專利名稱：：一種植物株高相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及--種植物株高相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：株高是水稻(()ryzasativaL)重要的農(nóng)藝性狀之一。20世紀60年代，世界范圍內(nèi)以作物矮化育種為標志的"綠色革命"使谷物產(chǎn)量有了大幅度的提高。編碼赤霉素合成途徑氧化酶0sGA20ox2的半矮稈基因sd-l，是水稻"綠色革命"的主要基因。在我國，除了極少數(shù)品種含有sd-g、sd-t(t)夕卜，絕大部分的秈稻品種都含有來自矮仔占或矮腳南特的sd-1基因。而粳稻品種的矮源復(fù)雜，其株高可能受微效多基因控制。長期利用的單一的矮化基因易導(dǎo)致遺傳背景狹窄。在粳秈雜交優(yōu)勢的利用上，因秈粳雜交導(dǎo)致雜種植株偏高。尋找既具有較強的降稈能力，又不會引起其它不良效應(yīng)的矮源，尤其是顯性矮稈基因矮源是水稻育種工作者的重要目標。因此，拓寬水稻的新矮源,開展水稻矮稈基因的鑒定、遺傳機理和矮化機制研究是水稻遺傳育種工作的重要研究內(nèi)容之一。水稻矮生性遺傳主要有兩種類型由主基因控制的質(zhì)量性狀和由微效多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。水稻矮稈基因根據(jù)其矮化效應(yīng)，一般分為矮稈基因和半矮稈基因。Pa潔ll等最早報道了一個由單隱性基因控制的自然矮稈突變系。Oryoji報道由一對隱性基因控制的人工誘變產(chǎn)生的矮小突變體。在日本水稻基因連鎖群和命名委員會迄今為止所報道的61個矮稈基因(以d-編號命名)和15個半矮稈基因(以sd編號命名)中，已經(jīng)有48個矮稈、半矮稈基因被定位。植物FIE蛋白含有7個WD基序，每個WD基序由大約40個氨基酸組成，WD基序最早發(fā)現(xiàn)于G蛋白的e亞基，也稱Trp-ASP或W:[M()，具有保守的G:H(glycine-histidine)和WD(tryptophan-asparticacid)序列，該基元在蛋白質(zhì)的相互作用方面具有重要作用。目前，在許多蛋白質(zhì)，如參與細胞分裂、mRNA修飾、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運輸?shù)冗^程的調(diào)控蛋白質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了WD基元。Madrona進一步分析發(fā)現(xiàn)，WD基元存在于真核生物的1%2%蛋白質(zhì)中，但在原核生物中很少。另外，很多研究證實，WD-重復(fù)蛋白家族的一個共同的作用機制是調(diào)控多個蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配,其重復(fù)的WD基元作為蛋白質(zhì)互作的支架，可以同時參與幾個蛋白質(zhì)的相互作用。FIE基因在擬南芥中有l(wèi)個拷貝，各組織中均有表達,通過與其它蛋白形成復(fù)合體,抑制同源異型基因表達，從而抑制同源轉(zhuǎn)化的發(fā)生,從而調(diào)控植物的正常發(fā)育。而單子葉植物水稻中未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物株高相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物株高相關(guān)蛋白(OsFIEl)，來源于稻屬水稻(Oryzasativa)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和Z或添加且與植物株高相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由466個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的OsF]:El便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表l標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的0sFIEl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的OsFIEl的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DM序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標簽的編碼序列得到。編碼上述植物株高相關(guān)蛋白的基因(OsFIEl)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)的DM分子1)序列表中序列2所示的I)NA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物株高蛋白的DNA分子；[,]3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼植物株高相關(guān)蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由1401個核苷酸組成。所述嚴格條件可為在O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液中，在65t:下雜交并洗膜。含有以上任一所述基因的重組表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子,這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選,可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達載體可將所述基因插入pCAMBIA2300質(zhì)粒的多克隆位點得到。具體來說，所述重組表達載體可將p固IA2300質(zhì)粒XbaI和SalI位點間的小片段取代為所述基因(OsFIEl)得到。含有以上任一所述基因(OsF]:El)的表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增所述基因(OsFIEl)全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育矮化轉(zhuǎn)基因植物的方法,是將所述基因?qū)肽康闹参?如細胞或組織)中，得到株高矮于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。具體來說，可以將所述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中，得到株高矮于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述目的水稻具體可為986083或中花11。所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或所述方法均可應(yīng)用于培育不同株高的植物。所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或所述方法均可應(yīng)用于植物育種。利用任何一種可以弓|導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛毎?可獲轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DM轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的調(diào)控植物株高發(fā)育相關(guān)蛋白主要控制植物株高，該水稻株高發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因表達后可導(dǎo)致植物矮化，并且相對于正常高株為顯性,將其應(yīng)用于植物雜交育種利用等工作，是重要的矮源。選用顯性矮稈基因作為矮源，株高問題的解決將變得容易，親本篩選的范圍將更廣泛,有利于遠緣雜交包括秈、粳間亞種間雜交親本的選配。圖1為突變基因的精細定位。圖2為野生型986083和突變體986083D的株高對比形態(tài)，a為野生型，b為突變體。圖3為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-0sFIEl植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果。圖4為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-OsFIEl植株表型鑒定結(jié)果；a為轉(zhuǎn)空載體的986083植株，b為轉(zhuǎn)EH-pCAMBIA23()()-OsFIEl的986083植株。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。突變體水稻986083D:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；Geneticanalysisofanoveldominantricedwarfmutant986083D,RuizhenQin，YangQiu,Zhij皿Cheng，XueyanShan，XiupingGuo，H:uquZhai,JianminWan,Euphytica(2008):160379-387;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所2005年選育得到的矮桿突變體水稻。實施例1、植物株高相關(guān)蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)—、水稻顯性矮稈突變體986083D及其遺傳分析利用在同源四倍體水稻H3774花藥培養(yǎng)后代中得到一個顯性矮稈突變體986083D進行研究。突變體與其野生型相比表現(xiàn)為(l)植株顯著變矮，穗長及各節(jié)間均相應(yīng)縮短，株高降低約49%;(2)每株穗數(shù)多達28.3個，增加約139.8%;(3)每穗粒數(shù)減少約51.9%，明顯降低結(jié)實率(13.4%);(4)籽粒變小,千粒重11.7g,谷粒呈橢圓形；(5)株型緊湊，葉片短窄，葉色深綠；見圖2。用純合矮稈突變體986083D作為父本，與八個水稻品種非洲B(粳)、ITA165(粳)、擬二九豐(秈)、H9(粳)、烏血糯(秈)、因原白米(秈)、云南旱稻(粳)和珍汕97B(秈)配制雜交組合。所有Fi種植在海南,株高都低于親本中親值，比高稈親本降低37.5%59.4%，表現(xiàn)半矮稈(見表2)，這是到目前為止在水稻中報道的降稈能力最強的突變體。表2純合986083D與8個親本雜交，F(xiàn)'株高降稈能力(海南，長度單位cm)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>組合母本株高父本株高Fl株高中親值Fi低于中親值降稈率(％)因原白米X986083D146.62973.287.816.650.1非洲BX986()83D155.12974.792.118.951.8烏血糯X986083D1382965.483.521.752.6種植121個對矮稈突變體單株收種形成的株系。株高發(fā)生分離的株系有88個，不分離的矮稈純合系33個，在88個雜合株系中，經(jīng)卡方測驗，87.6%株系中的矮株數(shù)與高株數(shù)之比符合3:1。其中的高稈株與純合矮稈株不再分離，而雜合矮稈株仍然分離。說明矮稈性狀的分離屬一對等位基因的遺傳比例，矮稈性狀相對于高稈性狀為顯性。二、突變基因初步定位在水稻12條染色體上，按照每隔10cM挑選一個引物的標準，隨機挑選660個SSR標記對作圖群體父、母本(986()83D和培矮64)進行多態(tài)性篩選，共篩得具有多態(tài)的引物157對，均勻地分布于水稻12條染色體上，標記間平均距離在10-30cM。利用157個多態(tài)標記分析隨機選取的F2群體中20個隱性高株，發(fā)現(xiàn)位于第8號染色體短臂上SSR標記RM6356與RM6208與表型存在較明顯的連鎖，在該位置附近開發(fā)新的SSR標記，利用521株隱性高稈單株將目的基因初步定位于SSR標記SS-17(2.4cM)和SS-23(0.48cM)之間2.88cM的區(qū)域之內(nèi)(圖1)。SSR標記分析的方法如F:(1)提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下①取().2克左右的水稻幼嫩葉片，置于Eppendorf'管中，管中放置一粒鋼珠,把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GENO/GRINDER儀器上粉碎樣品lmin。②加入660y1提取液(含lOOmlTris-Hcl(PIi8.0)，20慮EDTA(PH8.0)，1.4MNaCl，().2g/mlCTAB的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴3()min。③加入40u120%SDS，65。C溫浴10min,每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。加入100u15MNaCl，溫和混勻。⑤加入100iil10XCTAB,65。C溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。加入900ii1氯仿，充分混勻，12()0()rpm離心3min。⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mLEppendorf管中，加入600ii1異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。@棄上清液，沉淀用70%(體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。⑨加入100u11XTE(121克Tris溶于1升水中，用鹽酸調(diào)PH:值至8.()得到的溶液)溶解DNA。取2u1電泳檢測DNA質(zhì)量，并用DU800分光光度儀測定濃度(BechmanlnstrumentInc.U.S.A)。(2)將上述提取的DNA稀釋成約20ng/y1，作為模板進行PCR擴增；PCR反應(yīng)體系(10u1):DNA(20ng/ul)lul，上游引物(2pmol/ul)lul，卜'游引物(2pmol/ul)lul,10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)().lul，ddH2()5.lul，共l()ul。PCR反應(yīng)程序:94.(TC變性5min;94.(TC變性30s、55。C退火30s、72。C延伸lmin，共循環(huán)35次；72t:延伸7min;1(TC保存。PCR反應(yīng)在MJResearchPTC-225熱循環(huán)儀中進行。(3)SSR標記的:PCR產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的DNALadder為對照比較擴增產(chǎn)物的分子量大小，銀染顯色。三、突變基因精細定位根據(jù)初步定位的結(jié)果，在突變基因所在區(qū)域附近尋找公共圖譜上的分子標記，并自行開發(fā)SSR和Indel標記。用F2群體中的高稈單株驗證，在該染色體的相關(guān)區(qū)段篩選更多標記進一步定位突變體基因。在986083D與培矮64雜交衍生的F2群體中選取1976個&群體中的高株表型的水稻植株用于突變基因精細定位，利用公共圖譜上的分子標記和基于水稻基因組序列數(shù)據(jù)自行開發(fā)的ssr和:[nde:i.分子標記對突變基因進行精細定位，并根據(jù)定位結(jié)果初步確定突變基因。將公共圖譜的SSR標記與水稻基因組序列進行整合，下載突變位點附近的BAC/PAC克隆序列，用SSRHunter軟件搜索克隆中的SSR。通過BLAST程序在線篩選在9311與Nipponbare之間表現(xiàn)多態(tài)的SSR，對有多態(tài)的SS:R設(shè)計引物。根據(jù)RGP上日本晴和9311序列進行比對，開發(fā)了60對SSR標記，得到4個多態(tài)標記為SS-l、SS-2、SS-17、SS-23(表3)，分別與突變基因的距離為0.2cM、2.lcM、2.4cM、0.48cM。利用類似的引物設(shè)計方法，開發(fā)了47對日本晴和9311之間Indel標記，得到4個多態(tài)標記為12、14、16、113(表3)，交換單株數(shù)分別是0、3、3、4。、表3設(shè)計用于初步定位和精細定位的分子標記<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>精細定位結(jié)果如圖1所示，圖1中a為設(shè)計的SSR標記與突變基因連鎖圖譜。b含有突變基因的BAC重疊群，箭頭表示在BAC上設(shè)計的標記。c和d為利用F2群體中的1976個具有突變表型單株精細定位突變基因的連鎖圖譜，橫線上方數(shù)字表示各個標記與突變基<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>因位點間的交換個體數(shù)。四、突變基因的獲得根據(jù)定位的位點設(shè)計引物primerl和primer2。[,]primerl(下劃線所示的序列為Xba]:酶識別位點)5'GCGCTCTAGACCTCATCACCGCTCTCCTC3，;primer2(下劃線所示的序列為SalI酶識別位點)5，GCGCGTCGACAGTCACCGACCAACATCCTG3，。以primerl和priraer2為引物，以突變體水稻986083D的幼苗提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，進行PCR擴增獲得目的基因。擴增反應(yīng)在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進行94。C3min;94。C30sec，6(TC30sec，72。C2min，35個循環(huán)；72。C10min。將PCR產(chǎn)物回收純化后連接入pBS-T(購自北京Tiangen公司)，測序載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(天根生化科技(北京)有限公司，目錄號CB1()1)，挑選陽性克隆后，進行測序。序列測定結(jié)果表明，PCR反應(yīng)獲得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，編碼466個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(見序列表的序列1)。將序列1所示的蛋白命名為OsFIEl,將序列1所示的蛋白的編碼基因命名OsFIEl,將含有OsFIEl的pBS-T命名為p:BS-OsF:[El。()sFI:El蛋白含有7個WD(tryptophan-asparticacid)結(jié)構(gòu)域。實施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定—、重組表達載體構(gòu)建將實施例1構(gòu)建的pBS-OsFIEl用XbaI和SalI雙酶切，將含OsFIEl基因的片段回收，連接到經(jīng)XbaI:和Sal]:雙酶切處理的pCAMB]:A23()0載體上(澳大利亞CAMBI公司)上，得到重組表達載體。將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。提取質(zhì)粒進行酶切和測序檢測，檢測結(jié)果表明，獲得了含有序列2所示0sFIEl基因的重組質(zhì)粒，將其命名為pCAMBIA23()()-()sF]:El(骨架載體為pCAM:B]:A230()，在XbaI和Sa:l.I位點之間插入了序列2所示的OsFIEl基因)。二、重組農(nóng)桿菌的獲得用電擊法將pCAMBIA2300-OsFIEl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrogen公司，18313-015)菌株，得到重組農(nóng)桿菌，提取質(zhì)粒進行:PCR及酶切鑒定。PCR鑒定用引物primer3:5'-GCCCTCGTCTTTCAACCTAC-3';primer4:5，-CCTTATGGCTGATTTCACTTGT-3，;擴增產(chǎn)物為854bp即為鑒定陽性。將PCR及酶切鑒定正確的重組農(nóng)桿菌命名為EH-pCAMBIA2300-0sFIEl。三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得將EH-pCAMBIA2300-OsFIEl轉(zhuǎn)化986083和中花11(兩個水稻品種均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所種質(zhì)資源庫)。具體方法為(1)28。C培養(yǎng)EH-pCAMBIA2300-0sFIEl16小時，收集菌體，并稀釋到含有100umol/L卡那霉素的N6液體培養(yǎng)基(Sigma公司，C1416)中至濃度為0D6。。^0.5，獲得菌液；(2)將培養(yǎng)至一個月的水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸千菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，Sigma公司)中，24t:共培養(yǎng)3天；(3)將步驟(2)的愈傷接種在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司)的N6固體篩選培養(yǎng)基上第一次篩選(16天)；(4)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有200mg/L潮霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選，每15天繼代一次；(5)挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入含有150nig/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上分化；得到分化成苗的T。代陽性植株。用電擊法將pCAMBIA2300轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到對照菌株，用對照菌株轉(zhuǎn)化986083和中花ll,得到轉(zhuǎn)空載體對照植株甲(出發(fā)植株為986083)和轉(zhuǎn)空載體對照植株乙(出發(fā)植株為中花ll)，方法同上。四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定將歩驟三獲得的T。代陽性植株、986083(野生型對照)種子、986083D(突變體對照)種子、中花11(正常高株對照)種子、轉(zhuǎn)空載體對照植株在溫室中種植。提取植株葉片的:[)NA，以primer5和priraer6為引物對進行PCR擴增(primer5:5，-TTAATAACACATTGCGGACGT-3';primer6:5'-GGATTGCACGCAGGTTCTC-3'，引物序列是針對載體序列的，非轉(zhuǎn)該載體的植株擴不出對應(yīng)條帶);以PCR產(chǎn)物為模板，以primer7和primer8為引物對進行PCR擴增(primer7:5'-CCTGTCTACGCCATTGTCTTC-3，；primer8:5'-ATCAATGTCGCAAGCCCAG-3'，引物序列是針對()sF]:El基因組序列的)。PCR反應(yīng)體系DNA(20ng/ul)2ul，上下游引物(10pmol/ul)各2ul，10XBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10m1)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH20410ul，總體積20ul。擴增反應(yīng)在PTC-2()()(MJResearchInc.)PCR儀上進行94。C3rain;94。C3()sec，55°C45sec，72。Clmin，35個循環(huán);72。C5min。用試劑盒(北京Tiangen公司)純化回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖膠分離，用EB染色。結(jié)果表明獲得16株P(guān)CR檢測陽性的轉(zhuǎn)OsFIEl基因植株(1株的出發(fā)植株為986083;15株的出發(fā)植株為中花11)。部分植株的電泳圖見圖3。圖3中1為野生型為模板，沒有擴增出條帶；2為突變體為模板，沒有擴增出條帶；3為中花11為模板，沒有擴增出條帶；4為轉(zhuǎn)EH-pCAMBIA2300-0sFIEl的986083植株為模板，擴增出條帶；5_7為轉(zhuǎn)EH-pCAMBIA2300-OsFIEl的中花11的其中的3株為模板，擴增出條帶。T。代轉(zhuǎn)OsF]:E1基因植株、986083(野生型對照)、986083D(突變體對照、中花11(正常高株對照)和T。代轉(zhuǎn)空載體對照植株成株的株高見表4。表4不同植株在相同培養(yǎng)條件下的株高<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>〈160>2〈210>1〈211>466〈212>P:RT〈213〉稻屬水稻(0ryzasativa)〈400〉1MetGlyProThrSerArgAsnIiisLysSerSerGinLysAspValAla151015ProAsnGluAlaLysProProArgTyrProGinArgAsnArgSerlie202530ThrAlaSerAlaSerAlaSerAlaPheAlaSerProAlaValAlaAsn354045SerArgValAlaLysGluArgProSerSerSerThrAlaGlyGluGly505560GluProGinGluThrValLeuLysLeuProSerlieProThrLeuPro65707580AlaArgMetAlaLysLeuValProLeuGluGlyLeuGlyCysGluAla859095AlaValGlySerLeuThrProSerArgGluArgGluTyrLysValThr100105110AsnLysHisThrGluGlyArgArgProValTyrAlalieValPheAsn115120125PheLeuAspValArgTyrTyrAspliePheAlaThrAlaCysGlyPro130135140ArgLeuSerThrTyrArgCysLeuMetAsnGlyLysPheAlaLeuLeu145150155160GinSerTyrLeuAspAspAspMetAsnGluSerPhePheThrValSer165170175TrpAlaCysAsplieAspGlyAsnProLeuLeuValAlaAlaGlySer180185190ThrGlylielieArgVallieAsnCysAlaThrGluLyslieTyrLys195200205SerLeuValGlyHisGlyGlySerValAsnGlulieLysSerGinPro210215220SerAsnProSerLeulielieSerAlaSerLysAspGluSerlieLys225230235240LeuTrpAsnValGinThrGlylieLeulieLeuValPheGlyGlyVal245250255GlyGlyIiisArgIiisGluValLeuGlyValAspPheIiisThrSerAsp<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>gcctgtggccctcgtctttcaacctaccgctgcctcatga3tggcaaatttgctcttctg■caaagctatcttgatgacgatcattcttcactgtgagctgggcttgcgac540attgfitggc&iatccattgtt縛tegctgc&igg皿gca^ctgg&mtcattcg600tgtgccactgtaagagtcttg'ttg'g'ccatggtggttcagt660aagtctcaaccatcgaatccttcactcatcatttctgcaagc^ggatgaatctetteag720ctgtggaatgtgC￡ig￡iC￡lgggatctteattttggtttttggtgg觀teggaggtc￡iccga780cticgaagtacUggtgttgacttccacacatctgatatctaccgctttttfifigttgtgg3840ctgtgagaiitctg'g'tcaatggggmtetgt■tattcatggactgatgctacatcaaaatttccaacaaaat.ttgtccaatttccggtcctg960tgtgctggiaatecattcteactetgtegactgtecteaatggcttggggactttgtcctg1020aatcttgctgtggg肌tcg31080ggcg郷gtcacattg'atgttcttcagaagtaccctgtgccatctggttc1140atgaaattctcatgtgattttcaccacaattegg3^ccg1200gtctatgtctgaccagccctcctgttcteattgctcggctcaataatcca1260gtgtcctttgaatccttgcc1320tgC8C8g'8ggatggcaacatatg'g'cg'ttgggatg^gtggcgccccagtc1380cc朋gc朋gaaacaaaagtga140權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物株高相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)利要求l所述蛋白的基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DM序列雜交且編碼植物株高相關(guān)蛋白的DM分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼植物株高相關(guān)蛋白的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。5.如權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pCAMBIA2300質(zhì)粒的多克隆位點得到的。6.擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。7.—種培育矮化轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到株高矮于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或5所述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為水稻；所述目的植物為水稻品種986083或水稻品種中花11。10.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4或5所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或權(quán)利要求7至9中任一所述方法在培育不同株高植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物株高相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物株高相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的調(diào)控植物株高發(fā)育相關(guān)蛋白主要控制植物株高，表達后可導(dǎo)致植物矮化，并且相對于正常高株為顯性，將其應(yīng)用于植物雜交育種利用等工作，是重要的矮源。選用顯性矮稈基因作為矮源，株高問題的解決將變得容易，親本篩選的范圍將更廣泛，有利于遠緣雜交包括秈、粳間亞種間雜交親本的選配。文檔編號C12N15/11GK101698677SQ20091023696公開日2010年4月28日申請日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日發(fā)明者萬建民,張欣,張立國,王久林,秦瑞珍,程志軍,蘇寧,邱陽,郭秀萍,雷財林申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所