專利名稱：一種植物抗病毒蛋白基因的克隆的制作方法
技術領域：
抗病毒蛋白是植物細胞中的一種重要的免疫組分，其重要作用就是拮抗植物感染 病毒的侵染，從植物組織和細胞中分離的抗病毒蛋白對于生物農藥的應用具有重要作用。 本發(fā)明通過改進的DNA克隆技術和基因重組技術，將一種辣椒的抗病毒蛋白基因從辣椒 (Capsicum frutescens var)葉片中分離出來，該發(fā)明屬于生物農藥合成工程技術領域。
背景技術：
利用植物組織中已經(jīng)合成的生物蛋白實現(xiàn)農藥生產應用的綠色與環(huán)保是現(xiàn)代農 藥生產與生物防治研究的重要研究課題。栽培植物及其農作物具有完備的防衛(wèi)系統(tǒng)，能夠 抵御來自于微生物的侵染和危害。植物個體自身的生化反應過程產生了許多拮抗病原菌的 化合物——各種蛋 白、多肽、酯類、酚類的生化小分子，這些生化物質構成了植物的防衛(wèi)反 應系統(tǒng)。來自于植物自身的合成產物通常對人類和植物本身是沒有危害的，也不會對人體 產生負面的影響，是環(huán)境友好型的環(huán)保產品。因此，植物化合物生產是生物防治和藥物生產 的重要產業(yè)。病害的防治從無機化學農藥、有機化學農藥到生物農藥的發(fā)展，農業(yè)科技人員開 展了大量深入而細致的研究。這些研究包括病毒致病過程、化學防治技術、植物抗病機制及 抗病品種培育等。隨著分子病理學研究的深入，建立在現(xiàn)代分子生物學和植物基因工程技 術之上的抗病基因工程研究豐富了植物抗病研究的理論基礎，推動了植物病害防治和生物 農藥的發(fā)展。自從1986年誕生第一株抗病毒工程植株以來，植物抗病毒基因工程研究不論在 深度上還是廣度上都取得了很大的發(fā)展。來自于番茄的病毒抗性基因Tm-2能夠在植物組 織內獲得植物免疫系統(tǒng)的啟動和抗性形狀的表達，有助于植物自身免疫系統(tǒng)的激發(fā)和有到 對病毒的抗病性。那么，基因工程的方法獲得的基因產物及其表達的抗病毒蛋白，無論在理 論和實踐上都具有及其重要的應用價值。

發(fā)明內容
本研究采用植物中存在的抗病毒蛋白基因進行重組抗病毒基因的克隆技術方法。 這種抗病毒蛋白對自身基因轉錄與蛋白的合成不起破壞作用，但能特異失活與其親緣關系 較遠的物種的核糖體功能，抑制蛋白質合成，使得浸染的病毒不能完成正常的侵染過程。大 量的研究結果表明，植物體中的抗病毒蛋白具有多種抑制病原微生物活性的特點。Tm-cf基 因是一種從辣椒(Capsicum frutescens var)中提取的DNA，其編碼蛋白的產物是一種具有 侵染病毒抗性的抗病毒蛋白。實踐證明，通過基因克隆和基因工程實施抗病毒蛋白分離和 合成，能有效地避免環(huán)境污染，為植物病害防治開拓了廣闊的應用前景。本發(fā)明的目的是通過基因克隆技術和基因重組技術，從辣椒葉片中分離和克隆抗 病毒蛋白基因，期待在原核中生物體中表達具有功能的編碼蛋白，獲得無污染、有利于環(huán)境 和人類健康的抗病毒蛋白，應用于生物防治。
本發(fā)明應用DNA重組技術和分子生物學方法，從辣椒葉片中分離了一個長度為 2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf，并在大腸桿菌中表達了這段目的基因。本發(fā)明的是由以 下技術方案實現(xiàn)的，1)分離了一種抗病毒蛋白基因；2)在大腸桿菌中重組和表達了該基 因。該基因片斷的核苷酸序列為SEQ NO. 1所示的長度從ATG到TGA為2607bp。所述的長度為2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf，其插入到克隆載體pMD_18中時， 獲得了含有Tm-cf基因擴增片斷的重組DNA質粒pMD-18 (cf)。質粒pMD_18 (cf)包含有長 度為2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf。該質粒經(jīng)轉化大腸桿菌(E. coli)DH5 α獲得克隆菌 株pMD/Tm-cf，其菌種將在近期獲得并補充保藏號。本發(fā)明的技術特點一是從辣椒葉片中分離抗病毒基因；二是所分離的抗病毒蛋 白基因能夠通過大腸桿菌表達；三是該基因克隆的方法是與基因重組技術相結合；四是該 基因經(jīng)過重組可以獲得生物農藥。利用 CD-Search 月艮務 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/)來分析本 發(fā)明申請專利保護的抗病毒蛋白基因Tm-cf。發(fā)現(xiàn)Tm-cf基因具有如下結構特點1)基因 長度為2607bp ；2) N端的第289-300bp和第316_333bp處分別含有12和18個堿基的插入 (GCAATCTGTTGT 和 TGCATCCCTTCTTGTGCT) ；3)具有 CC-NBS-LRR 蛋白特征；4)擁有 15 個磷酸 化位點；5)具有ATP/GTP結合位點的基序A(P-Ioop)。

因此，以該基因保守序列為模版合成的或分離的其它植物蛋白，如果其基因結構 與SEQN0. 1的所述的核苷酸序列，則在具有專業(yè)知識的工程技術人員的操作下，經(jīng)過一定 的和部分的核苷酸序列的修飾(突變、缺失、替代、剪貼、重復、倒位、易位、轉座、重組和拼 接)以及一個或數(shù)個堿基(氨基酸)的改變，可以獲得同類基因，并不能夠顯著地影響抗病 毒蛋白的功能。使用經(jīng)過核苷酸序列的修飾以及一個或數(shù)個堿基改變的抗病毒蛋白基因， 并且具有與SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都屬于本專利的發(fā)明內容和保護范 圍。
具體實施例方式本發(fā)明以幾種重要的茄科病毒抗性基因的DNA序列設計擴增引物，對辣椒 (Capsicumfrutescens var)基因組DNA進行擴增，獲得了一個抗病毒相關的基因。具體實 施方式如下1)采用Primer Premier 5. O軟件設計N對引物。2)辣椒DNA的提取采用CTAB法提取，實施PCR基因擴增技術獲得目標序列。PCR 程序為 95°C IOmin ；95°C 30S，53°C 30S，72°C 2. 5min，42 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。3)PCR產物回收后克隆至載體pMD-18中。雙向測序驗證并獲得了長度為2607bp 的DNA擴增片斷。4)采用Trizal法提取辣椒葉片的總RNA，DNase I處理純化后，用UNT0-10柱式 mRNA抽提試劑盒獲得mRNA，隨后用MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒獲得反轉錄的cDNA，并利 用CAAdaptor建立cDNA文庫，再以相同的引物實施PCR擴增。PCR產物回收后克隆到載體 pMD-18中，雙向測序驗證已經(jīng)克隆的長度為2607bp的基因產物。5)利用DNAMAN 5. O進行辣椒同源基因的核苷酸序列序列比對和驗證，利用NCBI 網(wǎng)站的⑶-Search服務來分析核苷酸序列的特異性。
SEQ NO. 1抗病毒蛋白基因的核苷酸序列序列表SEQ NO. 1<110> 姜國勇<120>—種植物抗病毒蛋白基因的克隆<140>專利申請?zhí)?lt;141>2009-12-16<170>Patent In Version 2.1<210>1
<211>2607<212>DNA<213>pMD-18/Tm-cf<220><221>misc_feature<222>(1). · · (2607)<223>n = a 或 g 或 c 或 t<220><221>insertion<222>(289). . . (300)<220><221>insertion<222>(316). . . (333)<220><221>gene(Kan resistance)<222>(1). · · (2607)<311><400>(1). . . (2607)ATGGCTGAM TTCTTCTTAC ATCAGTCATC MTAMGCTG TAGATATAGC TGGAMTCGA 60CTCTTTCMG MGGMCGCA TTTGTATTCT TTGAMGATG ACATCGMTG GCTCCAGAGA 120GAMTGAGM GCATGTGAGC ATACATCGAT GACGCAMGG AAMGGCMC TGGAGGTGAC 180TCMGGGTGA AAMCTTGAT AAMCATATT CMGMCTGG CATGTGGTGC GGAGGATCTC 240TTAGATGAGT TTCTTCCAM MTTCMCM TCCMCMGT GCAMGGCGC MTCTGTTGT 300TGCCTTMGA CTGTTTGCAT CCCTTCTTGT GCTTCTTTTG CCMTGAGTT TTCTATGGAG 360ATCGAGMGA TAMGAAMG GGTTGTTGAC ATTCACCGTT TMGGACMC TTACMCATT 420GTAGATACM GTMCMCM TMTGATTGC ATTCCATTGG ACCGGAGMG ATTATTCCTT 480TATGCTGATG AMCAGAGGT CATCGGCTTG GATGATGACT TCMTATGCT ACMGCCAM 540TTACTTGATC CAGATTTGCC TTATGGAGTA GTTTCCATAG TTGGCATGCC CGGTCTGGGG 600MMCMCTC TTGCCMGM ACTCTATAGG CATGTCCGTG ATCMTTTGA GTGTTCGGGA 660CTGGTCTATG TGTCGCMCA ACCMGAGAG AGAGAMTCT TACTTGACAT ATCCAMCM 720GTTGGAGTGA CAGMGAGGA MGGAMGAT MCTTGGAGG ACMCCTAM ATCCCTATTG 780
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1.一種植物的抗病毒蛋白基因，其特征在于所述的抗病毒蛋白基因Tm-Cf的核苷酸 序列為SEQ NO. 1所示的2607bp。
2.一種含有抗病毒蛋白基因的重組質粒，并在大腸桿菌(E.Coli)DH5a獲得克隆菌株 pMD/Tm-cf，該菌株含有克隆獲得的抗病毒蛋白基因Tm-cf，該菌株擁有保藏號。
3.所述抗病毒基因具有CC-NBS-LRR蛋白特征；其長度為2607bp中的N端第289_300bp 和第316-333bp處分別含有12和18個堿基的插入，其核苷酸序列分別為GCAATCTGTTGT和 TGCATCCCTTCTTGTGCT。
4.一種植物的抗病毒蛋白基因的克隆技術和方法，其技術特征1)引物設計；2)CTAB 法DNA提取；3)載體克隆；4)反轉錄的cDNA驗證；5)同源基因的核苷酸序列序列比對和驗 證。
5.使用經(jīng)過核苷酸序列的修飾以及一個或數(shù)個堿基改變的抗病毒蛋白基因，并且具有 與SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都屬于本專利的發(fā)明內容和保護范圍。
全文摘要
本發(fā)明通過改進的DNA克隆技術和基因重組技術，將一種辣椒的抗病毒蛋白基因從辣椒(Capsicum frutescens var)葉片中分離出來，該發(fā)明屬于生物農藥合成工程技術領域。本發(fā)明克隆了一種抗病毒蛋白基因，并在大腸桿菌中表達了該基因。該基因片斷的核苷酸序列為SEQ N0.1所示的長度從ATG到TGA為2607bp。該質粒經(jīng)轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α獲得克隆菌株pMD/Tm-cf，并獲得保藏號。本發(fā)明的技術特點一是從辣椒葉片中分離抗病毒蛋白基因；二是通過大腸桿菌表達了抗病毒蛋白基因；三是該基因克隆的方法是基因重組克隆技術；四是該基因經(jīng)過重組技術可以獲得生物農藥。
文檔編號C12R1/19GK102102105SQ20091025566
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權日2009年12月16日
發(fā)明者姜國勇 申請人:姜國勇