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0083]本發(fā)明還涉及洗滌劑組合物，其包含這些具有增強纖維素分解的活性的多肽。[0084]附圖簡述[0085]圖1顯示里氏木霉（Trichodermareesei)RutC30(ATCC56765)GH61B多肽的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列（分別為SEQIDN0s:l和2)，所述多肽具有增強纖維素分解的活性。預(yù)測的內(nèi)含子以斜體表示。預(yù)測的信號肽以下劃線表示。[0086]圖2顯示pTr3337的限制圖譜。[0087]圖3顯示pTr6IB的限制圖譜。[0088]圖4顯示用補充或未補充里氏木霉GH61B的表達米曲霉（Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶（CLF)的里氏木霉培養(yǎng)液來水解PCS(P020502CS，100MF高壓滅菌的，10g/L)。水解在50°C、pH5.0進行指定的時間。CelluclastPlus的加樣量是2.5或3.125mg每克PCS，并且所述混合物含有2.5mgCLF和0.625mgGH61B每克PCS。[0089]圖5顯示用補充有GH61B蛋白的CelluclastPlus水解PCS(P020502CS，100MF高壓滅菌的，l〇g/L)。添加不含重組蛋白（Jal250)的米曲霉培養(yǎng)液作為對照。在50°C溫育115小時。[0090]定義[0091]增強纖維素分解的活性：術(shù)語"增強纖維素分解的活性"在本文定義為使具有纖維素分解活性的蛋白增強對纖維素材料的水解的生物活性。就本發(fā)明而言，通過在以下條件測量來自纖維素材料通過纖維素分解蛋白的水解的還原糖增加來測定增強纖維素分解的活性：5.Omg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，在50°C持續(xù)5-7天，在存在或缺失0.01-2.5mg增強纖維素分解的活性/gPCS中的纖維素的條件下，與使用相等總蛋白加樣量的不含增強纖維素分解的活性的對照水解比較（5.01-7.5mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素）。在優(yōu)選的方面，在纖維素酶蛋白加樣量為3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生）或3%的煙曲霉（Aspergillusfumigatus)0-葡糖苷酶（根據(jù)WO02/095014的實施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生）的存在下，使用Celluclast?I.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。[0092]具有增強纖維素分解的活性的多肽具有SEQIDN0:2的成熟多肽的多肽的增強纖維素分解的活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少100%。[0093]纖維素分解活性：術(shù)語"纖維素分解活性"在本文定義為水解纖維素材料的生物活性。就本發(fā)明而言，通過在以下條件下測量纖維素分解混合物對纖維素材料的水解相對于不添加纖維素分解蛋白的對照水解的增加來測定纖維素分解活性=I-IOmg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，在50°C持續(xù)5-7天。在優(yōu)選的方面，將存在纖維素酶蛋白加樣量為3%米曲霉β-葡糖苷酶（根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生）或3%煙曲霉β-葡糖苷酶（根據(jù)WO02/095014的實施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生）的Celluclast?1.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd，Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。[0094]預(yù)處理的玉米秸桿：術(shù)語"PCS"或"預(yù)處理的玉米秸桿"在本文定義為通過用熱和稀酸處理的源自玉米秸桿的纖維素材料。就本發(fā)明而言，PCS由實施例1中描述的方法或該方法在時間、溫度和酸量上有變化的方法制造。[0095]家族61糖苷水解酶：術(shù)語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"在本文定義為根據(jù)HenrissatB·，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多膚。目前，Henrissat將GH61家族列為未分類，說明就屬于此家族的多肽而言，諸如機制、催化親核體/基體、催化質(zhì)子供體和3-D結(jié)構(gòu)等性質(zhì)是未知的。[0096]纖維素材料：纖維素材料可以是含有纖維素的任何材料。纖維素通常存在于例如植物的莖、葉、外殼（hull)、外殼（husk)和穗軸（cob)中，或樹的葉、枝和木材中。纖維素材料還可以是但不限于草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。在本文中可理解的是纖維素可以是木質(zhì)纖維素的形式，木質(zhì)纖維素為在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。[0097]在優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是稻草（ricestraw)。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是造紙和紙漿加工廢料。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木本或草本植物。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是蔗渣。[0098]可以按原樣使用纖維素材料或可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法將纖維素材料進行預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理技術(shù)可包括多種類型的磨制、照射、蒸煮/蒸汽爆炸和水熱分解（hydrothermolysis);化學(xué)預(yù)處理技術(shù)可包括稀酸、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳和pH控制的水熱分解；而生物預(yù)處理技術(shù)可包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物（參見，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,inHandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis，Washington，DC，179-212;Ghosh，P.，andSingh，A.，1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.AppLMicrobiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,inEnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,HimmeljM.E.,Baker,J.0.,andOverendjR.P.,eds.,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,chapter15；Gong,C.S.,CaojN.J.,DujJ.,andTsaojG.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,inAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.，ed.，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207-241;01sson，L，andHahn-HagerdaljB.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；andVallander，L，andEriksson,K.-E.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0099]分離的多肽：術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽。[0100]基本上純的多肽：術(shù)語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多I%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的（associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。[0101]具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"基本上（essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上（essentially)不含與其天然結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。[0102]在本文中，術(shù)語"基本上純的多肽"與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。[0103]成熟多肽：術(shù)語"成熟多肽"在本文中定義為具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截斷、糖基化等。[0104]成熟多肽編碼序列：術(shù)語"成熟多肽編碼序列"在本文中定義為編碼成熟多肽的核苷酸序列，所述成熟多肽具有增強纖維素分解的活性。[0105]同一性：參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。[0106]就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一'丨生程度使用EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（NeedlemanandWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來測定，使用缺口開啟罰分（gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分（gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62矩陣。使用Needle標記的"最長同一性"的輸出作為百分比同一性并且如下計算：[0107](同一的殘基X100V(比對的長度-比對中的缺口數(shù)）[0108]就本發(fā)明而言,兩個核苷酸序列之間的同一'丨生程度使用EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（NeedlemanandWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來測定，使用缺口開啟罰分10,缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL矩陣。使用Needle標記的"最長同一性"的輸出作為百分比同一性并且如下計算：[0109](同一的殘基X100V(比對的長度-比對中的缺口數(shù)）[0110]同源序列：術(shù)語"同源序列"在本文定義為使用blastp(用于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）或tblastn(用于核酸數(shù)據(jù)庫）算法，使用BL0SUM62矩陣、字長（wordsize)3、缺口存在分值(gapexistencecost)11、缺口延伸分值（gapextensioncost)1、無低復(fù)雜性過濾并且使用成熟GH61B蛋白序列作為查詢對象時，E值（或預(yù)期得分（expectancyscore))小于0.001的序列。參見Altschuletal.，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402。[0111]多肽片段：術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有增強纖維素分解的活性。優(yōu)選地，SEQIDN0:2的成熟多肽的片段含有至少200個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少210個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少220個氨基酸殘基。[0112]亞序列：術(shù)語"亞序列（subsequence)"在本文中定義為從SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失一個或多個核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列，其中所述亞序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽片段。優(yōu)選地，SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少630個核苷酸，并且最優(yōu)選至少660個核苷酸。[0113]等位變體（allelicvariant):術(shù)語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的（在編碼的多肽中無變化）或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0114]分離的多核苷酸：術(shù)語"分離的多核苷酸"用于本文中指，如通過瓊脂糖電泳測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多核苷酸。[0115]基本上純的多核苷酸：術(shù)語"基本上純的多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選本文公開的多核苷酸是"基本上（essentially)純的形式"，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結(jié)合的其它多核苷酸材料。在本文中，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。[0116]cDNA:術(shù)語"cDNA"在本文中定義為能夠通過逆轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的（initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。[0117]核酸構(gòu)建體：術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟冢╪ototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達盒"同義。[0118]調(diào)控序列（controlsequence):術(shù)語"調(diào)控序列"在本文定義為包括對編碼多肽的多核苷酸的表達是必需的或有利的所有成分。各調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。[0119]可操作地連接：術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。[0120]編碼序列：當(dāng)用于本文時術(shù)語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可替換的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。[0121]表達：術(shù)語"表達"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0122]表達載體：術(shù)語"表達載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。[0123]宿主細胞：如本文中所使用的術(shù)語"宿主細胞"包括任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)〇[0124]修飾：術(shù)語"修飾"在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾；以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側(cè)鏈的置換。[0125]人工變體：當(dāng)用在本文時，術(shù)語"人工變體"的意思是具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的修飾的核苷酸序列或其同源序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)（humanintervention),通過修飾公開于SEQIDNO:1或其同源序列的核苷酸序列來獲得。[0126]發(fā)明詳述[0127]本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括：在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：[0128](a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；[0129](b)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；[0130](C)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈；和[0131](d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。[0132]本發(fā)明進一步包括回收降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)例如離心、過濾和重力沉降，將纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化的可溶產(chǎn)物與不溶的纖維素材料分離。[0133]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其包括：(A)在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白糖化纖維素材料，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：（i)包含[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；（ii)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；（iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與以下雜交：(a)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（b)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（c)(a)或（b)的互補鏈；和（iv)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDN0:2的成熟多肽；(B)用一種或多種發(fā)酵微生物來發(fā)酵步驟（a)的經(jīng)糖化的纖維素材料；和（C)從所述發(fā)酵回收物質(zhì)。[0134]本文描述的具有增強纖維素分解的活性的多肽和宿主細胞可用于單糖、二糖和多糖的產(chǎn)生中，其作為來自生物質(zhì)的化學(xué)品或發(fā)酵原料用于產(chǎn)生乙醇、塑料、其它產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。具體而言，可以使用多肽和宿主細胞通過部分或完全溶解纖維素或半纖維素來增加加工殘余物（干酒糟、來自釀造的酒糟、甘蔗渣等）的價值。在通過纖維素分解蛋白來推進纖維素材料變?yōu)槠咸烟?、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物或如下所述源自它們的產(chǎn)品的加工中，所述具有增強纖維素分解的活性的多肽可以是含有或不含細胞的粗發(fā)酵液形式或半純化或純化的酶制備物的形式。增強纖維素分解的蛋白可以是單組分制備物，例如家族61蛋白；多組分蛋白制備物，例如多種家族61蛋白；或多組分和單組分蛋白制備物的組合。增強纖維素分解的蛋白可以在酸性、中性或堿性pH范圍內(nèi)提高纖維素分解蛋白的活性?；蛘撸谑褂蒙镔|(zhì)的發(fā)酵方法中可以使用宿主細胞作為這種多肽的來源。所述宿主細胞也可以含有編碼纖維素分解蛋白以及在生物質(zhì)加工中有用的其它酶的天然或異源基因。[0135]生物質(zhì)可包括但不限于木材資源、市政固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物（參見，例如，Wiselogeletal.,1995,inHandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman,editor),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosieretal.,1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,inAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper,managingeditor,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)〇[0136]生物質(zhì)的初級細胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的多糖是半纖維素，而第三是果膠。在細胞停止生長之后產(chǎn)生的次級細胞壁也含有多糖，并且其通過與半纖維素共價交聯(lián)的聚合木質(zhì)素來強化。纖維素是無水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性的β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如帶有一系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。盡管通常是多形態(tài)的，纖維素在植物組織中主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)存在。半纖維素通常與纖維素以及與其它半纖維素通過氫鍵連接，其輔助使細胞壁基質(zhì)穩(wěn)定。[0137]具有增強纖維素分解的活性的多肽及其多核苷酸[0138]在第一個方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽包含以下基序：[0139][ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，[0140]其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。[0141]在第二個方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽具有的氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽（S卩，成熟多肽）具有至少75%同一性程度，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%同一性程度，所述多肽具有增強纖維素分解的活性（下文中的"同源多肽"）。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。[0142]本發(fā)明具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至249,或其等位變體；或它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至249。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDN0:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDN0:2組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至249或其等位變體組成；或由它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至249組成。[0143]在第三個方面，本發(fā)明涉及具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，（iii)(i)或（ii)的亞序列，或（iv)(i)、（ii)或（iii)的互補鏈（J.Sambrook，Ε·F.Fritsch，andΤ·Maniatus，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)〇SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個鄰接的核苷酸或優(yōu)選至少200個鄰接的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0144]SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可以用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35,并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應(yīng)的基因（例如，用3午、％、355、生物素或抗生物素蛋白（&"虹11)標記）。將這些探針包含于本發(fā)明中。[0145]因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)來分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素（nitrocellulose)或其它合適的載體材料上并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，優(yōu)選將所述載體材料用在Sounthern印跡中。[0146]就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1所示的成熟多肽編碼序列、包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列、它的互補鏈或其亞序列?？墒褂美鏧射線片（X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。[0147]在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸73至1259。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:1。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是質(zhì)粒pTr3337中包含的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是質(zhì)粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。[0148]對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺，對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺，或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。[0149]對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在45°C(非常低嚴緊性），更優(yōu)選至少在50°C(低嚴緊性），更優(yōu)選至少在55°C(中嚴緊性），更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴緊性），甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴緊性），并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴緊性）將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0150]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比米用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法（1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的Im低大約5°C至大約10°C，在0·9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,lXDenhardt's溶液，ImM焦憐酸鈉（sodiumpyrophosphate)，ImM憐酸二氫鈉（sodiummonobasicphosphate)，0·ImMATP和0·2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗漆最佳12至24小時。[0151]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的T1Jg5°C至KTC的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。[0152]在第四個方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽可以是人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列；或它們的成熟多肽。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的（ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸序列（polyhistidinetract)、抗原表位（antigenicepitope)或結(jié)合域（bindingdomain))〇[0153]保守取代的實例是在以下組之內(nèi)：堿性氨基酸組（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）、酸性氨基酸組（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸組（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸組（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）、芳族氨基酸組（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸組（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸）。通常不改變比活性（specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.NeurathandR.L.Hill,1979,In,TheProteins,AcademicPress,NewYork描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly〇[0154]除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸（例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸）可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸（pipecolicacid)、噻唑燒羧酸（thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫腦氨酸、3_和4_甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。[0155]可供選擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變最適pH等。[0156]能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法（CunninghamandWells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，增強纖維素分解的活性）以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hiltonetal·，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)：如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVosetal.，1992,Science255:306-312;Smithetal.，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaveretal.，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。[0157]能夠使用已知的誘變、重組和/或改組（shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988,Science241:53-57;BowieandSauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;W095/17413;或TO95/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示（例如，Lowmanetal.，1991，Biochem.30:10832-10837;美國專利No.5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變（Derbyshireetal.，1986,Gene46:145;Neretal·，1988,DNA7:127)。[0158]誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性（Nessetal·，1999,NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域的標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。[0159]SEQIDN0:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9,更優(yōu)選8,更優(yōu)選7,更優(yōu)選至多6,更優(yōu)選5,更優(yōu)選4,甚至更優(yōu)選3,最優(yōu)選2,并且甚至最優(yōu)選1〇[0160]本發(fā)明的具有增強纖維素分解的活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"的意思應(yīng)為核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。[0161]本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，例如具有增強纖維素分解的活性的芽孢桿菌屬（Bacillus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、腸球菌屬（Enterococcus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、梭菌屬（Clostridium)、土芽抱桿菌屬（Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus)多肽；或者可以是革蘭氏陰性細菌多肽，例如具有增強纖維素分解的活性的大腸桿菌、假單胞菌屬（Pseudomonas)、沙門氏菌屬（Salmonella)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)、螺桿菌屬（Helicobacter)、黃桿菌屬（Flavobacterium)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或尿枝原體屬（Ureaplasma)多肽。[0162]在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有增強纖維素分解的活性的嗜堿芽孢桿菌(BacillusalkalophiIus)、解淀粉芽抱桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌（Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacilluscoagulans)、堅強芽抱桿菌（Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌（Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌（Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌（Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis)多肽。[0163]在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有增強纖維素分解的活性的似馬鏈球菌（Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌（Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌（Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種（Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。[0164]在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有增強纖維素分解的活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌（Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)多月太。[0165]具有增強纖維素分解的活性的多肽還可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選是酵母多肽例如具有增強纖維素分解的活性的念珠菌屬（Candida)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬（Yairowia)多肽；或更優(yōu)選是絲狀真菌多肽例如具有增強纖維素分解的活性的枝頂孢霉屬（Acremonium)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、隱球菌屬（Cryptococcus)、Filibasidium、嫌抱屬（Fusarium)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、梨孢菌屬（Magnaporthe)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉屬（Penicillium)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬（Talaromyces)、熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼屬（Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬（Trichoderma)多膚。[0166]在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有增強纖維素分解的活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母（Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母（Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母（Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母（Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。[0167]在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有增強纖維素分解的活性的棘孢曲霉（Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、煙曲霉、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲霉、灰蓋鬼傘（Coprinuscinereus)、棉色二抱（Diplodiagossyppina)、桿抱狀嫌抱（Fusariumbactridioides)、禾谷嫌抱（Fusariumcerealis)、庫威嫌抱（Fusariumcrookwellense)、大刀嫌抱（Fusariumculmorum)、禾本科嫌抱（Fusariumgraminearum)、禾赤嫌抱（Fusariumgraminum)、異抱嫌抱（Fusariumheterosporum)、合歡木嫌抱（Fusariumnegundi)、尖嫌抱（Fusariumoxysporum)、多枝嫌抱（Fusariumreticulatum)、粉紅嫌抱（Fusariumroseum)、接骨木嫌抱（Fusariumsambucinum)、膚色嫌抱（Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱嫌抱（Fusariumsporotrichioides)、硫色嫌抱（Fusariumsulphureum)、圓嫌抱（Fusariumtorulosum)、擬絲抱嫌抱（Fusariumtrichothecioides)、壤片嫌抱（Fusariumvenenatum)、特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉（Humicolalanuginosa)、灰梨抱菌（Magnaporthegrisea)、米赫毛霉（Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌（Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉（Penicilliumpurpurogenum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、淡黑假黑盤菌（Pseudoplectanianigrella)、禮色嗜熱子囊菌（Thermoascusaurantiacus)、土生梭抱霉（Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉（Trichodermakoningii)、長枝木霉（TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、綠色木霉（Trichodermaviride)或Trichophaeasaccata多月太。[0168]在更優(yōu)選的方面，所述多肽是里氏木霉多肽。在最優(yōu)選的方面，所述多肽是里氏木霉RutC30(ATCC56765)多肽，例如，具有SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段（例如，成熟多肽）的多肽。[0169]可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段（perfectandimperfectstates)兩種，和其它分類學(xué)的等同物（equivalent),例如無性型（anamorph),無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。[0170]這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心（theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心（DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心（CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心，北方區(qū)研究中心（AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)〇[0171]此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水等）分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境（habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)來分離或克隆所述多核苷酸（參見，例如，Sambrooketal.，1989，見上文）。[0172]具有增強纖維素分解的活性的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另一種多肽融合到所述多肽或其具有增強纖維素分解的活性的片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序列（或其部分）融合于具有增強纖維素分解的活性的多肽的編碼核苷酸序列（或其部分）來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。[0173]多核苷酸具有核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽，可分離所述多核苷酸并且用于實施本發(fā)明的方法，如本文所述。[0174]在優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列示于SEQIDNO:1。在另一個更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是質(zhì)粒pTr3337中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。在另一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。在另一個更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是質(zhì)粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。本發(fā)明還包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有增強纖維素分解的活性的SEQIDNO:2的片段。[0175]本發(fā)明還涉及在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。[0176]用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innisetal·，1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(yīng)（LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄（ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序列的擴增（NASBA)?？梢詮哪久箤俚木?，或從其它或相關(guān)的生物克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體（speciesvariant)。[0177]在本發(fā)明的方法中，所述多核苷酸具有下述核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列（S卩，核苷酸388至1332)具有至少75%的同一性程度，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%同一性，其編碼活性多肽。[0178]修飾編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列：所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ordetal.，1991，ProteinExpressionandPurification2:95-107。[0179]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法（參見，例如，CunninghamandWells，1989,Science244:1081-1085)來鑒定。在后一的技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子增強纖維素分解的活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標記這樣的技術(shù)來測定（參見，例如，deVosetal·，1992,Science255:306-312;Smithetal.,1992,JournalofMolecularBiology224:899-904；fflodaveretal.,1992,FEBSLetters309:59-64)。[0180]所述多核苷酸可以是具有增強纖維素分解的活性的多肽的編碼多核苷酸，其在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件，更優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列（Sambrooketal.，1989,見上文），如本文所定義的。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸77至766。[0181]核酸構(gòu)建體[0182]分離的多核苷酸，其編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽，可以用許多方式操作所述分離的多核苷酸，從而通過構(gòu)建核酸構(gòu)建體來提供多肽的表達，所述核酸構(gòu)建體包含分離的多核苷酸，其編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽并且與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。[0183]調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由宿主細胞識別的核苷酸序列，所述宿主細胞用于表達編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的多核苷酸。啟動子序列含有介導(dǎo)所述多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。[0184]用于指導(dǎo)所述核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子：大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因（amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因（Villa-Kamaroffetal·，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子（DeBoeretal.，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃inScientificAmerican,1980,242:74-94中；和在Sambrooketal.，1989,見上文中有所描述。[0185]用于指導(dǎo)所述核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述酶的基因獲得的啟動子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉（Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W)00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（W)96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子（來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體）；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。[0186]在酵母宿主中，有用的啟動子從下述蛋白的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶（GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶（TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanosetal·，1992,Yeast8:423-488描述。[0187]調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。[0188]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下蛋白的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0189]對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下蛋白的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanosetal.，1992，見上文描述。[0190]調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5'末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。[0191]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下蛋白的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。[0192]對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下蛋白的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶（EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADH2/GAP)。[0193]調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。[0194]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下蛋白的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。[0195]對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由GuoandSherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。[0196]調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5'端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5'端可含有對于所述編碼序列是異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑（即，分泌至培養(yǎng)基中）的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。[0197]對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下蛋白的基因獲得的信號肽編碼區(qū)：芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶（subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由SimonenandPalva，1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。[0198]對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下蛋白的基因獲得的信號肽編碼區(qū)：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。[0199]在優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至19或由SEQIDNO:2的氨基酸1至19組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:1的核苷酸20至76或由SEQIDNO:1的核苷酸20至76組成。[0200]對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanosetal.，1992,見上文，描述。[0201]調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原（proenzyme)或前多肽（propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶（W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。[0202]當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著（nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。[0203]同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤（methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬（withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。[0204]表達載體[0205]可以將本文描述的多種核酸和調(diào)控序列結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，其包含編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。所述表達載體可以包括一種或多種方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼所述多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過將所述核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達的適當(dāng)載體中來表達編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的多核苷酸。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。[0206]重組表達載體可以是任何載體（例如，質(zhì)?；虿《荆淠軌蚍奖愕剡M行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。[0207]載體可以是自主復(fù)制載體，S卩，作為染色體外實體（entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體（minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段（means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整0嫩（1：〇丨310嫩），或可以使用轉(zhuǎn)座子（1：四118口〇8〇11)。[0208]所述載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性（prototrophytoauxotrophs)等。[0209]細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶）、bar(草銨膦（phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、niaD(硝酸還原酶）（nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5'_憐酸脫羧酶）（orotidine_5'-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷醜轉(zhuǎn)移酶）和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶（anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0210]所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。[0211]為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10,〇〇〇堿基對，優(yōu)選400至10,000堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對，其與相應(yīng)的靶序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合到宿主細胞基因組中。[0212]為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子（replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語"復(fù)制起點"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。[0213]細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和PACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點。[0214]用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARS1，ARS4,ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。[0215]在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gemsetal.，1991，Gene98:61-67;Cullenetal.，1987,NucleicAcidsResearch15:9163-9175;TO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于TO00/24883中的方法完成。[0216]可以將多于一個拷貝的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，所述多核苷酸編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得：將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或使所述核酸序列包括可擴增選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑（selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，并且由此得到核酸序列的額外拷貝。[0217]用于連接上述元件以構(gòu)建所述重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrooketal·，1989，見上文）。[0218]宿主細胞[0219]重組宿主細胞，其包含編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的多核苷酸，可將所述重組宿主細胞有利地使用在所述多肽的重組產(chǎn)生中。將包含這種多核苷酸的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體（chromosomalintegrant)或作為前述的自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語"宿主細胞"包含親本細胞的任何子代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。[0220]宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例如，真核生物。[0221]細菌宿主可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或尿枝原體屬。[0222]細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。[0223]在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。[0224]細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種。[0225]在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。[0226]細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌。[0227]在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞。[0228]可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入芽孢桿菌屬細胞：例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如，ChangandCohen，1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)，通過使用感受態(tài)細胞（參見，例如，YoungandSpizizen,1961，JournalofBacteriology81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221),通過電穿孔（參見，例如，ShigekawaandDower,1988,Biotechniques6:742-751)或通過接合（參見，例如，KoehlerandThorne,1987,JournalofBacteriology169:5771-5278)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入大腸桿菌細胞：例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或通過電穿孔（參見，例如，Doweretal·，1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入鏈霉菌屬細胞：例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔（參見，例如，Gongetal.，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)通過接合（參見，例如，Mazodieretal.，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或通過轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見，例如，Burkeetal·，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入假單胞菌屬細胞：例如通過電穿孔（參見，例如，Choietal·，2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或通過接合（參見，例如，PinedoandSmets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入鏈球菌屬細胞：例如通過天然感受態(tài)（參見，例如，PerryandKuramitsu,1981，Infect.Tmmun.32:1295-1297)，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如，CattandJollick,1991，Microbios.68:189-2070)，通過電穿孔（參見，例如，Buckleyetal·，1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或通過接合（參見，例如，Clewell,1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何將DNA引入宿主細胞的已知方法。[0229]宿主細胞還可以是真核細胞，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。[0230]在優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門：子囊菌門（Ascomycota)、擔(dān)子菌門（Basidiomycota)、壺菌門（Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworthetal.,In,AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義）以及卵菌門（Oomycota)(如Hawksworthetal.,1995,見上，171頁中所引用），和所有有絲分裂抱子真菌（mitosporicfungi)(Hawksworthetal.，1995，見上）。[0231]在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子囊酵母（ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目（Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母（basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類（FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,andDavenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。[0232]在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。[0233]在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母（KluyveromycesIactis)細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細胞。[0234]在另外更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門（如由Hawksworthetal.，1995,見上文，所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖（chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖（chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖（budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。[0235]在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬（Bjerkandera)、擬錯菌屬（Ceriporiopsis)、鬼傘屬（Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬（Magnaporthe)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬（Neocallimastix)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬（Phlebia)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、側(cè)耳屬（Pleurotus)、裂裙菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬（Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。[0236]在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另外最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌（Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌（Ceriporiopsisaneirina)、干擬錯菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌（Ceriporiopsissubvermispora)、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌（Phlebiaradiata)、刺療側(cè)耳（Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌（Trametesvillosa)、雜色栓菌（Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。[0237]可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yeltonetal.,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardieretal.,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母：BeckerandGuarentejInAbelsonjJ.N.andSimon,Μ.I.,editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymologyjVolume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Itoetal.，1983,JournalofBacteriology153:163;和Hinnenetal.，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。[0238]產(chǎn)生方法[0239]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有增強纖維素分解的活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選所述細胞是木霉屬的細胞，更優(yōu)選是里氏木霉，并且最優(yōu)選是里氏木霉RutC30。[0240]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有增強纖維素分解的活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞；和（b)回收所述多肽。[0241]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有增強纖維素分解的活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDN0:2的成熟多肽組成的多肽，和（b)回收所述多肽。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至249。[0242]在所述產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵）來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備（例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物（lysate)回收。[0243]使用本文描述的方法來檢測具有增強纖維素分解的活性的多肽。[0244]可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收所得多肽。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。[0245]可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化所述多肽以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析（例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻）、電泳方法（例如，制備型（preparative)等電聚焦）、差示溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE或提?。▍⒁?，例如，ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)〇[0246]纖維素分解蛋白[0247]在本發(fā)明的方法中，纖維素分解蛋白可以是以下加工中涉及的任何蛋白：將纖維素材料加工成為葡萄糖，或?qū)肜w維素加工成為木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，它們的聚合物，或如下所述源自它們的產(chǎn)物。纖維素分解蛋白可以是單成分制備物，例如，纖維素酶；多成分制備物，例如，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶（glucohydrolase)、β_葡糖苷酶，如下文定義；或多成分和單成分蛋白制備物的組合。纖維素分解蛋白可以在酸性、中性或堿性PH范圍內(nèi)具有活性，S卩，水解纖維素。[0248]纖維素分解蛋白可以是真菌或細菌來源的，其可以從已知能夠產(chǎn)生纖維素分解酶的微生物中獲得，或從該微生物中分離和純化，所述微生物例如如下屬的菌種：芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鬼傘屬、梭孢殼屬、鐮孢屬、毀絲霉屬、枝頂孢霉屬、頭孢屬（Cephalosporium)、柱頂孢屬（Scytalidium)、青霉屬或曲霉屬（參見，例如，EP458162)，特別是由選自下組的菌株產(chǎn)生的那些纖維素分解蛋白：特異腐質(zhì)霉（重分類為嗜熱柱頂孢（Scytalidiumthermophilum)，參見例如，美國專利No.4,435,307)、灰蓋鬼傘、尖鐮孢、嗜熱毀絲霉、巨多孔菌（Meripilusgiganteus)、土生梭孢霉、枝頂孢霉屬菌種（Acremoniumsp·)、桃色枝頂抱霉（Acremoniumpersicinum)、枝頂抱枝頂抱霉(Acremoniumacremonium)、Acremoniumbrachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremoniumobclavatum、Acremoniumpinkertoniae、紅灰枝頂抱霉(Acremoniumroseogriseum)、Acremoniumincoloratum和Acremoniumfuratum;優(yōu)選來自特異腐質(zhì)霉05]\11800、尖鐮孢05]\12672、嗜熱毀絲霉085117.65、頭孢屬菌種（(：印1^1〇8口〇1^111118口·）RYM-202、枝頂孢霉屬菌種CBS478.94、枝頂孢霉屬菌種CBS265.95、桃色枝頂孢霉CBS169.65、枝頂抱枝頂抱霉AHU9519、頭抱屬菌種CBS535.71、AcremoniumbrachypeniumCBS866.73、AcremoniumdichromosporumCBS683.73、AcremoniumobclavatumCBS311.74、AcremoniumpinkertoniaeCBS157.70、紅灰枝頂抱霉CBS134.56、AcremoniumincoloratumCBS146.62和AcremoniumfuratumCBS299.70H。纖維素分解蛋白還可以獲得自木霉屬（特別是綠色木霉、里氏木霉和康寧木霉）、嗜堿的芽孢桿菌屬（alkalophilicBacillus)(參見，例如，美國專利No.3,844,890和EP458162)和鏈霉菌屬（參見，例如，EP458162)。也可以使用纖維素分解蛋白的化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。[0249]特別合適的纖維素分解蛋白是堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實例是EP495,257、EP531，372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素變體，例如在WO94/07998、EP531，315、美國專利No.4,435,307、美國專利No.5,457,046、美國專利No.5,648,263、美國專利No.5,686,593、美國專利No.5,691，178、美國專利No.5,763,254、美國專利No.5,776,757、WO89/09259、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。[0250]可以使用本領(lǐng)域已知的方法（參見，例如，1^]11161:1:，]\1.311(1]^1511代，1^(eds·)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)，通過在含有合適的碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵上述微生物菌株來產(chǎn)生本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解蛋白。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備（例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）。適合于生長和產(chǎn)生纖維素分解蛋白的溫度范圍和其它條件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的（參見，例如，Bailey,J.E.，andOllis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)〇[0251]所述發(fā)酵可以是致使纖維素分解蛋白的表達或分離的任何細胞培養(yǎng)方法。因此，可以將發(fā)酵理解為包括在合適的培養(yǎng)基中和允許表達或分離所述纖維素分解蛋白或增強纖維素分解的蛋白的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，或在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵）。[0252]可以通過如本文所述的常規(guī)方法，從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收和純化通過上述方法產(chǎn)生的所得纖維素分解蛋白。[0253]纖維素分解蛋白可能水解或水解羧甲基纖維素（CMC)，由此減少溫育混合物的粘度?？梢酝ㄟ^振動粘度計（vibrationviscosimeter)(例如，MIVI3000來自Sofraser，F(xiàn)rance)來測定所產(chǎn)生的粘度上的降低。纖維素酶活性的測定按照纖維素酶粘度單位（CEVU)來測量，所述測定通過測量樣品降低羧甲基纖維素（CMC)溶液粘度的能力來定量該樣品中存在的催化活性的量。所述測試在適合于纖維素分解蛋白和底物的溫度和PH下進行。對于Celluclast?(NovozymesA/S,BagSV3erd，Denmark)，將測試在40°C在0·IM磷酸鹽pH9.0緩沖液中進行30分鐘，使用CMC作為底物（33.3g/L羧甲基纖維素Hercules7LFD)和大約3.3-4.2CEVU/ml的酶濃度。相對于公開的酶標準品例如CELLUZYME?Standard17-1194(從NovozymesA/S,Bagsvaerd，Denmark獲得）來計算CEVU活性。[0254]適合用于本發(fā)明的纖維素分解制備物的實例包括，例如CELLUCLAST?(可以從NovozymesA/S獲得）和N0V0ZYM?188(可以從NovozymesA/S獲得）?？梢允褂玫钠渌虡I(yè)上能夠獲得的包含纖維素酶的制備物包括CELLUZYME?、CEREFL0?和ULTRAFL0?(NovozymesA/S)，LAMINEX?和SpEZYMEtmCP(GenencorInt.)，和R0HAMENT?70691(尺011丨1161111^)。將纖維素酶以有效量添加，所述有效量是固體的大約0.001%至大約5.0%重量，更優(yōu)選固體的大約0.025%至大約4.0%重量，并且最優(yōu)選固體的大約0.005%至大約2.0%重量。[0255]如上所述，本發(fā)明方法中使用的纖維素分解蛋白或增強纖維素分解的蛋白可以是單成分制備物，即，基本上（essentially)不含其它纖維素分解成分的成分。所述單一成分可以是重組成分，即，通過克隆編碼單一成分的DNA序列，繼而使用所述DNA序列轉(zhuǎn)化細胞并且在宿主中表達來產(chǎn)生的成分（參見，例如，WO91/17243和WO91/17244)。單成分纖維素分解蛋白的其它實例包括但不限于在JP-07203960-A和W0-9206209中公開的那些。所述宿主優(yōu)選是異源宿主（酶對于宿主是異源的），但是在一些條件下宿主也可以是同源宿主（酶對于宿主是固有的）。單成分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵培養(yǎng)液純化這種蛋白來制備。[0256]在實施本發(fā)明的方法中有用的單成分纖維素分解蛋白的實例包括但不限于內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶和β-葡糖苷酶。[0257]術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶"在本文中定義為內(nèi)型-1，4-(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶（endo-l,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.Ν?！?.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物（例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素）、地衣淀粉、混合的β-1，3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4鍵和其它含有纖維素成分的生物材料中1,4-β-D-糖苷鍵的水解。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纖維素（CMC)水解來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0258]外型-1，4-β-D-葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶和葡糖水解酶兩種。就本發(fā)明而言，根據(jù)Himmeletal.，1986,J.Biol.Chem.261:12948-12955描述的方法來測定外切葡聚糖酶活性。[0259]術(shù)語"纖維二糖水解酶"在本文定義為1，4_β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖或任何含有β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原端釋放纖維二糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Leveretal·，1972,Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurghetal·，1982,FEBSLetters149:152-156;vanTilbeurghandClaeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187:283-288描述的方法來測定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，使用Leveretal.方法來評估玉米秸桿中纖維素的水解，同時使用vanTilbeurghetal.的方法來測定對于突光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。[0260]術(shù)語"葡糖水解酶"在本文定義為1，4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶（E.C.3.2.1.74)，其催化1，4-β-D-葡聚糖中1，4-鍵（0-糖基鍵）的水解，從而去除連續(xù)的葡萄糖單位。[0261]術(shù)語"β-葡糖苷酶"在本文定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶（E.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，并且釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturietal·，2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法來測定β-葡糖昔酶活性，但是采用如本文所述的不同的條件。將1單位的β-葡糖苷酶活性定義為在50°C、pH5,從IOOmM檸檬酸鈉、0.01%Tween-20中作為底物的4mM對硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷每分鐘產(chǎn)生1.〇微摩爾對硝基苯酚。[0262]加工纖維素材料[0263]本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料加工成許多有用的物質(zhì)，例如，化學(xué)品和燃料。除乙醇之外，能夠從纖維素產(chǎn)生的某些通用和專用化學(xué)品（commodityandspecialtychemical)包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、賴氨酸、有機酸（例如，朽1檬酸）、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醒、多輕基焼酸酯（polyhydroxyalkanoate)和順，順-粘康酸（cis，cis_muconicacid)(Lynd，L.R·，Wyman，C.E·，andGerngross，T.IL，1999,BiocommodityEngineering,BiotechnoI.Prog.,15:777-793；PhilippidisjG.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington，DC，179-212;和Ryu，D.D.Y.，andMandels，M.，1980,Cellulases!biosynthesisandapplications，Enz.Microb.Technol.，2:91-102)。潛在的共同產(chǎn)生的益處不限于從可發(fā)酵的糖合成多種有機產(chǎn)物。在生物加工之后剩余的富含木質(zhì)素的殘余物能夠轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素衍生的化學(xué)品，或用于發(fā)電。[0264]按照本發(fā)明所述方法用于加工纖維素材料的常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚理解的?？梢允褂迷O(shè)置為按照本發(fā)明來操作的任何常規(guī)生物質(zhì)加工設(shè)備實施本發(fā)明的方法。[0265]這種設(shè)備可以包括間歇攪拌反應(yīng)器（batch-stirredreactor)、帶有超濾的連續(xù)流攬拌反應(yīng)器（continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)、連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器（continuousplug-flowcolumnreactor)(Gusakov,A.V.,andSinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:I.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)Λ碾磨反應(yīng)器(attritionreactor)(Ryu,S.K.,andLee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)或帶有電磁場引起的強力混合的反應(yīng)器（Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.,DavydkinjV.Y.,Protasj0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield，Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)〇[0266]常規(guī)方法包括但不限于糖化、發(fā)酵、分別水解和發(fā)酵（SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時糖化和共發(fā)酵（SSCF)、混合水解和發(fā)酵（HHF)和直接微生物轉(zhuǎn)化（DMC)。[0267]SHF使用分開的處理步驟，首先將纖維素酶水解成葡萄糖，其后將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在SSF中，將纖維素的酶水解和葡萄糖發(fā)酵成乙醇組成在一個步驟中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵（Sheehan，J.，andHimmeljM.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheILS.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF包括兩個分開的步驟，其在相同的反應(yīng)器中，但是在不同的溫度下進行，即高溫酶糖化，其后是在發(fā)酵菌株能夠耐受的低溫下的SSF。DMC將全部三個處理（纖維素酶產(chǎn)生、纖維素水解和發(fā)酵）組合在一個步驟中（Lynd，LR.，Weimer，P.J.，vanZyl，W.H.，andPretorius，I.S.，2002,Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)〇[0268]"發(fā)酵"或"發(fā)酵方法"指任何發(fā)酵方法或任何包括發(fā)酵步驟的方法。發(fā)酵方法包括但不限于用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇）；有機酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸）；酮類（例如，丙酮）；氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）；氣體（例如，甲烷、氫氣（H2)、二氧化碳（CO2)和一氧化碳（CO))。發(fā)酵方法還包括在可消費醇工業(yè)（例如，啤酒和葡萄酒（wine))、乳品工業(yè)（例如，發(fā)酵乳制品）、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的發(fā)酵方法。[0269]具有增強纖維素分解的活性的多肽可以是含有或不含細胞的粗發(fā)酵液形式，或是半純化或純化的酶制備物形式。增強纖維素分解的蛋白可以是單成分制備物，例如，家族61蛋白；多成分蛋白制備物，例如，多種家族61蛋白；或多成分和單成分蛋白制備物的組合。[0270]所述物質(zhì)可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。在優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是醇。應(yīng)該理解術(shù)語"醇"包含含有一個或多個羥基的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S·，Cao,N.J.,DujJ.,andTsaojG.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,inAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.，ed.，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,andJonas，R.，2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；NigamjP.,andSingh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.,QureshijN.andBlaschekjH.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603〇[0271]另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是延胡索酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.,andLee,Y.Υ.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。[0272]在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮。應(yīng)該理解的是術(shù)語"酮"涵蓋含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，QureshiandBlaschek,2003，見上文。[0273]在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所屬氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard,A.，andMargaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。[0274]在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C0。參見，例如，Kataoka,N.，A.Miya,andK.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;和GunaseelanV.N.inBiomassandBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0275]從纖維素材料產(chǎn)生物質(zhì)通常需要四個主要步驟。這四個步驟是預(yù)處理、酶水解、發(fā)酵和回收。下文示例的是用于產(chǎn)生乙醇的方法，但是應(yīng)該理解的是可將類似的方法用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，例如上文所述的物質(zhì)。[0276]預(yù)處理。在預(yù)處理或預(yù)水解步驟中，加熱纖維素材料以破壞木質(zhì)素和糖結(jié)構(gòu)，溶解大部分半纖維素，并且使纖維素級分可接近纖維素分解酶。用蒸汽直接進行加熱，或在漿料中進行加熱，其中還可向材料添加催化劑以加速反應(yīng)。催化劑包括強的酸，例如硫酸和SO2;或堿，例如氫氧化鈉。預(yù)處理步驟的目的是增進酶和微生物的透過性。還可對纖維素生物質(zhì)進行水熱蒸汽爆炸（steamexplosion)預(yù)處理（參見美國專利申請No.20020164730)。[0277]趣化。在也稱為糖化的酶水解步驟中，將如本文所述的酶添加至經(jīng)預(yù)處理的材料以將纖維素級分轉(zhuǎn)化為葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在受控的pH、溫度和混合條件下，在攪拌釜式反應(yīng)器或發(fā)酵罐中進行。糖化步驟可以持續(xù)多至200小時?？梢栽诖蠹s30°C至大約65°C，尤其是在大約50°C的溫度，和大約4至大約5的pH，特別是在大約pH4.5進行糖化。為了產(chǎn)生酵母能夠代謝的葡萄糖，水解通常在β-葡糖苷酶存在下進行。[0278]發(fā)璧。在發(fā)酵步驟中，將作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖通過發(fā)酵微生物例如酵母發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵還可與酶水解在相同容器中，同樣在受控的pH、溫度和混合條件下同時進行。當(dāng)糖化和發(fā)酵在相同的容器中同時進行時，通常將該方法稱為同時糖化和發(fā)酵或SSF。[0279]在實施本發(fā)明時，任何合適的纖維素底物或原料可以用于發(fā)酵方法中。所述底物通常基于期望的發(fā)酵產(chǎn)物來選擇，即，基于將要由發(fā)酵獲得的物質(zhì)來選擇，還基于使用的方法來選擇，如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。適用于本發(fā)明的方法的底物的實例包括含有纖維素的材料，例如木材或植物殘余物；或獲得自經(jīng)加工的纖維素材料的低分子糖DP1-3,其能夠由發(fā)酵微生物代謝；并且所述底物可以通過直接添加至發(fā)酵培養(yǎng)基來提供。[0280]術(shù)語"發(fā)酵培養(yǎng)基"應(yīng)理解為指在添加發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如，糖化處理產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以在同時糖化和發(fā)酵方法（SSF)中使用的培養(yǎng)基。[0281]"發(fā)酵微生物"指適用于期望的發(fā)酵方法中的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明的合適的發(fā)酵微生物能夠發(fā)酵，即，能夠直接或間接地將糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵微生物的實例包括真菌生物，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，尤其是釀酒酵母。商業(yè)上能夠獲得的酵母包括，例如，RedStar?./?/LesaffreEthanolRed(可從RedStar/Lesaffre，USA獲得）FALI(可從BurnsPhilpFoodInc.，USA的分公司Fleischmann'sYeast獲得），SUPERSTART(可從Alltech獲得），GERTSTRAND(可從GertStrandAB，Sweden獲得）和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得）?[0282]在優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母（Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母（Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母（Kluyveromycesfragilis)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是念珠菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶念珠菌（Candidapseudotropicalis)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓苔念珠菌（Candidabrassicae)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棍孢屬（Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棍孢（ClavisporaIusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是仙人掌棍孢（Clavisporaopuntiae)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬（Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母（Pachysolentannophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬（Bretannomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母（Bretannomycesclausenii)(Philippidis，G.P.，1996,Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。[0283]能夠有效地將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括例如運動發(fā)酵單孢菌（Zymomonasmobilis)和熱纖維梭菌（Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，見上文）?[0284]本領(lǐng)域公知的是上述生物還可用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。[0285]釀酒酵母中異源基因的克?。–hen，Z.，Ho,N.W.Y.，1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho,N.W.Y.,Chen,ZjBrainardjA.P.，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859),或細菌中異源基因的克隆，例如大腸桿菌中（Beall，D.S.，Ohta，K.，Ingram，L0·，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli，Biotech.Bioeng.38:296-303)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中(Ingram,L.0.,Gomes,P.F.,LaijX.,MoniruzzamanjM.,Wood,B.E.,YomanojL.P.,York,S.W.,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:2〇4_214)和運動發(fā)酵單抱菌中（Zhang，M.，Eddy,C.,DeandajK.,FinkelsteinjM.,andPicataggiojS.,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243；Deanda,K.,Zhang,M.,Eddy,C.,andPicataggio,S.,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,AppI.Environ.Microbiol.62:4465-4470)異源基因的克隆致使構(gòu)建出能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化成乙醇（共發(fā)酵）的生物。[0286]通常將酵母或其它微生物添加至降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并且將發(fā)酵進行大約24至大約96小時，例如大約35至大約60小時。溫度通常在大約26°C至大約40°C，特別是大約32°C，并且在大約pH3至大約pH6,特別是大約pH4-5。[0287]在優(yōu)選的方面，將酵母或其它微生物應(yīng)用于降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并且將發(fā)酵進行大約24至大約96小時，例如通常為35-60小時。在優(yōu)選的方法，溫度通常是大約26至大約40°C，特別是大約32°C，并且pH通常是大約pH3至大約pH6,優(yōu)選大約pH4-5。優(yōu)選將酵母或其它微生物以大約IO5至1012,優(yōu)選大約IO7至101°,特別是大約5xl07活細胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量應(yīng)用。在產(chǎn)生乙醇的過程中，酵母細胞計數(shù)應(yīng)該優(yōu)選在大約IO7至101(1，特別是大約2xl08。有關(guān)使用酵母發(fā)酵的其它指導(dǎo)可參見例如"TheAlcoholTextbook，'（EditorsK.Jacques,T.P.LyonsandD.R.Kelsall,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，將其并入本文以作參考。[0288]本領(lǐng)域內(nèi)最廣泛使用的方法是同時糖化和發(fā)酵（SSF)方法，其中對于糖化不存在保持階段（holdingstage)，意味著將酵母和酶一同添加。[0289]對于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵之后蒸餾醪以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇、飲用乙醇，即，可飲用中性酒精（potableneutralspirits);或工業(yè)乙醇。[0290]可以將發(fā)酵刺激物（fermentationstimulator)與本文描述的任何酶方法組合使用以進一步改進發(fā)酵方法，特別是改進發(fā)酵微生物的性能，例如，速率提高和乙醇產(chǎn)率。"發(fā)酵刺激物"指對于培養(yǎng)發(fā)酵微生物，特別是酵母的生長的刺激物。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見，例如，Alfenoreetal.,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002),將其通過引用并入本文。礦物的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物和礦物鹽，其包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mr^PCu。[0291]通|。從發(fā)酵的纖維素材料分離醇并且通過常規(guī)蒸餾方法來純化。能夠獲得純度高至大約96體積％的乙醇，其可以用作例如燃料乙醇，飲用乙醇，S卩，可飲用中性酒精；或工業(yè)乙醇。[0292]對于其它物質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于層析（例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻）、電泳方法（例如，制備型等電聚焦）、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE、蒸餾或提取。[0293]在本發(fā)明的方法中，可以向纖維素分解蛋白和增強纖維素分解的多肽補充一種或多種額外的酶活性，以改進纖維素材料的降解。優(yōu)選的額外的酶是半纖維素酶、酯酶（例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶（cutinase))、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或它們的混合。[0294]在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵之前或發(fā)酵期間添加所述額外的酶，包括在發(fā)酵微生物的增殖期間或之后添加所述額外的酶。[0295]本文參照的酶可以源自或獲得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母或哺乳動物來源。術(shù)語"獲得"在本文的意思是已經(jīng)將酶從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物中分離。術(shù)語"獲得"在本文還表示所述酶可在宿主生物中重組產(chǎn)生，其中所述重組產(chǎn)生的酶對于該宿主生物是天然的或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代一個或多個氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或通過本領(lǐng)域已知的核酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的意思中包含天然變體，而外源酶的意思中包含重組獲得的變體，例如通過定位誘變或改組獲得的變體。[0296]酶也可以是純化的。術(shù)語"純化"用于本文中包括不含其它成分的酶，所述其它成分來自酶所來源的生物。術(shù)語"純化"還包括不含來自獲得該酶的天然生物的成分的酶。酶可以是純化的，僅存在少量其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白質(zhì)"具體涉及其它酶。術(shù)語"純化"用于本文還指去除存在于本發(fā)明所述酶的細胞來源中的其它成分，特別是其它蛋白質(zhì)，并且最特別是其它酶。酶可以是"基本上純的多肽"，即不含來自產(chǎn)生該酶的生物的其它成分，即例如,重組產(chǎn)生酶的宿主生物。[0297]本發(fā)明中使用的酶可以是適合用于本發(fā)明描述的方法中的任何形式，例如，含有或不含細胞的粗發(fā)酵液、干粉或顆粒、無塵顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體或保護的酶。例如，顆?？梢匀缑绹鴮＠鸑os.4,106,991和4,661，452所公開的來產(chǎn)生，并且可以任選地通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來涂覆。例如，液體酶制備物可以根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過添加穩(wěn)定劑來穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有機酸。保護的酶可以根據(jù)EP238,216中公開的方法制備。[0298]半纖維素酶[0299]半纖維素的酶水解能夠由多種真菌和細菌進行。類似于纖維素降解，半纖維素水解需要許多酶的協(xié)調(diào)作用?？蓪肜w維素酶分為三個總類型：內(nèi)作用酶（endo-actingenzyme)，其攻擊多糖鏈的內(nèi)部鍵；外作用酶，其從多糖鏈的還原或非還原端向前(processively)作用；以及附屬酶、乙酰酯酶和酯酶，其水解木質(zhì)素糖苷鍵，例如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶（Wong,K.K.Y.，Tan,L.U.L.，andSaddler,J.N.，1988,Multiplicityofβ-I,4-xylanaseinmicroorganisms:Functionsandapplications,Microbiol.Rev.52:305-317；Tenkanen,M.,andPoutanenjK.,1992,Significanceofesterasesinthedegradationofxylans,inXylansandXylanasesjVisserjJ.,BeldmanjG.,Kuster-vanSomerenjM.A.,andVoragenjA.G.J.,eds.,Elsevier,NewYork，NY，203-212;CoughlanjM.P.,andHazlewoodjG.P.,1993,Hemicelluloseandhemicellulases，Portland,London,UK；Brigham,J.S.,AdneyjW.S.,andHimmeljM.E.,1996,Hemicellulases!Diversityandapplications，inHandbookonBioethanol:ProductionandUtilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，119-141)〇[0300]半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶和它們的混合物。內(nèi)作用的半纖維素酶和輔助酶的實例包括內(nèi)切阿聚糖酶、內(nèi)切阿拉伯半乳聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、內(nèi)切木聚糖酶和feraxan內(nèi)切木聚糖酶（feraxanendoxylanase)。外作用半纖維素酶和輔助酶的實例包括a-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、α-1，2-L-巖藻糖苷酶、a-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外切葡糖苷酶、外切纖維二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶和松柏苷β-葡糖苷酶。酯酶的實例包括乙酰酯酶（乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶）和芳基酯酶（香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶）。[0301]優(yōu)選地，半纖維素酶是外作用的半纖維素酶，并且更優(yōu)選在pH7以下的酸性條件下具有水解半纖維素能力的外作用半纖維素酶。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實例包括VISC0ZYME?(可從NovozymesA/S，Denmark獲得）。以有效量添加半纖維素酶，所述有效量是大約0.001%至大約5.0%固體重量，更優(yōu)選大約0.025%至大約4.0%固體重量，并且最優(yōu)選大約〇.005%至大約2.0%固體重量。[0302]木聚糖酶（E.C.3.2.1.8)可以從任何合適的來源獲得，包括真菌和細菌生物，例如曲霉屬、Disporotrichum、青霉屬、脈孢菌屬、鐮孢屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬、嗜熱霉屬（Thermomyces)和芽孢桿菌屬。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的包含木聚糖酶的制備物包括SHEARZYME?、BIOFEEDWHEAT?、BIO-FEEDPlus?L、CELLUCLAST?、ULTRAFLO?、VISCOZΥΜΕ?、PENTOPANMONO?BG、andPULPZYME?HC(NovozymesA/S);和LAMINEX?和SPEZYME?CP(GenencorInt.)〇[0303]酯酶[0304]能夠用于生物轉(zhuǎn)化纖維素的酯酶包括乙酰酯酶例如乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶，和水解木質(zhì)素糖苷鍵的酯酶，例如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。[0305]如用于本文，"酯酶"也成為羧酸酯水解酶，指作用于酯鍵的酶，并且包括根據(jù)酶命名法(EnzymeNomenclature,1992,AcademicPress,SanDiego,California,以及SupplementI(1993),Supplement2(1994),Supplement3(1995),Supplement4(1997)andSupplement5,分別參見Eur.J.Biochem.223:1-5,1994;Eur.J.Biochem.232:1-6,1995；Eur.J.Biochem.237:1-5,1996；Eur.J.Biochem.250:1-6,1997和Eur.J.Biochem.264:610-650,1999)分類在EC3.I.I羧酸酯水解酶中的酶。酯酶的非限定性實例包括芳基酯酶、三酰甘油脂肪酶、乙酰酯酶、乙酰膽堿酯酶、膽堿酯酶、托品酯酶、果膠酯酶、固醇酯酶、葉綠素酶、L-阿拉伯糖內(nèi)酯酶、葡糖酸內(nèi)酯酶、尿內(nèi)酯酶、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酯酶、羥基丁酸酯二聚體水解酶、?；视椭久?、3-氧代己二酸烯醇-內(nèi)酯酶（3-oxoadipateenol-lactonase)、1,4_內(nèi)酯酶、半乳糖脂肪酶、4-批卩多醇內(nèi)酯酶、酰基肉堿水解酶、氨?；?tRNA水解酶、D-阿拉伯糖內(nèi)酯酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、磷脂酶Al、6-乙酰葡萄糖脫乙酰酶、脂蛋白脂肪酶、二氫香豆素脂肪酶、檸檬素-D-環(huán)內(nèi)酯酶、類固醇內(nèi)酯酶、三乙酸內(nèi)酯酶、放線菌素內(nèi)酯酶、苔色酸縮酚酸類水解酶、頭孢菌素C脫乙酰酶、綠原酸水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酯酶、羧甲烯丁烯羥酸內(nèi)酯酶（carboxymethylenebutenolidase)、脫氧朽1檬酸A-環(huán)內(nèi)酯酶、2-乙酰-1-燒基甘油磷酸膽堿酯酶、鐮孢氨酸-C鳥氨酸酯酶、芥子堿酯酶、蠟酯水解酶、大戟二萜醇二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫酰酶、唾液酸〇-乙酰酯酶、乙酰氧基丁炔基二噻吩脫乙酰酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙酰酶、甲基饊酮乙酸脫乙酰酶〇1161：1171111]^)611丨€6^1-306七3七6(16306七71386)、2-批喃酮-4,6-二羧酸內(nèi)酯酶、1^-乙酰半乳糖胺聚糖脫乙酰酶、保幼激素酯酶、二（2-乙基己基）鄰苯二甲酸酯酶、蛋白質(zhì)-谷氨酸甲基酯酶、11-順-視黃基-棕櫚酸水解酶、全-反-視黃基-棕櫚酸水解酶、L-鼠李糖-1，4_內(nèi)醋酶（L_rhamnon〇-l，4-lactonase)、5_(3,4_雙乙酸基丁-1-塊基）_2,2'-二噻吩脫乙酰酶、脂肪酰基乙酯合酶、木糖-1，4-內(nèi)酯酶（xylono-1,4-lactonase)、N_乙酰葡糖胺酰磷脂酰肌醇脫乙酰酶、苯甲西曲酸酯酯酶（cetraxatebenzylesterase)、乙酰燒基甘油乙酰水解酶和乙酰木聚糖酯酶。[0306]用于本發(fā)明中的優(yōu)選的酯酶是脂肪分解酶，例如，脂肪酶（分類為EC3.I.I.3、EC3.I.1.23和/或EC3.I.1.26)和磷脂酶（分類為EC3.I.1.4和/或EC3.I.1.32,包括分類為EC3.I.1.5的溶血磷脂酶）。其它優(yōu)選的酯酶是角質(zhì)酶（分類為EC3.I.1.74)。[0307]可以添加有效量的酯酶以獲得期望的效益來改進發(fā)酵微生物的性能，例如，改變發(fā)酵微生物內(nèi)部和/或外部或者發(fā)酵微生物細胞膜中的脂肪組成/濃度，在發(fā)酵期間致使溶質(zhì)進和/或出發(fā)酵微生物的運動有所改進，和/或提供更多可代謝能量源（例如，通過將例如來自玉米底物的油等成分轉(zhuǎn)化成對于發(fā)酵微生物有用的成分例如不飽和脂肪酸和甘油），從而增加乙醇產(chǎn)率。酯酶的有效量的實例是大約〇.01至大約400LU/gDS(干固體）。優(yōu)選地，以大約0.1至大約l〇〇LU/gDS，更優(yōu)選大約0.5至大約50LU/gDS，并且甚至更優(yōu)選大約1至大約20LU/gDS的量使用酯酶。其后使用本領(lǐng)域已知的標準方法能夠獲得酯酶量的進一步優(yōu)化。[0308]1脂肪酶單位（LU)是在30°C、pH7.0(磷酸鹽緩沖液）使用三丁酸甘油酯(tributyrin)作為底物和阿拉伯膠作為乳化劑時，每分鐘釋放I.0μmol可滴定的脂肪酸的酶量。[0309]在優(yōu)選的方面，酯酶是脂肪分解酶，更優(yōu)選是脂肪酶。如用于本文，"脂肪分解酶"指脂肪酶和磷脂酶（包括溶血磷脂酶）。脂肪分解酶優(yōu)選是微生物來源，特別是細菌、真菌或酵母來源。使用的脂肪分解酶可以源自任何來源，包括例如以下屬和種的菌株：犁頭酶屬（Absidia)，具體為Absidiablakesleena和傘枝舉頭酶（Absidiacorymbifera);無色桿菌屬（Achromobacter)，具體為解毒無色桿菌（Achromobacteriophagus);氣單抱菌屬（Aeromonas);鏈格抱屬（Alternaria)，具體為甘藍鏈格抱（Alternariabrassiciola);曲霉屬，具體為黑曲霉、米曲霉、煙曲霉和黃曲霉（Aspergillusflavus);無色桿菌屬，具體為解毒無色桿菌；短梗酶屬，具體為出芽短梗酶（Aureobasidiumpullulans);芽孢桿菌屬，具體為短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；白僵菌屬（Beauveria);索絲菌屬（Brochothrix)，具體為熱殺索絲菌（Brochothrixthermosohata);念珠菌屬，具體為Candidacylindracea(皺裙念珠菌（Candidarugosa))、副解脂念珠菌（Candidaparalipolytica)和南極念珠菌（CandidaAntarctica);色桿菌屬（Chromobacter)，具體為粘稠色桿菌（Chromobacterviscosum);鬼傘屬，具體為灰蓋鬼傘；鐮孢屬，具體為禾本科鐮孢、尖鐮孢、腐皮鐮孢（Fusariumsolani)、豌豆腐皮鐮孢（Fusariumsolanipisi)、大刀粉紅鐮孢（Fusariumroseumclmorum)和鑲片鐮孢；地霉屬（Geotricum)，具體為潘氏地霉（Geotricumpenicillatum);漢遜酵母屬菌株，具體為異常漢遜酵母（Hansenulaanomala);腐質(zhì)霉屬，具體為短抱腐質(zhì)霉（Humicolabrevispora)、Humicolabrevisvar.thermoidea和特異腐質(zhì)霉；Hyphozyma屬；乳桿菌屬，具體為彎曲乳桿菌（Latobacilluscurvatus);綠僵菌屬（Metarhizium);毛霉屬；擬青霉屬；青霉屬，具體為圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)、皮落青霉（Penillumcrustosum)和擴展青霉（Penilliumexpansum);假單胞菌屬，具體為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、產(chǎn)堿假單胞菌（Psedomonasalcaligenes)、洋蔥假單胞菌（Pseudomonascepacia)(同物異名洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderiacepacia))、焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、莓實假單胞菌（Pseudomonasfragi)、嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonasmaltophilia)、門多薩假單胞菌（Pseudomonasmendocina)、解脂臭味假單胞菌（Pseudomonasmephiticalipolytica)、產(chǎn)堿假單胞菌、植物假單胞菌（Pseudomonasplantari)、類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)、施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri)和威斯康星假單胞菌（Pseudomonaswisconsinensi);絲核菌屬（Rhizooctonia)，具體為立枯絲核菌（Rhizooctoniasolani);根毛霉屬(Rhizomucor)，具體為曼赫根毛霉；根霉菌屬（Rhizopus)菌株，具體為日本根霉（Rhizopusjaponics)、小抱根霉（Rhizopusmicrosporus)和結(jié)節(jié)根霉（Rhizopusnodosus);紅冬抱酵母屬（Rhodosporidium)菌株，具體為紅冬抱酵母（Rhodosporidiumtoruloides);紅酵母屬（Rhodotorula)菌株，具體為膠粘紅酵母（Rhodotorulaglutinis);擲孢酵母屬（Sporobolomyces)菌株，具體為Sporobolomycesshibatanus;嗜熱霉屬，具體為細毛嗜熱霉（ThermomycesIanuginosus)(先前為疏棉狀腐質(zhì)霉）；Thiarosporella，具體為Thiarosporellaphaseolina;木霉屬，具體為哈茨木霉和里氏木霉和/或輪枝孢屬(Verticillium)〇[0310]在優(yōu)選的方面，脂肪分解酶源自曲霉屬、無色桿菌屬、芽孢桿菌屬、念珠菌屬、色桿菌屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Hyphozyma、假單胞菌屬、根毛霉屬、根霉屬或嗜熱霉屬。[0311]在更優(yōu)選的方面，脂肪分解酶是脂肪酶。在本文中可以應(yīng)用脂肪酶對發(fā)酵培養(yǎng)基(包括發(fā)酵酵母）中三酰甘油油脂（例如，從玉米底物產(chǎn)生）的結(jié)構(gòu)和組成的修飾能力。脂肪酶催化不同類型的三酰甘油轉(zhuǎn)化，例如水解、酯化和轉(zhuǎn)酯作用。合適的脂肪酶包括酸性、中性和堿性脂肪酶，如本領(lǐng)域內(nèi)公知的，盡管酸性脂肪酶（例如，脂肪酶GAMNO50,可以從Amano獲得）與中性或堿性脂肪酶相比在較低的脂肪酶濃度下看起來更有效。優(yōu)選用于本發(fā)明的脂肪酶包括南極念珠菌脂肪酶和Candidacylindracea脂肪酶。更優(yōu)選的脂肪酶是純化的脂肪酶，例如南極念珠菌脂肪酶（脂肪酶A)、南極念珠菌脂肪酶（脂肪酶B)、Candidacylindracea脂肪酶和沙門桕干釀青霉（Penicilliumcamembertii)脂肪酶。[0312]所述脂肪酶可以是在EP258,068-A中公開的脂肪酶，或者可以是脂肪酶變體例如在WO00/60063或WO00/32758中公開的變體，將其并入本文作為參考。[0313]優(yōu)選以大約1至大約400LU/gDS，優(yōu)選大約1至大約10LU/gDS，并且更優(yōu)選大約1至大約5LU/gDS的量添加脂肪酶。[0314]在另一個優(yōu)選的方面，酯酶是角質(zhì)酶。角質(zhì)酶是能夠降解角質(zhì)的酶。角質(zhì)酶可以源自任何來源。在優(yōu)選的方面，角質(zhì)酶源自以下屬和種的菌株：曲霉屬，具體為米曲霉；鏈格孢屬，具體為甘藍鏈格孢；鐮孢屬，具體為腐皮鐮孢、豌豆腐皮鐮孢、大刀粉紅鐮孢或接骨木粉紅嫌抱（Fusariumroseumsambucium);長懦抱屬（Helminthosporum)，具體為麥根腐長懦孢（Helminthosporumsativum);腐質(zhì)霉屬，具體為特異腐質(zhì)霉；假單胞菌屬，具體為門多薩假單胞菌或惡臭假單胞菌；絲核菌屬（Rhizooctonia)，具體為立枯絲核菌(Rhizooctoniasolani);鏈霉菌屬，具體為瘡痂病鏈霉菌（Streptomycesscabies)或單隔孢屬（Ulocladium),具體為群生單隔孢（Ulocladiumconsortiale)。在最優(yōu)選的方面，角質(zhì)酶源自特異腐質(zhì)霉的菌株，具體為菌株特異腐質(zhì)霉DSM1800。特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶在TO96/13580中描述，將其并入本文作為參考。角質(zhì)酶可以是變體，例如WO00/34450和TO01/92502中公開的變體之一，將其并入本文作為參考。優(yōu)選的角質(zhì)酶變體包括WO01/92502的實施例2中所列的變體，特別將其并入本文作為參考。角質(zhì)酶的有效量是大約0.01至大約400LU/gDS，優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS，并且更優(yōu)選大約1至大約50LU/gDS。其后可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標準方法獲得角質(zhì)酶量的進一步優(yōu)化。[0315]在另一個優(yōu)選的方面，酯酶是磷脂酶。如在本文中使用，術(shù)語"磷脂酶"是針對磷脂具有活性例如水解活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由酯化的甘油組成，在外部(sn-Ι)和中間（sn-2)位置以2個脂肪酸酯化，在第3個酯化部位以磷酸酯化。磷酸可酯化成氨基醇?？梢詤^(qū)分磷脂酶活性的幾種類型，包括磷脂酶Al和A2,其水解一個脂肪?；?分別在sn-Ι和sn-2位置）形成溶血磷酸脂；和溶血磷脂酶（或磷脂酶B)，其水解溶血磷脂中剩余的脂肪?；Ａ字窩和磷脂酶D(磷酸二酯酶）分別釋放二?；视突蛄字?。[0316]術(shù)語"磷脂酶"包括具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。術(shù)語"磷脂酶A"用于本文意在包括具有磷脂酶Al和/或磷脂酶A2活性的酶?？梢杂蛇€具有其它活性的酶來提供磷脂酶活性，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。例如，脂肪酶活性可以來自具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在其它方面，通過基本上僅具有磷脂酶活性的酶來提供磷脂酶酶活性，并且其中所述磷脂酶酶活性不是副活性。[0317]磷脂酶可以是任何來源的，例如，動物來源（例如，哺乳動物，例如，?；蜇i的胰腺），或蛇毒或蜂毒?；蛘?，磷脂酶也可以是微生物來源，例如來自絲狀真菌、酵母或細囷，例如曲霉屬，例如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉或米曲霉；網(wǎng)柄囷屬(Dictyostelium)，例如，盤基網(wǎng)柄菌（D.discoideum);鐮孢屬，例如，大刀鐮孢、禾本科鐮孢、異孢鐮孢、腐皮鐮孢、尖鐮孢或鑲片鐮孢；毛霉屬，例如，爪睡毛霉（M.javanicus)、大毛霉（M.mucedo)或細孢毛霉（M.subtilissimus);脈孢菌屬，例如，粗糙脈孢菌；根毛霉屬，例如，微小根毛霉（R.pusillus);根霉菌屬，例如，少根根霉（R.arrhizus)、日本根霉或匍枝根霉（R.stolonifer);核盤菌屬（Sclerotinia)，例如，大豆核盤菌(S.Iibertiana);毛蘚菌屬（Trichophyton)，例如，紅色毛蘚菌（T.rubrum);Whetzelinia，例如，W.sclerotiorum;芽孢桿菌屬，例如，巨大芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌；朽1檬酸桿菌屬(Citrobacter)，例如，弗氏朽1檬酸桿菌（C.freundii);腸桿菌屬（Enterobacter)，例如，產(chǎn)氣腸桿菌（E.aerogenes)或陰溝腸桿菌（E.cloacae);愛德華氏菌屬（Edwardsiella),遲鈍愛德華氏菌（E.tarda);歐文氏菌屬（Erwinia),例如，草生歐文氏菌（E.herbicola);埃希氏菌屬（Escherichia)，例如，大腸桿菌；克雷伯氏菌屬，例如，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae);變形菌屬（Proteus),例如，普通變形菌（P.vulgaris);普羅威登斯菌屬(Providencia)，例如，斯氏普羅威登斯菌（P.stuartii);沙門氏菌屬，例如，鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium);沙雷氏菌屬（Serratia)，例如，液化沙雷氏菌（S.Iiquefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens);志賀氏菌屬（Shigella),例如，弗氏志賀氏菌（S.flexneri);鏈霉菌屬，紫紅鏈霉菌（S.violeceoruber);或耶爾森氏菌屬，例如，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Y.enterocolitica)ο[0318]優(yōu)選的商業(yè)磷脂酶包括LECITASE?和LECITASE?ULTRA(可以從NovozymesA/S,Denmark獲得）。[0319]磷脂酶的有效量是大約0.01至大約400LU/gDS，優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS，并且更優(yōu)選大約1至大約50LU/gDS。其后可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標準方法獲得磷脂酶量的進一步優(yōu)化。[0320]蛋白酶[0321]在本發(fā)明另一個優(yōu)選的方面，將至少一種表面活性劑和至少一種產(chǎn)生糖的酶與至少一種蛋白酶組合使用。例如，可以使用蛋白酶來消化蛋白以產(chǎn)生游離氨基氮（FAN)。這些游離氨基酸發(fā)揮酵母營養(yǎng)物的功能，由此增強酵母的生長，繼而提高乙醇的產(chǎn)生。[0322]可以通過在至少一種蛋白酶存在下使發(fā)酵微生物增殖來產(chǎn)生發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵微生物。盡管不限于任何一種操作理論，但是相信與在不添加蛋白酶的相同條件下增殖的發(fā)酵微生物相比，在有效量的至少一種蛋白酶存在下增殖發(fā)酵微生物使得在其后的發(fā)酵方法中使用該發(fā)酵微生物時發(fā)酵微生物的滯后時間減少。在增殖過程中蛋白酶的作用被認為直接或間接導(dǎo)致分別對有害基因或有益基因的阻抑或表達，由此減少滯后時間并且產(chǎn)生更快的發(fā)酵循環(huán)。[0323]蛋白酶是本領(lǐng)域熟知的，并且指催化肽鍵切割的酶。合適的蛋白酶包括真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即特征在于在PH7以下的酸性條件下能夠水解蛋白的蛋白酶。合適的酸性真菌蛋白酶包括源自以下菌屬的真菌蛋白酶：曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、念珠菌屬、革蓋菌屬、內(nèi)座殼屬（Bndothia)、Enthomophtra、耙菌屬（Irpex)、青霉屬、小核菌屬（Sclerotium)和球擬酵母屬（Torulopsis)。特別期望的是源自以下菌種的蛋白酶：黑曲霉（參見，例如，Koazeetal·，1964,Agr.Biol.Chem.Japan28:216)、齋藤曲霉（Aspergillussaitoi)(參見，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan28:66)、泡盛曲霉（Hayashidaetal·，1977,Agric.Biol.Chem.42:927-933、棘孢曲霉（TO95/02044)或米曲霉；和源自微小毛霉（Mucorpusillus)或米赫毛霉的酸性蛋白酶。[0324]不是酸性蛋白酶的細菌蛋白酶包括商業(yè)上能夠獲得的產(chǎn)品ALCALASE?和NEUTRASE?(可以從NovozymesA/S獲得）。其它蛋白酶包括來自GenencorInternational,Inc.，USA的GC106和來自NovozymesA/S的N0V0ZYM?50006。[0325]優(yōu)選地，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，例如HandbookofProteolyticEnzymes,EditedbyA.J.Barrett,N.D.RawlingsandJ.F.ffoessner,AcademicPress,SanDiego,1998,Chapter270中所述。天冬氨酸蛋白酶的合適的實例包括例如Berkaetal·，1990,Gene96:313;Berkaetal·，1993,Gene125:195-198和Gomietal.，1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100描述的那些。[0326]討氣化物酶[0327]具有過氧化物酶活性的其它化合物可以是任何過氧化物酶（EC1.11.1.7)，或者可以是源自它們的具有過氧化物酶活性的任何片段，其顯示過氧化物酶活性。[0328]優(yōu)選地，過氧化物酶由植物（例如，辣根或大豆過氧化物酶）或微生物例如真菌或細菌產(chǎn)生。[0329]某些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門（subdivisionDeuteromycotina)、絲孢綱(classHyphomycetes)的菌株，例如，鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、木霉屬（Tricoderma)、漆斑菌屬(Myrothecium)、輪枝抱屬（Verticillum)、Arthromyces、卡爾黑霉屬（Caldariomyces)、單隔孢屬、埃里磚格孢屬（Embellisia)、支孢屬（Cladosporium)或Dreschlera,具體為尖鐮孢（DSM2672)、特異腐質(zhì)霉、里氏木霉、撫孢漆斑菌（Myrotheciumverrucaria)(IFO6113)、黃萎輪枝抱（Verticillumalboatrum)、大_花輪枝抱（Verticillumdahlia)、Arthromycesramosus(FERMP-7754)、Caldariomycesfumago、紙單隔抱(Ulocladiumchartarum)、Embellisiaalii或Dreschlerahalodes。[0330]其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔(dān)子菌亞門（subdivisionBasidiomycotina)、擔(dān)子菌綱（classBasidiomycetes)的菌株，例如，鬼傘屬、平革菌屬、革蓋菌屬或栓菌屬，具體為灰蓋鬼傘小抱變型（coprinuscinereusf.microsporus)(IFO8371)、長根鬼傘（Coprinusmacrorhizus)、黃孢平革菌（例如NA-12)或栓菌屬（先前稱為多孔菌屬（Polyporus))，例如雜色栓菌（例如，PR428-A)。[0331]進一步優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門（subdivisionZygomycotina)、Mycoraceae綱的菌株，例如根霉屬或毛霉屬，具體為凍土毛霉（Mucorhiemalis)。[0332]某些優(yōu)選的細菌包括放線菌目（orderActinomycetales)的菌株，例如類球形鏈霉菌（Streptomycesspheroides)(ATTC23965)、熱紫鏈霉菌（Streptomycesthermoviolaceus)(IF012382)或輪絲鏈輪絲菌輪絲亞種（Streptoverticillumverticilliumssp.verticillium)〇[0333]其它優(yōu)選的細菌包括類球紅細菌（Rhodobactersphaeroides)、Rhodomonaspalustri、乳鏈球菌（Streptococcuslactis)、Pseudomonaspurrocinia(ATCC15958)、突光假單胞菌（NRRLB-11)和芽孢桿菌屬菌株，例如，短小芽孢桿菌（ATCC12905)和嗜熱脂肪芽孢桿菌。[0334]進一步優(yōu)選的細菌包括屬于粘球菌屬（Myxococcus)的菌株，例如，變綠粘球菌(M.virescens)〇[0335]過氧化物酶還可以是通過以下方法產(chǎn)生的過氧化物酶，所述方法包括：在培養(yǎng)基中在允許過氧化物酶表達的條件下，培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述載體攜帶編碼過氧化物酶的DNA序列以及用于表達該過氧化物酶編碼DNA序列的DNA序列；和從培養(yǎng)物回收過氧化物酶。[0336]在優(yōu)選的方面，重組產(chǎn)生的過氧化物酶是源自鬼傘屬菌種（Coprinussp.)的過氧化物酶，具體為源自根據(jù)WO92/16634的長根鬼傘或灰蓋鬼傘的過氧化物酶。[0337]在本發(fā)明中，具有過氧化物酶活性的化合物包含過氧化物酶和源自細胞色素、血紅蛋白或過氧化物酶的過氧化物酶活性片段。[0338]1過氧化物酶單位（POXU)是在以下條件每分鐘催化1微摩爾過氧化氫轉(zhuǎn)化的酶量：在301：，在0.說磷酸鹽緩沖液？!17.0、0.881111過氧化氫和1.6711112,2'-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS)中。對反應(yīng)在418nm吸光度的改變跟蹤60秒（混合之后15秒），其應(yīng)該為0.15-0.30。對于活性的計算，使用36mM-lcm-l的氧化ABTS的吸光系數(shù)和1微摩爾轉(zhuǎn)化的H2O2/兩微摩爾氧化的ABTS的化學(xué)計量。[0339]漆酶[0340]在本發(fā)明中，漆酶和漆酶相關(guān)酶包含分類為EC1.10.3.2的任何漆酶、分類為ECI.10.3.1的任何兒茶酚氧化酶、分類為ECI.3.3.5的任何膽紅素氧化酶或分類為EC1.14.18.1的任何單酚單加氧酶。[0341]上述酶可以是微生物的，即，獲得自細菌或真菌（包括絲狀真菌和酵母），或者它們可以源自植物。[0342]來自真菌的合適的實例包括源自以下菌屬或菌種的菌株的漆酶：曲霉屬；脈孢菌屬，例如，粗糙脈孢菌；柄孢殼屬（Podospora);葡糖孢屬Ootrytis);金錢菌屬(Collybia);層孔菌屬（Fomes);香燕屬（Lentinus);側(cè)耳屬（Pleurotus);栓菌屬，例如T.villosa和雜色栓菌；絲核菌屬（Rhizooctonia)，例如，立枯絲核菌；鬼傘屬，例如，灰蓋鬼傘、毛頭鬼傘（C.comatus)、費賴斯鬼傘（C.friesii)和皺紋鬼傘（C.plicatilis);小脆柄燕屬（Psathyrella)，例如，P.condelleana;斑裙燕屬（Panaeolus)，例如，蝶形斑裙燕(P.papiIionaceus);毀絲霉屬，例如，嗜熱毀絲霉；柱頂孢屬（Schytalidium),例如，嗜熱柱頂孢（S.thermophilum);多孔菌屬，例如，P.pinsitus;密孔菌屬（Pycnoporus)，例如，朱紅密孔菌（P.cinnabarinus);射脈菌屬，例如，射脈菌（P.radita)(W092/01046)或革蓋菌屬，例如，毛革蓋菌（JP2-238885)。[0343]來自細菌的合適的實例包括從芽孢桿菌屬菌株獲得的漆酶。[0344]從鬼傘屬、毀絲霉屬、多孔菌屬、密孔菌屬、柱頂孢屬（Scytalidium)或絲核菌屬獲得的漆酶是優(yōu)選的；具體為獲得自灰蓋鬼傘、嗜熱毀絲霉、Polyporuspinsitus、朱紅密孔菌、嗜熱柱頂孢或立枯絲核菌的漆酶。[0345]商業(yè)上能夠獲得的漆酶是NS51001(Polyporuspinsitius漆酶，可以從NovozymesA/S,Denmark獲得）和NS51002(嗜熱毀絲霉漆酶，可以從NovozymesA/S,Denmark獲得）。[0346]漆酶或漆酶相關(guān)的酶還可以是通過以下方法產(chǎn)生的漆酶，所述方法包括：在培養(yǎng)基中在允許漆酶表達的條件下，培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述載體攜帶編碼漆酶的DNA序列以及用于表達該漆酶編碼DNA序列的DNA序列；和從培養(yǎng)物回收漆酶。[0347]在好氧條件下在pH5.5從丁香醒連氮（syringaldazine)的氧化測定漆酶活性(LA⑶）。在530nm測定產(chǎn)生的紫色。分析條件是19mM丁香醛連氮，23mM乙酸緩沖液、pH5.5,30°C，1分鐘反應(yīng)時間。1漆酶單位（LA⑶）是在以上條件下每分鐘催化I.0微摩爾丁香醛連氮轉(zhuǎn)化的酶量。[0348]在好氧條件下在pH7.5從丁香醛連氮的氧化來測定漆酶活性（LAMU)。在530nm用光度計測定產(chǎn)生的紫色。分析條件是19mM丁香醛連氮，23mMTris/馬來酸pH7.5,30°C，1分鐘反應(yīng)時間。1漆酶單位（LAMU)是在以上條件下每分鐘催化I.0微摩爾丁香醛連氮轉(zhuǎn)化的酶量。[0349]具有增強纖維素分解的活性的多肽可以與上述酶和/或纖維素分解蛋白結(jié)合使用以進一步降解生物質(zhì)底物的纖維素成分，（參見，例如，Brighametal.，1995,inHandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman,editor),pp.119-141,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology56:1-24)。[0350]具有增強纖維素分解的活性的多肽的最優(yōu)量和纖維素分解蛋白的最優(yōu)量依賴于幾個因素，所述因素包括但不限于成分纖維素分解蛋白的混合物、纖維素底物、纖維素底物濃度、纖維素底物預(yù)處理、溫度、時間、PH和發(fā)酵微生物（例如，用于同時糖化和發(fā)酵的酵母）的內(nèi)含物（inclusion)。[0351]在優(yōu)選的方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素材料的有效量是每克纖維素材料大約〇.01至大約2.Omg,優(yōu)選大約0.025至大約I.5mg，更優(yōu)選大約0.05至大約I.25mg，更優(yōu)選大約0.075至大約I.25mg，更優(yōu)選大約0.1至大約I.25mg，甚至更優(yōu)選大約0.15至大約I.25mg，并且最優(yōu)選大約0.25至大約I.Omg。[0352]在另一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白對于纖維素材料的有效量是每克纖維素材料大約〇.5至大約50mg，優(yōu)選大約0.5至大約40mg，更優(yōu)選大約0.5至大約25mg，更優(yōu)選大約0.75至大約20mg，更優(yōu)選大約0.75至大約15mg，甚至更優(yōu)選大約0.5至大約IOmg,并且最優(yōu)選大約2.5至大約10mg。[0353]在優(yōu)選的方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素分解蛋白的有效量是每克纖維素分解蛋白大約〇.005至大約I.0g，優(yōu)選大約0.01至大約I.0g，更優(yōu)選大約0.15至大約0.75g，更優(yōu)選大約0.15至大約0.5g，更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g，甚至更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g，并且最優(yōu)選大約0.05至大約0.2g。[0354]洗滌劑組合物[0355]可以將具有增強纖維素分解的活性的多肽添加至洗滌劑組合物，并且由此成為該洗滌劑組合物的成分。[0356]可以將本發(fā)明的洗滌劑組合物配制為例如手洗或機洗的洗滌劑組合物，包括適于預(yù)處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或?qū)⑵渑渲茷橛糜谕ǔ＜彝ビ脖砻媲鍧嵅僮鞯南礈靹┙M合物，或配制用于手洗或機洗的洗碟(dishwashing)操作。[0357]在具體的方面，本發(fā)明提供洗滌劑添加劑，其包含如本文所述具有增強纖維素分解的活性的多肽。所述洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶，和/或過氧化物酶。[0358]選擇的酶的性質(zhì)通常應(yīng)該與選擇的洗滌劑相容（即，最適pH，與其它酶和非酶成分的相容性等），并且所述酶應(yīng)該以有效量存在。[0359]趕進素酶：合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如，產(chǎn)生自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于美國專利號4,435,307、美國專利號5,648,263、美國專利號5,691，178、美國專利號5,776,757和TO89/09259。[0360]特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護顏色的效益（colourcarebenefits)。這種纖維素酶的實例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、TO96/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實例是例如在WO94/07998、EP0531315、美國專利號5,457,046、美國專利號5,686,593、美國專利號5,763,254、W095/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體，。[0361]商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括Celluzyme?和Carezyme?(NovozymesA/S)，Clazinase?和PuradaxHA?(GenencorInternationalInc.)，以及KAC-500(B)?(KaoCorporation)〇[0362]蛋白酶：合適的蛋白酶包括動物、棺物或微牛物來源的那微生物來源是優(yōu)選的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中描述）。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶（例如，豬或牛來源）和鐮孢屬蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。[0363]有用的蛋白酶的實例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在以下位置中的一個或多個具有取代的變體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。[0364]優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括Alcalase?、Savinase?、Primase?、Duralase?、Esperase?和Kannase?(NovozymesA/S)，Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、Properase?、Purafect?、Purafect0xP?、FN2?和FN3?(GenencorInternationalInc·)。[0365]ms:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括：源自腐質(zhì)霉屬（同物異名嗜熱霉屬）的脂肪酶，例如，如EP258068和EP305216中所述來自疏棉狀腐質(zhì)霉（細毛嗜熱霉），或如WO96/13580中所述來自特異腐質(zhì)霉；假單胞菌屬脂肪酶，例如源自產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌（EP218272)、洋蔥假單胞菌（EP331376)、施氏假單胞菌（GB1，372,034)、熒光假單胞菌、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(W096/12012);芽孢桿菌屬脂肪酶，例如，源自枯草芽孢桿菌（Dartoisetal·，1993,BiochemicaetBiophysicaActa,1131:253-360)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（JP64/744992)或短小芽孢桿菌（W091/16422)。[0366]其它實例是脂肪酶變體，例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中公開的那些。[0367]優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括Lipolase?、Lipex?和LipolaseUltra?(NovozymesA/S)〇[0368]淀粉酶:合適的淀粉酶（α和/或β)包括細菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬（例如，地衣芽孢桿菌的特殊菌株）獲得的α-淀粉酶，在GB1，296,839中更詳細地描述。[0369]有用的淀粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在以下位置中的一個或多個具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。[0370]商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是Duramy1?、Termamy1?、Fungamy1?和BAN?(NovozymesA/S)以及Rapidase?和Purastar?(來自GenencorInternationalInc.)〇[0371]討氣化物酶/氣化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在WO93/24618、W095/10602和WO98/15257中描述的那些。[0372]商業(yè)上能夠獲得的過氧化物酶包括Guardzyme?(NovozymesA/S)。[0373]通過添加含有一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中?？蓪⒈景l(fā)明的洗滌劑添加劑（即單獨的添加劑或組合的添加劑）配制成例如顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，尤其是無粉塵（non-dusting)顆粒，液體，尤其是穩(wěn)定化的液體，或菜；。[0374]例如，可以如美國專利號4,106,991和4,661，452中所公開的產(chǎn)生無粉塵顆粒，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法涂覆。錯制涂覆材料（waxycoatingmaterial)的實例是具有1000至20000的平均摩爾量的聚（環(huán)氧乙烷）產(chǎn)品（聚乙二醇，PEG);具有從16至50個的環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。適合于流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂覆材料的實例提供于GB1483591。例如，可根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定液體酶制備物。可以根據(jù)公開于EP238,216中的方法來制備保護酶（protectedenzyme)。[0375]本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有機溶劑，或非水的（non-aqueous)〇[0376]洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。所述表面活性劑通常以按重量計〇.1%至60%的水平存在。[0377]當(dāng)包括于此時，所述洗滌劑將通常含有大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如線性燒基苯磺酸鹽、α-烯經(jīng)磺酸酯（olefinsulfonate)、燒基硫酸鹽（脂肪醇硫酸酯）、醇乙氧基硫酸鹽（alcoholethoxysulfate)、仲燒磺酸鹽（secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、燒基-或烯基琥拍酸，或肥阜（soap)。[0378]當(dāng)包括于此時，洗滌劑將通常含有大約0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖苷（alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺（alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇醜胺（ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物（"葡糖酰胺（glucamide)"）。[0379]洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增清劑（builder)或復(fù)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯（phosphonate)、碳酸鹽（carbonate)、朽1檬酸鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、燒基-或烯基琥拍酸、可溶硅酸鹽或分層硅酸鹽（例如來自Hoechst的SKS-6)。[0380]洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧甲基纖維素、聚（乙烯基吡咯烷酮）、聚（乙二醇）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡啶-N-氧化物）、聚（乙烯咪唑）、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯（polyacrylates)、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。[0381]洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H2O2源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?；蛘?，漂白體系可以包含過氧酸，例如，酰胺、酰亞胺（imide)或砜類型的過氧酸。[0382]本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸（phenylboronicacid)衍生物例如4-甲醜苯基硼酸（4-formylphenylboronicacid)，并且例如可以如WO92/19709和WO92/19708中的描述來配制所述組合物。[0383]洗滌劑還可以含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如，織物整理劑（fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、防污再沉積劑、染料、殺菌劑、光亮劑（opticalbrightener)、水溶助劑（hydrotrope)、晦暗抑制劑（tarnishinhibitors)或香料。[0384]在洗滌劑組合物中，任何酶成分可以按相當(dāng)于每升洗滌液0.Ol-IOOmg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液〇.〇5_5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.I-Img酶蛋白的量添加。[0385]在洗滌劑組合物中，具有增強纖維素分解的活性的多肽可以按相當(dāng)于每升洗洗漆液〇·OOl-IOOmg蛋白，優(yōu)選0·005-50mg蛋白，更優(yōu)選0·01-25mg蛋白，甚至更優(yōu)選0.05-10mg蛋白，最優(yōu)選0.05-5mg蛋白，并且甚至最優(yōu)選0.Ol-Img蛋白的量添加。[0386]還可以將具有增強纖維素分解的活性的本發(fā)明多肽并入WO97/07202中公開的洗滌劑制劑，該文件并入本文作為參考。[0387]通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例[0388]材料[0389]作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。[0390]菌株[0391]使用里氏木霉RutC30(ATCC56765;MontenecourtandEveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)作為編碼家族61多肽的里氏木霉基因的來源，所述家族61多肽具有增強纖維素分解的活性。使用米曲霉JaL250菌株（W099/61651)來表達具有增強纖維素分解的活性的里氏木霉家族61多肽。[0392]培養(yǎng)基[0393]PDA平板由每升39克馬鈴薯葡糖瓊脂組成。[0394]MDU2BP培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成：每升45g麥芽糖、IgMgSO4·7H20、lgNaCl、2gK2S04、12gKH2P04、7g酵母提取物、2g尿素和0.5mlAMG痕量金屬溶液，pH至5.0。[0395]AMG痕量金屬由如下物質(zhì)組成：每升14.3gZnSO4·7H20、2.5gCuS04·5H20、0.5gNiCl2·6H20、13.8gFeSO4·7Η20、8·5gMnSO4·H2O和3g檸檬酸。[0396]LB平板由如下物質(zhì)組成：每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細菌用瓊脂（BactoAgar)。[0397]SOC培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成：2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl、2.5mMKClUOmMMgCl2和IOmMMgSO4;并且在高壓滅菌之后添加過濾除菌的葡萄糖至20mM。[0398]實施例1:發(fā)酵和菌絲組織[0399]將里氏木霉菌株RutC30培養(yǎng)在中試規(guī)模發(fā)酵罐中的含有復(fù)合碳源的生長培養(yǎng)基中。所述碳源包括葡萄糖、纖維素或經(jīng)預(yù)處理并洗滌的玉米秸桿。從1升樣品中收集真菌菌絲，立即在液氮中冷凍并且貯藏在-80°c。[0400]從U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)獲得經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿（PCS)。PCS中水不溶性的固體是56.5%纖維素、4.6%半纖維素和28.4(%木質(zhì)素。預(yù)處理條件是玉米秸桿，1.4(%(重量/體積）硫酸，1651：，107?5^，持續(xù)8分鐘。在測試之前，用大體積的蒸餾去離子水在玻璃濾器上洗滌PCS。其后使用咖啡研磨機研磨PCS以降低顆粒大小，并且進一步用水在22μmMillipore濾膜上（6PExpressMembrane,Stericup,Millipore,Billerica,MA)洗漆。將洗漆的PCS重懸在去離子水中以獲得20mg/ml懸液，并且在4°C|C藏。[0401]實施例2:里氏木霉定向（directional)cDNA文庫構(gòu)建[0402]通過用硫氰酸胍提取，其后通過5·7MCsCl墊（cushion)超速離心（Chirgwinetal.，1979,Biochemistry18:5294-5299)，采用以下修改從實施例1中描述的里氏木霉菌絲樣品制備總RNA。用研缽和研杵將冷凍的菌絲體在液氮中研磨成細粉末，之后在預(yù)冷的咖啡研磨機中研磨，并且立即懸浮在5體積的RNA提取緩沖液（4M硫氰酸胍、0.5%月桂酰肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉pH7.0、0.ΙΜβ-巰基乙醇）中。在室溫將所述混合物攪拌30分鐘并且離心（在12,OOOxg20分鐘）以使細胞碎片形成沉淀（pellet)。收集上清并且小心地鋪至5·7MCsCl墊（5·7MCsCl，IOmMEDTA，pH7.5,0·1%焦碳酸二乙酯（DEPC);使用之前經(jīng)高壓滅菌）上，每12.0mlCsCl墊使用26.5ml上清，并且離心以獲得總RNA(BeckmanSW28轉(zhuǎn)子，25,OOOrpm，室溫，24小時）。離心之后將上清小心地去除并且將含有RNA沉淀的試管底部切下并且用70%乙醇漂洗。將總RNA沉淀轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，在500μITE(IOmMTris-0.ImMEDTA)，pH7.6中懸?。ㄈ缬欣щy，不時地在65°C加熱5分鐘），酚提取，并且在-20°C用乙醇沉淀12小時（2.5體積乙醇，0.1體積3M乙酸鈉pH5.2)。通過離心（在12,OOOxg30分鐘）收集RNA，在70%乙醇中洗漆，并且在最少體積的DEPC處理的水中重懸。通過測量在260nm的吸光度來測定總RNA濃度。[0403]通過寡（dT)-纖維素親和色譜法來分離多聚（A)+RNA(Aviv&Leder，1972，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA69:1408-1412)。將全部0.2g寡（dT)纖維素（BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)在10mlIX柱加樣緩沖液(20mMTris-Cl,pH7·6,0·5MNaCl,ImMEDTA,0·I%SDS)中預(yù)先溶脹（pre-swell)，加樣至DEPC預(yù)處理的、填充的（plugged)塑料柱（PolyPrepChromatographyColumn，BioRad，Hercules，CA)上，并且用20mlIX加樣緩沖液平衡。將總RNA(l_2mg)在65°C加熱8分鐘，在冰上冷激（quench)5分鐘，在添加1體積2X柱加樣緩沖液之后將所述總RNA加樣至該柱。收集洗脫液，并如上所述通過來加熱樣品且在每次加樣之前在冰上冷激來重加樣2-3次。將寡（dT)柱用10體積IX加樣緩沖液洗滌，其后用3體積培養(yǎng)基鹽緩沖液（20mMTris-Cl，pH7·6,0·IMNaCl，lmMEDTA，0.1%SDS)洗滌，接著用預(yù)熱至65°C的3體積的洗脫緩沖液（IOmMTris-ClpH7.6,ImMEDTA，0.05%SDS)洗脫多聚（A)+RNA,收集500μ1級分。讀取每個收集的級分在260nm的吸光度，再匯集含有mRNA的級分并且在-20°C乙醇沉淀12小時。通過離心收集多聚（A)+RNA,在DEPC處理的水中重懸，并且以5-10μg的等分試樣貯藏在_80°C。[0404]通過RNaseH方法（GublerandHoffmanI983,Gene25:263_27〇;Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,aLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory卩代88,(]〇1(13口1'；[1^]^1'13〇1'，附）使用發(fā)夾修飾由5以8里氏木霉1?111:030多聚（4)+1?敵合成雙鏈EcoRI-NotI-定向的cDNA。在預(yù)硅化的、不含RNA酶的Eppendorf管中在70°C將所述多聚（A)+RNA(5μg，于5μIDEPC處理的水中）加熱8分鐘，在冰上冷激，并且與逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液（50mMTris-ClpH8.3、75mMKCl、3mMMgCl2UOmMDTT)組合于終體積50μ1，所述逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液含有ImMdATP、dGTP和dTTP，0.5mM5-甲基-dCTP，40單位人胎盤核糖核酸酶抑制劑（Promega,Madison,WI)，4.81μg寡（dT)18_NotI引物和1000單位SuperscriptIIRNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶（LifeTechnologies,Inc.,Rockville,MD)。通過將所述反應(yīng)混合物在45°C溫育1小時來合成第一鏈cDNA。合成之后，根據(jù)制造商的說明書通過MicroSpinS-400HR離心柱（AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)將mRNA:cDNA雜交混合物凝膠過濾。[0405]凝膠過濾之后，將雜交體在250μ1第二鏈緩沖液（20mMTris-ClpH7.4,90mMKCl，4.6mMMgCl2，10mM(NH4)2S04,0.16mMNAD+)中稀釋，所述緩沖液含有dNTP各200μΜ，60單位大腸桿菌DNA聚合酶I(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，5·25單位RNaseH和15單位大腸桿菌DNA連接酶（NewEnglandBiolabs,Inc.，Beverly,ΜΑ)。通過將反應(yīng)試管在16°C溫育2小時，并且在25°C溫育額外的15分鐘來進行第二鏈cDNA合成。通過添加EDTA至20mM終濃度來終止反應(yīng)，之后是酚和氯仿提取。[0406]通過添加2體積96%乙醇和0.2體積IOM乙酸銨將雙鏈cDNA在_20°C乙醇沉淀12小時，通過離心回收，在70%乙醇中洗滌，干燥（SpeedVac)，并且在含有25單位綠豆核酸酶的30μ1綠豆核酸酶緩沖液（30mM乙酸鈉pH4.6,300mMNaCl，ImMZnSO4,0.35mM二硫蘇糖醇，2%甘油）中重懸。通過在30°C將所述反應(yīng)溫育30分鐘使單鏈發(fā)夾DNA夾合（clip)，其后添加70μIIOmMTris-ClpH7.5、ImMEDTA，酚提取，并且用2體積96%乙醇和0.1體積3M乙酸鈉pH5.2在冰上乙醇沉淀30分鐘。[0407]通過離心（30,OOOxg持續(xù)30分鐘）回收雙鏈cDNA，并且通過將反應(yīng)混合物在16°C溫育1小時用30μ1T4DNA聚合酶緩沖液（20mMTris-乙酸pH7.9，10禮乙酸鎂，5〇111]\1乙酸鉀，ImM二硫蘇糖醇）中的T4DNA聚合酶來平端化，所述緩沖液含有0.5mM的每種dNTP和5單位T4DNA聚合酶。通過添加EDTA至20mM終濃度來終止反應(yīng)，其后是酚和氯仿提取，并且通過添加2體積96%乙醇和0.1體積3M乙酸鈉pH5.2在-20°C乙醇沉淀12小時。[0408]在補平反應(yīng)（fill-inreaction)之后，如上通過離心回收cDNA,在70%乙醇中洗滌，并且在SpeedVac中干燥DNA沉淀。通過將反應(yīng)混合物在16°C溫育12小時，在25μ1連接緩沖液（30mMTris-ClpH7.8,IOmMMgCl2,IOmM二硫蘇糖醇，0·5mMATP)中重懸cDNA粒狀沉淀，所述緩沖液含有2ygEcoRI銜接頭（adaptor)(0.2yg/μ1，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)和2〇單位T4連接酶（RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)。通過在65°C加熱20分鐘來終止反應(yīng)，其后置于冰上5分鐘。通過添加20μ1高壓滅菌水、5μ110XNotI限制酶緩沖液和50單位NotI，其后在37°C溫育3小時，從而用NotI消化銜接的cDNA。通過將樣品在65°C加熱15分鐘來終止反應(yīng)。通過在44mMTrisBase、44mM硼酸、0.5mMEDTA(TBE)緩沖液（在高壓滅菌水中）中0.8%SeaPlaqueGTG低熔點瓊脂糖凝膠（FMC，Rockland，ME)上的瓊脂糖凝膠電泳將cDNA大小分級，從而分離未連接的銜接頭和小cDNA。將凝膠在15V運行12小時，并且通過切割瓊脂糖凝膠的靠下部分以0.7kb為限選擇cDNA的大小。其后將I.5%瓊脂糖凝膠傾倒在含有cDNA的凝膠之前，并且通過反向跑膠直至其作為壓縮的帶出現(xiàn)在凝膠上來濃縮雙鏈cDNA。將含有cDNA的凝膠片從凝膠上切下，并且使用GFXGelBandPurificationKit(Amersham,ArlingtonHeights,IL)從凝膠如下提取cDNA。在2ml不含核酸酶的微量離心管（ISCBi〇EXpreSS，KaySVille，UT)中稱量修剪的凝膠切片。其后向每IOmg凝膠切片添加IOmlCaptureBuffer(Amersham,ArlingtonHeights，IL)。通過在6CTC溫育10分鐘來溶解凝膠切片，直至瓊脂糖完全溶解，其后通過短暫的離心（2分鐘，于8,OOOxg)使樣品形成沉淀。將熔化的樣品轉(zhuǎn)移至置于收集管中的GFX離心柱，在25°C溫育1分鐘，其后在微量離心機中以最高速（15,OOOxg)離心30秒。棄去流出液（flow-through)，并且用500μ1洗漆緩沖液（GFXGelBandPurificationKit,Amersham,ArlingtonHeights,IL)洗漆該柱，然后以最高速離心30秒。棄去收集管，并且將柱置于1.5mlEppendorf管中，其后通過向柱的中央添加50μITEpH7.5,在25°C溫育1分鐘，并且最終通過在最高速（15,OOOxg)離心1分鐘來洗脫cDNA。將洗脫的cDNA貯藏在-20°C直至文庫構(gòu)建。[0409]根據(jù)制造商的說明書（QIAGEN，Valencia,CA)使用QIAGENTip-100來純化含有EcoRI-NotI插入物的pYES2.OcDNA克隆的質(zhì)粒DNA制備物。通過添加用于EcoRI的6μ110XNEBuffer(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)、40單位NotI和20單位EcoRI，其后在37°C溫育6小時，從而在總體積60μI中用NotI和EcoRI完全消化全部10μg純化的質(zhì)粒DNA。通過將樣品在65°C加熱20分鐘來終止反應(yīng)。將消化的質(zhì)粒DNA用酚-氯仿提取一次，然后用氯仿提取，其后通過添加2體積96%乙醇和0.1體積3M乙酸鈉pH5.2在-20°C乙醇沉淀12小時。將沉淀的DNA在25μITEpH7.5中重懸，加樣至TBE緩沖液中的0.8%SeaKem瓊脂糖凝膠上，并且在60V運行3小時。將消化的載體從凝膠切下，并且根據(jù)制造商的說明書使用GFXGelBandPurificationKit從該凝膠提取DNA。通過在260nm的吸光度測量DNA濃度之后，將洗脫的載體貯藏在-20°C直至文庫構(gòu)建。[0410]為了建立用于cDNA文庫的最優(yōu)連接條件，在10μ1連接緩沖液（30mMTris-ClpH7.8、10mMMgCl2UOmMDTT、0.5mMATP)中進行了四個測試連接，所述連接緩沖液含有7μI雙鏈cDNA(對應(yīng)于cDNA樣品中總體積的大約1/10)、2單位T4連接酶和分別為25ng、50ng和75ng的EcoRI-NotI切割的pYES2.0載體（Invitrogen,Carlsbad,CA)。載體背景對照連接反應(yīng)含有75ngEcoRI-NotI切割的pYES.0載體，而不含cDNA。通過在16°C溫育12小時來進行連接反應(yīng)，在65°C加熱20分鐘，其后向每個試管添加10μ1高壓滅菌的水。將1μ1連接混合物電穿孔（200W，2.5kV，25mF)至40μ1電感受態(tài)大腸桿菌DHlOB細胞（LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。在向每個轉(zhuǎn)化混合物添加ImlSOC培養(yǎng)基（Birrenetal.,1998.GenomeAnalysis,Vol.2.DetectingGenes.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)之后，在37°C培養(yǎng)細胞I小時。其后將來自每個電穿孔的50μ1和5μ1涂布至補充有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，并且在37°C培養(yǎng)12小時。使用最優(yōu)條件，在大腸桿菌中建立了含有1-2.5xl07個獨立集落形成單位的里氏木霉此比30〇0嫩文庫，載體背景為大約1%。將該〇0嫩文庫貯藏為：（1)在-801：在20%甘油中的獨立庫（individualpool)(25,000c.f.u./庫）；（2)在-2(TC，相同的庫的細胞沉淀；(3)在-20°C，來自獨立庫的QIAGENTip100純化的質(zhì)粒DNA;和⑷在-20°C，定向的雙鏈cDNA。[0411]實施例3:里氏木霉EST模板制備[0412]根據(jù)制造商提供的說明書使用96孔多重質(zhì)粒制備系統(tǒng)（96-wellmanifoldplasmidpreparationsystem(QIAGEN,Valencia,CA))來純化來自獨立大腸桿菌菌落的質(zhì)粒DNA，所述菌落來自實施例2中描述的cDNA文庫。[0413]實施例4:分析cDNA克隆的DNA序列數(shù)據(jù)[0414]在PHRED/PHRAP軟件（UniversityofWashington,Seattle,WA)的輔助下進行喊基判定（basecalling)、質(zhì)量值指定（qualityvalueassignment)和載體修整（vectortrimming)。用Blastx程序（Altschulet.al.，1990,J.Mol.Biol.215:403-410)在32節(jié)點Linux族（Paracel,Inc.，Pasadena,CA)上使用BLOSUM62矩陣（Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)進行裝配的EST序列相對于PIR數(shù)據(jù)庫的序列同源性分析。[0415]實施例5:鑒定編碼具有增強纖維素分解的活性的家族61多肽（GH61B)的cDNA克隆[0416]起初通過cDNA克隆的翻譯產(chǎn)物與公共數(shù)據(jù)庫中存在的其它已知家族61多肽的相似性來鑒定編碼具有增強纖維素分解的活性的家族61多肽（GH61B)的cDNA克隆。具體而言，這種分析說明預(yù)測的多肽與家族61的已知成員里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(Saloheimoetal·，1997,Eur.J.Biochem.249:584-591)的核心域在蛋白質(zhì)水平上是50%同一的。在這種初始鑒定之后，從其原始冷凍原種平板上提取EST克隆并且劃線接種至補充有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。將平板在37°C溫育過夜，并且在次日將來自每個平板的單菌落用于接種補充有100μg/ml氨芐青霉素的3mlLB。將液體培養(yǎng)物在37°C溫育過夜，并且用BioRobot9600(QIAGENInc.，Valencia,CA)制備質(zhì)粒DNA。將來自每個EST克隆的質(zhì)粒DNA再次用Big-Dye?終止化學(xué)（AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA)測序，使用M13正向和下文所示的Poly-T引物來測序克隆的3'端。[0417]5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'（SEQIDN0:3)[0418]其中V=G、A或C，而N=G、A、C或T[0419]選擇一個克隆用于核苷酸序列分析，該克隆是命名為pTr3337的里氏木霉ESTTr3337〇[0420]實施例6:表征編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的里氏木霉cDNA克隆[0421]設(shè)計了下文所示的三個新引物來從ESTpTr3337(圖2)延伸序列信息。[0422]5'-TGTCCATGGCCGAGA-3,（SEQIDN0:4)[0423]5'-ATACTGGTCACTTCCCCAA-3'（SEQIDN0:5)[0424]5'-GCGCTGGGTCAAGATT-3,（SEQIDN0:6)[0425]在Perkin-ElmerBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer上使用染料-終止化學(xué)來進行DNA測序（Gieseckeetal·，1992,JournalofVirologyMethods38:47-60)。測序I.17kbcDNA片段的Phred質(zhì)量值為36。[0426]里氏木霉GH61BcDNA克隆編碼區(qū)的核苷酸序列（SEQIDNO:1)和推定的氨基酸序列（SEQIDN0:2)示于圖1。編碼序列包括終止密碼子為750bp。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為249個氨基酸。編碼區(qū)為56.8%G+C。使用SignalP程序（Nielsenetal·，1997,ProteinEngineering10:1-6)，預(yù)測了19個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有230個氨基酸，分子量為25.lkDa，且等電點（pi)為7.36。[0427]使用Interproscan程序（ZdobnovandApweiler,2001，Bioinformatics17:847-8)分析成熟肽顯示：由克隆Tr3337編碼的基因含有糖基水解酶家族61蛋白的序列特征（sequencesignature)。這種被稱為Pfam模式PF03443的序列特征（Batemanet.al·，2004,NucleicAcidsResearch32:138-141)位于殘基20至241，這確認克隆Tr3337編碼里氏木霉家族61基因。[0428]使用如EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（NeedlemanandWunsch，1970,supra)及缺口開啟罰分10,缺口延伸罰分0.5,和EBL0SUM62矩陣來測定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示所述里氏木霉基因（其編碼具有增強纖維素分解的活性的GH61B成熟多肽）的推定氨基酸序列與源自里氏木霉（GeneSePADH34517)和球毛殼（Chaetomiumglobosum)(UniProtQ2GPR1)的兩種糖基水解酶家族61蛋白的推定氨基酸序列分別具有100%和62%同一性（不包括缺口）。[0429]將含有質(zhì)粒pTr3337的大腸桿菌菌株以NRRLB-30878保藏在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)我保藏中心，北方區(qū)研究中心（1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604)，保藏日期為2005年9月20日。[0430]實施例7:構(gòu)建用于里氏木霉家族GH61B基因的米曲霉表達載體[0431]設(shè)計了下文所示的兩個合成寡核苷酸引物以從所述cDNA克隆來PCR擴增里氏木霉家族GH61B基因。使用InFusionCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA)將所述片段直接克隆至表達載體pAIL〇2(W02005/074647)中，不需要限制性消化和連接。[0432]正向引物：[0433]5,-ACTGGATTTACCATGAAGTCCTGCGCCATTCTTGC-3'（SEQIDN0:7)[0434]反向引物：[0435]5,-AGTCACCTCTAGTTAGCCTTGCCACAGGGCTGG-3'（SEQIDN0:8)[0436]粗體字母表示編碼序列。剩余序列與pAlL〇2的插入位點同源。[0437]將上述每種引物各50皮摩爾用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有IOOng里氏木霉cDNA克隆（如實施例5中所述制備），IXPfxAmplificationBuffer(Invitrogen,Carlsbad,CA)，6μIIOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物，2.5單位PlatinumPfxDNAPolymerasednvitrogen,Carlsbad,CA),1μI50mMMgSO4矛口5μIIOXpCRxEnhancerSolution(Invitrogen，Carlsbad,CA)，終體積為50μ1。擴增條件是在94°C2分鐘的一個循環(huán)；和在94°C15秒、55°C30秒和68°C3分鐘的30個循環(huán)。其后加熱塊進行4°C保溫循環(huán)（soakcycle)。[0438]將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上分離，使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉（TAE)緩沖液，其中將3kb產(chǎn)物條帶從該凝膠切下并且根據(jù)制造商的說明書使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA)進行純化。[0439]其后使用InFusionCloningKit將片段克隆至pAlLo2中。用NcoI和PacI消化載體（使用制造商指定的條件）。通過凝膠電泳和QIAquick凝膠純化來純化片段。將基因片段和消化的載體在反應(yīng)中組合在一起，產(chǎn)生表達質(zhì)粒pTr61B(圖3)，其中家族GH61B基因的轉(zhuǎn)錄在NA2-tpi啟動子（來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體）的調(diào)控下。重組反應(yīng)（20μ1)由IXInFusionBuffer(BDBiosciences，PaloAlto，CA)、lXBSA(BDBiosciences，PaloAlto，CA)、lylInFusion酶(以1:10稀釋）（BDBiosciences，PaloAlto,CA)、IOOng用NcoI和PacI消化的pAlLo2和IOOng里氏木霉GH6IB純化PCR產(chǎn)物組成。將反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。使用1μ1所述反應(yīng)來轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSolopacGold細胞（Stratagene，LaJolla，CA)。通過限制酶消化來鑒定含有pTr61B(GH61B基因）的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并且使用QIAGENBioRobot9600來制備質(zhì)粒DNA。[0440]實施例8:在米曲霉JaL250中表達編碼具有增強纖維素分解的活性的家族GH61B多肽的里氏木霉cDNA[0441]根據(jù)Christensenetal.，1988,Bio/Technology6:1419-1422的方法來制備米曲霉JaL250原生質(zhì)體。使用5ygpTr61B(以及pAlL〇2作為載體對照）來轉(zhuǎn)化米曲霉JaL250〇[0442]用pTr61B(GH61B基因）轉(zhuǎn)化米曲霉JaL250產(chǎn)生了大約70個轉(zhuǎn)化體。將10個轉(zhuǎn)化體分離至單獨的PDA平板。[0443]用5ml0·01%Tween80洗漆全部轉(zhuǎn)化體的鋪滿的（confluent)PDA平板，并將其分開接種至125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基中并且在34°C、200rpm溫育。溫育5天之后，根據(jù)制造商的說明書使用8-16%Tris-GlycineSDS-PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad,CA)來分析來自每個培養(yǎng)物的5μ1上清。培養(yǎng)物的SDS-PAGE分布(profile)顯示了幾個轉(zhuǎn)化體具有大約25kDa的新的主條帶。[0444]用IOml0·01%Tween20洗滌一個轉(zhuǎn)化體（在PDA上培養(yǎng)）的鋪滿平板并將其接種至含有500mlMDU2BP培養(yǎng)基的2升Fernbach中，以產(chǎn)生用于表征酶的培養(yǎng)液。在第五天收獲搖瓶并且使用0.22μmGPExpressplusMembrane(Millipore,Bedford,MA)過濾。[0445]實施例9:里氏木霉GH6IB對使用表達米曲霉β-葡糖苷酶的里氏木霉發(fā)酵液水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿的影響[0446]在水解實驗之前，將里氏木霉GH61B(如實施例8中所述在米曲霉中重組產(chǎn)生）脫鹽，并且使用帶有Biomax-5膜（5000NMWL;Millipore,Bedford,MA)的CentriconPlus-20離心濾器交換至50mM乙酸鈉pH5.0。如WO2005/074647中所述制備表達米曲霉β-葡糖苷酶的不含細胞的里氏木霉發(fā)酵液，將該發(fā)酵液用于不脫鹽并且不交換緩沖液的水解試驗。[0447]在各試驗之前，從貯藏在_20°C的酶母液制備新鮮的酶稀釋液。[0448]使用對輕基苯甲酸醜餅（PHBAH)試驗（Lever,M.，1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem.47:273-279)來測定還原糖（RS)，對該方法進行修飾并且使其適合于96孔微量培養(yǎng)板形式。[0449]將稀釋樣品的90μ1等分試樣置于96孔圓錐形底面微量培養(yǎng)板（CorningInc.,Acton,MA,Costar,clearpolycarbonate)的每個孔中。通過向每個孔中添加60μ12%氫氧化鈉中的1.25%PHBAH來起始試驗。將不加蓋的平板在訂制的加熱塊上在95°C加熱10分鐘。將微量培養(yǎng)板冷卻至室溫之后，向每個孔中添加35μ1去離子水。從每個孔中去除100μ1等分試驗并且轉(zhuǎn)移至平底96孔板（CorningInc.，Acton,MA,Costar,mediumbindingpolystyrene)。使用SpectraMAXMicroplateReader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測量在410nm的吸光度（A41tl)。使用標準曲線將A41tl值轉(zhuǎn)化為葡萄糖當(dāng)量。[0450]使用六個葡萄糖標準品（0·005、0·010、0·025、0·050、0·075和0·lOOmg/ml)獲得標準曲線，對所述標準品進行類似于樣品的處理。通過用去離子水稀釋lOmg/ml葡萄糖母液來制備葡萄糖標準品。[0451]使用以下等式計算纖維素轉(zhuǎn)化成還原糖的程度（轉(zhuǎn)化率，％):[0452]轉(zhuǎn)化率（％)=RS(mg/ml)*100*162/(纖維素(mg/ml)*180)=[0453]=RS(mg/ml)*10(V(纖維素（mg/ml)*l.Ill)[0454]在該等式中，RS是溶液中以葡萄糖當(dāng)量測量的還原糖濃度（mg/ml)，而因子I.Ill反映在纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖時的重量增加。[0455]通過表達米曲霉葡糖苷酶的不含細胞的里氏木霉發(fā)酵液水解磨碎的PCS(以干重為基礎(chǔ)1%重量/體積），所述水解在蓋有DeepwellMats96(Brinkmann,Westbury,NY)的DeepwellPlates96(1.2ml,Brinkmann,Westbury,NY)中進行。將初始體積為Iml的全部反應(yīng)在50mM乙酸鈉pH5.O中進行，在50°C間歇攪拌。[0456]對含有每克PCS2.5mg的里氏木霉發(fā)酵液的時程（time-course)反應(yīng)，補充以每克PCS0.625mg的里氏木霉GH61B(如本文所述在米曲霉中重組產(chǎn)生）（纖維素酶蛋白加樣量的25%)，并且將結(jié)果與每克PCS2.5和3.125mg的未補充的里氏木霉培養(yǎng)液的結(jié)果比較，或與僅含有每克PCS2.5mg里氏木霉GH61B蛋白的結(jié)果比較。[0457]對含有每克PCS2.5mg里氏木霉發(fā)酵液的蛋白加樣反應(yīng)，補充以每克PCS0.2、0.4、0.6或I.2mg的里氏木霉GH61B蛋白（如本文所述在米曲霉中重組產(chǎn)生），并且溫育115小時。將結(jié)果與每克PCS2.5和3.5mg未補充的里氏木霉培養(yǎng)液的結(jié)果比較。[0458]使用8通道移液器在特定時間點從PCS水解反應(yīng)中移出20μ1等分試樣，并且將等分試樣添加至MultiScreenHV96孔過濾平板（Millipore，Bedford，MA)中的180μ1喊性混合物（102mMNa2CO3和58禮NaHCO3)以終止反應(yīng)。將樣品真空過濾至另一個平底微量培養(yǎng)板以去除PCS殘余物。適當(dāng)稀釋之后，使用下文所述PHBAH試驗分析濾出液的RS。[0459]示于圖4的結(jié)果說明了向表達米曲霉β_葡糖苷酶的里氏木霉發(fā)酵液補充里氏木霉GH61B蛋白在全部采樣時間點改進了水解產(chǎn)率。與相同蛋白加樣量的單獨里氏木霉發(fā)酵液相比觀察到更大的改進。所述改進不能以僅通過GH61B多肽的水解來解釋，因為其即使在每克PCS2.5mg這種高得多的蛋白質(zhì)加樣量下在115小時處總計僅有1.2%。[0460]圖5中所示的結(jié)果說明在GH61B多肽一定范圍的蛋白加樣量內(nèi)觀察到提高，最大提高在蛋白加樣量為里氏木霉發(fā)酵液蛋白加樣量的大約16%處。[0461]生物材料的保藏[0462]依據(jù)布達佩斯條約的條款，下述的生物材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心，1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604,并給出了下述的登錄號：[0463]保藏物登錄號保藏日期[0464]大腸桿菌菌株pTr3337NRRLB-308782005年9月20日[0465]該菌株于下述條件下保藏：確保在本專利申請未決期間，由專利與商標委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。[0466]此處，本文中所描述和要求保護的本發(fā)明在范圍上并非限定于本文所公開的具體方面，因為這些方面意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等價的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，從前面的說明中，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改將是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。[0467]本文引用了多篇參考文獻，將其公開的全部內(nèi)容并入作為參考。【權(quán)利要求】1.用于降解或轉(zhuǎn)化預(yù)處理的纖維素材料的方法，其包括：在有效量的具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的至少包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶的纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素分解蛋白的量是每克纖維素分解蛋白0.01至1.Og，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)⑴或（ii)的互補鏈；(c)包含[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且x(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和(d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含的氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽是變體，所述變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。5.用于生產(chǎn)物質(zhì)的方法，其包括：(A)在有效量具有增強纖維素分解的活性的多肽存在下，用有效量的至少包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶的纖維素分解蛋白將預(yù)處理的纖維素材料糖化，其中與缺乏所述具有增強纖維素分解的活性的多肽時相比，具有增強纖維素分解的活性的多肽的存在使纖維素材料的降解增加，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素分解蛋白的量是每克纖維素分解蛋白〇.01至1.〇g，并且其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：(a)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（b)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（c)(a)或（b)的互補鏈；(iii)包含[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且x(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和(iv)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；(B)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟（a)中糖化的纖維素材料；和(C)從發(fā)酵回收所述物質(zhì)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)(i)或（ii)的互補鏈。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述具有增強纖維素分解的活性的多肽是變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。9.用于降解或轉(zhuǎn)化預(yù)處理的纖維素材料的洗滌劑組合物，其包含纖維素分解蛋白和具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述纖維素分解蛋白至少包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和0-葡糖苷酶，所述具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組：(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；（ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或（iii)⑴或（ii)的互補鏈；(c)包含[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且x(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；和(d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；其中具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素分解蛋白的量是每克纖維素分解蛋白0.01至l.Og。10.權(quán)利要求9的洗滌劑組合物，其中所述多肽包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性，并且甚至最優(yōu)選至少97%同一性。【文檔編號】C12P19/14GK104404106SQ201410707558【公開日】2015年3月11日申請日期:2006年9月29日優(yōu)先權(quán)日:2005年9月30日【發(fā)明者】保羅.哈里斯,邁克爾.雷伊,丁晗澍申請人:諾維信股份有限公司