恒河猴ny-eso-1蛋白、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，涉及源自恒河猴腫瘤抗原NY-ESO-1蛋白、其編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明所述的恒河猴NY-ESO-1蛋白可用于制備抗腫瘤疫苗，編碼該蛋白的基因可用于制備抗腫瘤核酸疫苗；上述抗腫瘤疫苗或核酸疫苗可融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、γ干擾素、白介素2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β4等一種或多種細(xì)胞因子或微生物的成分作為免疫佐劑；所述的恒河猴NY-ESO-1蛋白可與其它源自恒河猴的腫瘤-睪丸抗原聯(lián)合免疫或制備多價(jià)亞單位疫苗。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物或疫苗，為抗腫瘤免疫治療提供了一種新手段，應(yīng)用前景廣闊。
【專(zhuān)利說(shuō)明】恒河猴NY-ES0-1蛋白、其編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，涉及源自恒河猴腫瘤抗原NY-ES0-1蛋白、其編碼基因及應(yīng)用，特別涉及包含衍生自恒河猴腫瘤抗原NY-ES0-1中的抗原的多肽和載體。
【背景技術(shù)】
[0002] NY-ES0-1是1997年由Chen等人使用重組cDNA文庫(kù)血清學(xué)分析法(Serologicalanalysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX)篩選來(lái)自食管癌組織的cDNA表達(dá)文庫(kù)而發(fā)現(xiàn)的；NY-ES0_1屬于腫瘤-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen, CT)家族，在正常人中其表達(dá)僅限于睪丸、卵巢及胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，在其它成年體細(xì)胞組織中不表達(dá)(Simpson, Nat.Rev.Cancer,5(8):615-625 (2005);Chen, PNAS USA, 1997，94(5):1914-1918;Lethe, Int J Cancer, 1998，76(6):903-908)。
[0003]研究顯示，人源(Homo sapiens) NY_ES0_1在多種組織類(lèi)型腫瘤中呈不同程度的表達(dá)，包括但不限于神經(jīng)母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、卵巢上皮癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、食管癌和子宮癌等(Nicholaou T, Tmmunol Cell Biol.2006Jun;84(3):303-17; Jungbluth, Int.J.Cancer,2001, 92(6):856-860;Odunsi, Cancer Res, 2003, 63:6076-6083;Perez, Int.J.Cancer, 2008, 123:1551-1555)。NY-ESO-1抗原在癌癥患者中引起較強(qiáng)的免疫原性，因而被廣泛應(yīng)用于腫瘤疫苗的開(kāi)發(fā)，在腫瘤治療中配合手術(shù)及放療、化療等手段，能有效的限制癌組織的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。
[0004]有研究報(bào)道，所述NY-ES0-1既能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，又能激活⑶4+T和⑶8+T淋巴細(xì)胞，血清NY-ES0-1抗體陽(yáng)性的患者中超過(guò)90%會(huì)產(chǎn)生NY-ES0-1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Jager，PNAS USA2000 (9): 4760-4765)。NY-ES0-1的強(qiáng)免疫原性可能與它存在多個(gè)能被人白細(xì)胞抗原(HLA)識(shí)別的表位有關(guān)。目前，已經(jīng)鑒定出多條HLA-1類(lèi)和HLA-1I類(lèi)限制的妝(Jager, J.Exp, Med, 1998，187 (2): 265-270; Yamaguchi, Clinical Cancer Res.,2004, 10(3):890-961;Davis, PNAS USA, 2004, 101(29): 10697-10702)。在臨床試驗(yàn)中，具有對(duì)于HLA-A2的結(jié)合基序的3種部分重疊的NY-ES0-1衍生肽(pl57_165、pl57_167和P155-163)已在疫苗中使用，用于治療表達(dá)NY-ES0-1的轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者；上述研究證實(shí)，合成NY-ES0-1肽可安全地使用，且能產(chǎn)生潛在有利的T細(xì)胞應(yīng)答(Jager，PNASUSA 2000(9):4760-4765)。國(guó)內(nèi)外對(duì)NY-ES0-1疫苗在多種腫瘤中的免疫治療臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道包括:多肽疫苗和全長(zhǎng)蛋白疫苗；如，Odunsi K等人將多肽NY-ES0-lpl57-170與不完全弗氏佐劑聯(lián)合使用作為疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗可誘導(dǎo)多數(shù)患者產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞反應(yīng)，部分患者在接種后I年仍可檢測(cè)出特異性T細(xì)胞反應(yīng)，且在所報(bào)告的治療過(guò)程中，除接種部位的紅腫、疼痛之外，尚未發(fā)現(xiàn)與試驗(yàn)疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)(Odunsi，PNASUSA, 2007，104:12837-12842)。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了恒河猴(Macaca mulatta)基因組已于2007年完成測(cè)序(Gffeinstock, Science 2007, 13; 316 (5822):222-34.)，與人(Homo sapiens)基因組同源性約為93%。據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(Center of Biotechnology Information,網(wǎng)址http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，NY-ESO-1僅在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中有高度同源性mRNA表達(dá)，其中恒河猴NY-ES0-1的mRNA與人源NY-ES0-1同源性為87%，蛋白同源性為89%。本發(fā)明擬研究開(kāi)發(fā)恒河猴NY-ES0-1全蛋白潛在的腫瘤疫苗價(jià)值，及其含有的未知的HLA-1和HLA-1I限制性多肽表位，期望含有恒河猴NY-ES0-1基因的核酸疫苗將具有抗腫瘤免疫治療的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新的來(lái)源于恒河猴(Macaca mulatta)的NY-ES0-1蛋白。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種新的恒河猴蛋白基因NY-ES0-1。
[0008]具體的，本發(fā)明所述的來(lái)源于恒河猴的NY-ES0-1蛋白，為具有以下氨基酸序列之一的多肽:
[0009](I)具有序列表SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0010](2)序列表SEQ ID NO:1氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:1蛋白質(zhì)序列相同活性的、由SEQ ID NO:1衍生的蛋白質(zhì)，且所述的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有90%以上同源性。
[0011]本發(fā)明所述的恒河猴NY-ES0-1基因，其核苷酸序列為以下核苷酸序列之一:
[0012](I)序列表中SEQ ID N0:2的核苷酸序列；
[0013](2)編碼具有序列表 SEQ ID NO:1蛋白質(zhì)活性多肽的核苷酸序列，且所述的核苷酸序列與SEQ ID: 2具有90%以上同源性；
[0014](3)與序列表中SEQ ID NO:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0015]本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體，及含有該重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；其中，所述重組表達(dá)載體包含核酸分子，該核酸分子為編碼所述恒河猴蛋白、具有所述核苷酸序列；所述宿主細(xì)胞由上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[0016]本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體優(yōu)選真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO,其通過(guò)下述的方法構(gòu)建，包括步驟:
[0017]設(shè)計(jì)引物
[0018]rES0-Fl:5’ -CCCTCTAGATCACCATGCAGGCTGCAGGCCAG-3’
[0019]rESO-Rla:
[0020]5， -CTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCGCGCCTTTGTCCTGAGGG-3，
[0021]rE0S-Rlb:
[0022]5，-CCCGGATCCTCATTACTCGAGCCCGGGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTT-3’
[0023]以pMD19T-rNY-ES0-l為模板，擴(kuò)增恒河猴NY-ES0-1連接3FLAG標(biāo)簽的片段，克隆至真核表達(dá)載體pCMVTNT (Promega)上，測(cè)序鑒定，使用QIAGEN公司EndoFree PlasmidGiga Kit (Catalog N0.12391)提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞及動(dòng)物免疫；使用Thermo公司Nanodrop 1000測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，質(zhì)粒用PBS稀釋至I μ g/ μ I ;制得真核表達(dá)載體 pCMVTNT-rESO。
[0024]本發(fā)明還提供了一種表達(dá)所述蛋白的方法，其包括步驟:將所述含有編碼恒河猴NY-ES0-1基因的重組表達(dá)載體倒入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而表達(dá)恒河猴NY-ES0-1蛋白；
[0025]所述宿主可為任意可表達(dá)外源基因的原核或真核細(xì)胞，如大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞等；所述大腸桿菌可為E.coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)、E.coliToplO、E.coli JM109等；所述真核細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞，包括HEK293T、C0S-7、CH0、Vero, HeLa 和 Sf9 等；
[0026]本發(fā)明中，用于構(gòu)建含有編碼恒河猴NY-ES0-1蛋白的基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體可為PET載體系列、pQE載體系列、pGEX載體系列與IMPACT?系統(tǒng)等；
[0027]本發(fā)明中，用于構(gòu)建含有編碼恒河猴NY-ES0-1蛋白的基因的重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pcDNA3.1、pCMVTNT、pSVl.0等；
[0028]本發(fā)明中，表達(dá)載體和表達(dá)菌株或細(xì)胞系均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
[0029]本發(fā)明所述的恒河猴NY-ES0-1蛋白可用于制備抗腫瘤疫苗，編碼該蛋白的基因可用于制備抗腫瘤核酸疫苗；所述的抗腫瘤疫苗或核酸疫苗可加入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、Y干擾素(IFN-Y )、白介素2(IL-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0 4(TGF_3 4)等一種或多種細(xì)胞因子或微生物的成分(CpG、霍亂毒素、脂蛋白、脂質(zhì)A)作為免疫佐劑。
[0030]本發(fā)明所述的恒河猴NY-ES0-1蛋白可與其它源自恒河猴的腫瘤-睪丸抗原聯(lián)合免疫或制備多價(jià)亞單位疫苗。
[0031]本發(fā)明提供了恒河猴NY-ES0-1蛋白及其編碼基因，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述的蛋白在BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體，并能刺激T細(xì)胞免疫反應(yīng)；本發(fā)明為抗腫瘤免疫治療提供了一種新手段，應(yīng)用前景廣闊。
[0032]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種蛋白，其包含恒河猴NY-ES0-1蛋白及其片段，或包括恒河猴NY-ES0-1蛋白的一個(gè)或是多個(gè)表位的片段；
[0033]其中，所述恒河猴NY-ESO-1蛋白選自全長(zhǎng)恒河猴NY-ESO-1蛋白、部分截短的恒河猴NY-ESO-蛋白I或截短的恒河猴NY-ES0-1蛋白或其任何片段，所述片段包括恒河猴NY-ES0-1蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位；所述恒河猴NY-ES0-1蛋白與天然存在的恒河猴NY-ES0-1蛋白至少90%以上等同；
[0034]上述蛋白進(jìn)一步包含親和標(biāo)記物；所述親和標(biāo)記物為包含1-10個(gè)組氨酸殘基的組氨酸尾，或包含重組Flag標(biāo)簽DYKDHD⑶YKDHDIDHKDDDDK ；
[0035]上述蛋白包含選自所述的氨基酸序列SEQ ID N0:1。
[0036]以及，提供了一種核酸分子，其編碼上述蛋白，為以下核苷酸序列之一:
[0037](I)包含但不限于選自下述的核苷酸序列:序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；
[0038](2)與序列表SEQ ID NO:2限定的DNA序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
[0039](3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下下可與序列表中SEQ ID N0:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0040]以及，提供了一種免疫原性組合物或疫苗，其包含上述蛋白、上述核酸分子或上述載體；該免疫原性組合物還可包含佐劑、和/或免疫細(xì)胞刺激因子或趨化因子；免疫原性組合物或疫苗中所述的蛋白存在于水包油或油包水乳劑媒介物中；所述免疫原性組合物或疫苗包含一種或多種佐劑:3-0-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A (3D-MPL)、QS21或CpG寡核苷酸；該免疫原性組合物或疫苗還可包含一種或多種其它抗原；所述的免疫原性組合物或疫苗可用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0041]更進(jìn)一步，本發(fā)明中所提供的蛋白、核酸分子、載體、免疫原性組合物或疫苗均可用于制備治療癌癥的藥物，所述癌癥包括乳腺黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、頭與頸癌包括食管癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃腸道癌、肝癌、腦腫瘤、白血病及各種肉瘤；還能用于治療對(duì)于Her2/neU靶向治療不合格的患者；
[0042]所述的蛋白、核酸分子、載體、免疫原性組合物或疫苗均可用于臨床癌癥診斷，所述的蛋白、核酸分子、載體、免疫原性組合物或疫苗可用于但不限于制備商品化診斷試劑盒、或ELISA試驗(yàn)中的包被抗原。
[0043]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1為自恒河猴腦、骨髓、骨骼肌、心肌、肺、肝、胃、脾、小腸、腎、前列腺、胸腺和睪丸組織cDNA中擴(kuò)增出的NY-ES0-1基因片段和內(nèi)參GAPDH基因片段的DNA凝膠電泳圖。
[0045]圖2為真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO示意圖。
[0046]圖3為真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后表達(dá)的恒河猴NY-ES0-1蛋白表達(dá)western blotting電泳圖。
[0047]圖4顯示了真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞在人源NY-ES0-1多肽刺激后，分泌Y干擾素的結(jié)果(總)。
[0048]圖5顯示了真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞在人源NY-ES0-1多肽刺激后，分泌Y干擾素的結(jié)果(陽(yáng)性肽段)。
[0049]圖6為真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后,血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特異性抗體的檢測(cè)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn):((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J., Russell, David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0051]本發(fā)明涉及的細(xì)胞HEK293T參見(jiàn)文獻(xiàn)Cannon SC等人，F(xiàn)unctional expressionof sodium channel mutations identified in families with periodic paralysis.Neuron, 1993，10(2):317-326。HEK293T細(xì)胞可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如可以從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌株收藏所ATCC購(gòu)得。
[0052]本發(fā)明涉及的表達(dá)載體pCMVTNT參見(jiàn)文獻(xiàn)Kohrer C等人，Complete set oforthogonal 21st aminoacyl-tRNA synthetase-amber, ochre and opal supperssor tRNApairs: concomitant suppression of three different termination codons in an mRNAin mammalian cells.Nucleic Acids Res.，2004，32 (21):6200_6211。表達(dá)載體 pCMVTNT可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如，可從美國(guó)Promega公司購(gòu)得。
[0053]本發(fā)明所用引物及測(cè)序工作均由上海博尚生物工程有限公司完成。
[0054]本發(fā)明涉及的BALB/c小鼠由中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心下轄上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。
[0055]實(shí)施例1、檢測(cè)及克隆恒河猴組織中的恒河猴NY-ESO-1蛋白基因
[0056]1、提取恒河猴組織總RNA
[0057]取離體的恒河猴腦、骨髓、骨骼肌、心肌、肺、肝、胃、脾、小腸、腎、前列腺、胸腺和睪丸組織，按常規(guī)方法處理，如包括液氮處理，無(wú)菌處理等，使用QIAGEN公司RNeasy PlusMini Kit (Catalog N0.74104)提取組織 RNA。
[0058]2、合成恒河猴組織cDNA片段及檢測(cè)NY-ES0-1
[0059]用SuperScript?III First-Strand Synthesis System (Catalog N0.18080-051)系統(tǒng)合成恒河猴各組織cDNA第一鏈，作為NY-ES0-1基因檢測(cè)PCR模板；根據(jù)Genebank公布的恒河猴基因組序列，設(shè)計(jì)引物如下:
[0060]rES0-F:5’ -GGGATGCAGGCTGCAGGCCAGGGC-3’
[0061 ] rESO-R: 5，-GGTTAGCGCCTTTGTCCTGAGGGA-3，
[0062]內(nèi)參GAPDH引物:
[0063]GAPDH-FI40 :5， -GTATTGGGCGCCTGGTCACC-3’
[0064]GAPDH-R766:5， -GGATGACCTTGCCCACAGCC-3’
[0065]對(duì)恒河猴各組織cDNA擴(kuò)增，在所有組織中得到627bp的GAPDH片段，在且僅在睪丸組織中得到約550bp大小的特異性片段，結(jié)果如圖1所示。
[0066]3、克隆恒河猴 NY-ES0-1
[0067]分離純化該特異性片段，并與pMD19T_easy (takara)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pMD19T-rNY-ES0-l，酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。得到561bp片段在Genebank上運(yùn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與恒河猴Macaca mulatta的cancer/testis antigen IA 序列完全相同，和人 Homo sapiens NY-ESO-l 基因序列 87% 同源。證實(shí)該特異性片段為恒河猴NY-ES0-1。
[0068]4、鑒定恒河猴NY-ES0-1全長(zhǎng)mRNA
[0069]使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Catalog 634914)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，得到恒河猴NY-ES0-1的mRNA全長(zhǎng)序列。
[0070]實(shí)施例2、構(gòu)建及鑒定真核表達(dá)載體[0071 ] 1、構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO
[0072]設(shè)計(jì)引物
[0073]rES0-F 1:5’ -CCCTCTAGATCACCATGCAGGCTGCAGGCCAG-3’
[0074]rESO-Rla:
[0075]5， -CTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCGCGCCTTTGTCCTGAGGG-3，
[0076]rE0S-Rlb:
[0077]5，-CCCGGATCCTCATTACTCGAGCCCGGGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTT-3’[0078]以pMD19T-rNY-ES0-l為模板，擴(kuò)增恒河猴NY-ES0-1連接3FLAG標(biāo)簽的片段，克隆至真核表達(dá)載體pCMVTNT (Promega)上，測(cè)序鑒定，使用QIAGEN公司EndoFree PlasmidGiga Kit (Catalog N0.12391)提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞及動(dòng)物免疫；使用Thermo公司NanodroplOOO測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度,質(zhì)粒用PBS稀釋至I μ g/ μ I ;得到質(zhì)粒，其圖譜如圖2所示。
[0079]2、鑒定真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO
[0080](I)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0081]Lipofectamine2000每孔1.5 μ 1，溶解在100 μ I無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min ；pCMVTNT-rESO質(zhì)粒或pCMVTNT空載體每孔2 μ g溶解在100 μ I DMEM培養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5min ;兩者混合均勻，室溫孵育20min。HEK293T細(xì)胞用無(wú)血清DMEM洗滌兩次后，加入孵育過(guò)的混合物，放入5%C02孵箱37°C培養(yǎng)4_6h。補(bǔ)充培養(yǎng)基，使其成為DMEM含10%小牛血清和1%PS抗生素完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，PBS洗漆一遍后，用200μ1 RIPA裂解液處理5min,用于western blotting檢測(cè)。
[0082](2)免疫印跡雜交法(western blotting)檢測(cè)
[0083]以Monoclonal ANT1-FLAG?M2 antibody produced in mouse(Sigma-Aldrich 公司，Catalog N0.F1804)和 Mouse Ant1-beta actin Monoclonal Antibody(北京中杉金橋,Catalog N0.TA-O9)作為一抗，Peroxidase-Conjugated AffiniPure Goat Ant1-Mouse IgG(北京中杉金橋，Catalog N0.ZB-2305)作為二抗,western blotting 檢測(cè)恒河猴 NY-ES0-1蛋白的表達(dá)；檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。
[0084]實(shí)施例3、真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后，脾細(xì)胞分泌Y干擾素分析`
[0085]1、真核表達(dá)載體免疫BALB/c小鼠
[0086]將BALB/c小鼠分為兩組，空載體組3只，實(shí)驗(yàn)組5只。取去內(nèi)毒素質(zhì)粒pCMVTNT-rESO和pCMVTNT空載體，按照每只小鼠100 μ g DNA的量分別于第0、2、4、7周小鼠后肢脛前肌注射。
[0087]2、小鼠脾細(xì)胞分離
[0088]于第10周將小鼠眼球取血后頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下分離脾淋巴細(xì)胞。用1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清，1%PS抗生素)重懸。
[0089]3、ELISP0T檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞分泌Y干擾素
[0090]操作參照BD Mouse IFN-Y ELI SPOT Kit (BD 公司，Catalog N0.551083)說(shuō)明，具體步驟如下:
[0091](I)處死小鼠前I天，ELISP0T平板每孔加入100 μ I包被抗體，4°C過(guò)夜；
[0092](2)1640完全培養(yǎng)基200 μ I洗滌2次，加入1640完全培養(yǎng)基200 μ I/孔，室溫封閉2h ；
[0093](3)棄封閉液，將分離的小鼠脾細(xì)胞按2X IO5/孔加入ELISP0T板中，實(shí)驗(yàn)孔加入合成的人源NY-ES0-1多肽(共42條肽段，每條肽段15氨基酸)4μ g/ml，陽(yáng)性孔加入PMA(終濃度50ng/ml)和ionomycin (終濃度I μ g/ml),空白對(duì)照孔不加；補(bǔ)充1640完全培養(yǎng)基至 100 μ 1，5%C02 培養(yǎng)箱 37 °C 20h ；
[0094](4)棄細(xì)胞，每孔加入去離子水浸泡，PBST洗滌3次；[0095](5)每孔加入 100 μ I 生物素標(biāo)記 INF- Y 抗體(biotinylated detectionantibody),室溫孵育 2h ；
[0096](6) PBST洗滌3次，每孔加入100 μ I親和素偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶，室溫孵育Ih ；
[0097](7) PBST洗滌4次，PBS洗滌2次，拍干，每孔加入100 μ I顯色底物，室溫避光孵育 30min ；
[0098](8)出現(xiàn)斑點(diǎn)后用自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)。干燥后，用ELISP0T讀板儀(賽智公司，ChampSpot III)計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)每孔有反應(yīng)的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spot Forming Cells, SFCs),結(jié)果換算成SFCs/106個(gè)脾細(xì)胞(結(jié)果如圖5、圖6所示)；
[0099](9)分析反應(yīng)結(jié)果陽(yáng)性的肽段共6段，序列如下，
[0100]刺激真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞分泌Y干擾素的6條肽段:
[0101]N0.23:EFYLAMPFATPMEAE (Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro MetGlu Ala Glu),
[0102]N0.24:AMPFATPMEAELARR(Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Phe Ala Glu LeuAla Arg Arg),
[0103]N0.29:APPLPVPGVLLKEFT(Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Glu Val Leu Leu LysGlu Phe Thr),
[0104]N0.30:PVPGVLLKEFTVSGN(Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr ValSer Gly Asn),
[0105]N0.34:LTIRLTAADHRQLQL(Leu Thr He Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg GlnLeu Gln Leu),
[0106]N0.35:LTAADHRQLQLSISSCLeu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu SerHe Ser SerX
[0107]實(shí)施例4、檢測(cè)真核表達(dá)載體pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后，血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特異性抗體
[0108]1、免疫小鼠血清分離
[0109]小鼠處死后眼球取血約500 μ 1，置37 °C孵育lh，4°C、5000g離心20分鐘，取上層血清約100 μ I，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠血清混合，1:50稀釋待用；
[0110]2、小鼠血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特異性抗體的免疫印跡雜交法(westernblotting)檢測(cè)
[0111]以1:50 稀釋后小鼠混合血清和 Mouse Ant1-beta actin Monoclonal Antibody(北京中杉金橋，Catalog N0.TA-09)作為一抗，Peroxidase-Conjugated AffiniPure GoatAnt1-Mouse IgG (北京中杉金橋，Catalog N0.ZB-2305)作為二抗,western blotting 檢測(cè)恒河猴NY-ES0-1蛋白的表達(dá)(檢測(cè)結(jié)果如圖6所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，其包含恒河猴NY-ESO-1及其片段，或包括恒河猴NY-ESO-1的一個(gè)或是多個(gè)表位的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.按權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的恒河猴NY-ES0-1選自:全長(zhǎng)恒河猴NY-ES0-1、部分截短的恒河猴NY-ES0-1或截短的恒河猴NY-ES0-1或其任何片段，所述片段包括恒河猴NY-ES0-1的一個(gè)或多個(gè)表位。
3.按權(quán)利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括所述恒河猴NY-ES0-1及與其90%以上同源的天然存在或人工突變的恒河猴NY-ES0-1。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含親和標(biāo)記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白，其特征在于，所述親和標(biāo)記物是包含1-10個(gè)組氨酸殘基的組氨酸尾，或包含重組Flag標(biāo)簽DYKDHD⑶YKDHDIDHKDDDDK。
6.一種核酸分子，其特征在于，其編碼權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的蛋白，是下述核苷酸序列之一: 1)包含但不限于選自下述的核苷酸序列:序列表中SEQID NO: 2的DNA序列； 2)與序列表SEQID NO: 2限定的DNA序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； 3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下下可與序列表中SEQID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.一種載體，其特征在于，其包含權(quán)利要求6的核酸分子，所述載體包括但不限于真核表達(dá)質(zhì)粒載體、原核表達(dá)載體、病毒載體或細(xì)菌載體。
8.一種真核細(xì)胞，其特征在于，其用權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化，所述真核細(xì)胞包括但不限于真核細(xì)胞293T、Vero、從人或動(dòng)物體內(nèi)分離的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DC)與其他抗原遞呈細(xì)胞、體外誘導(dǎo)產(chǎn)生或人工制作的抗原遞呈細(xì)胞。
9.一種真核細(xì)胞，其特征在于，其用權(quán)利要求1-5中蛋白與多肽孵育過(guò)的抗原遞呈細(xì)胞，包括但不限于樹(shù)突狀細(xì)胞DC。
10.一種免疫原性組合物或疫苗，其特征在于，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的蛋白、權(quán)利要求6的核酸分子、權(quán)利要求7的載體或權(quán)利要求8-9的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物或疫苗，其特征在于，所述的免疫原性組合物還包含顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、Y干擾素(IFN-Y )、白介素2(IL-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β4 (TGF-β 4)等一種或多種細(xì)胞因子或微生物的成分，如CpG寡聚核苷酸、霍亂毒素、脂蛋白、脂質(zhì)A作為免疫佐劑。
12.如權(quán)利要求10或11所述的免疫原性組合物或疫苗，其特征在于，其中所述蛋白存在于水包油或油包水乳劑媒介物中。
13.如權(quán)利要求10-11中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或疫苗，其特征在于，其還包含一種或多種其它抗原。
14.權(quán)利要求1-5的蛋白、或權(quán)利要求6的核酸分子、或權(quán)利要求7的載體、或權(quán)利要求10-13的免疫原性組合物或疫苗在制備治療癌癥的藥物中的用途，所述癌癥例如乳腺黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、頭與頸癌包括食管癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃腸道癌、肝癌、腦腫瘤、白血病及各種肉瘤。
15.如權(quán)利要求14的用途，其特征在于，所述的藥物包括但不限于與其它治療癌癥藥物或手術(shù)、放療、化療治療方案聯(lián)合使用。
16.如權(quán)利要求14用途，其特征在于，所述的藥物用于治療對(duì)于Her2/neu靶向治療不合格的患者。
17.權(quán)利要求1-5的蛋白、或權(quán)利要求6的核酸分子、或權(quán)利要求7的載體、或權(quán)利要求8與9的細(xì)胞、或權(quán)利要求10-13的免疫原性組合物或疫苗在制備診斷癌癥的制劑中的用途，所述的診斷癌癥的制劑包含但不限于商品化診斷試劑盒或ELISA試驗(yàn)中的包被抗原。
18.權(quán)利要求1-5的蛋白、或權(quán)利要求6的核酸分子、或權(quán)利要求7的載體、或權(quán)利要求8與9的細(xì)胞、10-13的免疫原性組合`物或疫苗在制備單克隆抗體中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103483441SQ201210189590
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月10日
【發(fā)明者】徐建青, 曾剛, 周明哲, 徐軍 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)