專利名稱：：N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其生產(chǎn)方法與專用重組菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其生產(chǎn)方法與專用重組菌。
背景技術(shù)：
：N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acy1-homoserinelactone)，簡稱AHL，是一種環(huán)狀內(nèi)酯類小分子物質(zhì)，由一個(gè)相同的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和一個(gè)不同碳鏈長度的?；鶄?cè)鏈組成。AHLs是許多革蘭氏陰性細(xì)菌合成的自誘導(dǎo)物，是細(xì)菌細(xì)胞通訊中的一類重要的信號物質(zhì)，廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中，參與調(diào)控多種致病基因的表達(dá)。AHLs可以透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞與環(huán)境之間以及細(xì)胞之間擴(kuò)散，當(dāng)環(huán)境中的細(xì)菌達(dá)到一定的數(shù)量，AHLs積累到一定濃度，AHLs重新返回細(xì)菌胞內(nèi)，與相關(guān)受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，引起細(xì)菌間的群體感應(yīng)現(xiàn)象。許多人類和動植物的病原菌的致病性依賴于AHLs的群體感應(yīng)現(xiàn)象，如可使人患病的銅綠假單胞桿菌(WatersCMandBasslerBL，AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology.21:319-346);水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要致病菌費(fèi)氏弧菌、嗜水氣單胞菌等；食品腐敗中的食源假單胞菌(AustinBJandAllen-AustinD，JournalofAppliedBacteriolog.y58:483-506);以及導(dǎo)致植物腐敗的胡蘿卜歐文氏菌等諸多致病菌的致病性均依賴AHLs調(diào)控的群體感應(yīng)現(xiàn)象(VonBodmanSB，etal.Annualreviewofphytopathology.41:455-482)。因此，降解AHLs，切斷菌間交流，進(jìn)而破壞群體感應(yīng)系統(tǒng)，可以達(dá)到控制毒性因子表達(dá)的目的，這可能成為一種可行的防病策略。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酉旨酶(N_acyl_homoserinelactonase，AHL-lactonase)是一類能夠降解AHLs的水解酶，該酶將信號分子的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)切開，生成?；母呓z氨酸內(nèi)酯。對N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的研究開始于本世紀(jì)初，2000年，Yi-HuDong首次芽胞桿菌中克隆N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯水解酶-aiiA。研究表明N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因的轉(zhuǎn)基因植物提高大白菜抗病原菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌感染的能力(DongYH，etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.97:3526-3531);aiiA類基因?qū)爰?xì)菌中如銅綠假單菌(PseudolnonasaerugjnosaPA01)中表達(dá)，大大減弱AHL信號分子的數(shù)量，顯著抑制某些毒性因子和細(xì)胞毒素的產(chǎn)生(ReimmannC，etal.Microbiology.148:923-932);aiiA類基因在大腸桿菌原核系統(tǒng)活性表達(dá)，并有效提高植物抗病能力(DongYH，etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97:3526-3531)。但是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中如畢赤酵母表達(dá)中鮮有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白，命名為AiiA_B546，是一種N_?；呓z氨酸內(nèi)酯酶。本發(fā)明提供的蛋白是序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因命名為aiia-B546，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。3本發(fā)明提供的基因來源于芽孢桿菌(Bacillussp.)B546CGMCC3228(已于2009年09月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)。上述基因具體是如下1)或2的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5'端第1位-第750位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的基因。含有所述基因的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組載體具體可以是將上述的基因插入pPIC9的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。含有上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組菌具體可以是將所述的基因通過所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中，得到的轉(zhuǎn)基因重組菌。上述重組菌具體是巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)AiiA-B546CGMCCN2.3369(已于2009年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)。任一所述的重組菌在生產(chǎn)所述蛋白AiiA-B546中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。任一所述的重組菌或者上述的蛋白AiiA-B546在水產(chǎn)養(yǎng)殖抗病性或水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。采用本發(fā)明的重組菌和方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，可高效表達(dá)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶，酶活高達(dá)3560U/ml。本發(fā)明將從Bacillussp.B546克隆到的AiiA基因連接pPIC9表達(dá)載體，將重組的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，進(jìn)行畢赤酵母高效表達(dá)，獲得重組蛋白AiiA-B546，并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。同時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵。重組蛋白AiiA-B546具有糖基化修飾，酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良。在6(TC處理30min后酶活保持在100%，在7(TC處理15min后仍剩余95%以上的酶活。AiiA_B546在中性和堿性條件下非常穩(wěn)定，具有很好的抗胰蛋白酶，a-糜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，膠原蛋白酶，堿性蛋白酶的水解的能力，并且底物具有廣譜性。本發(fā)明公開了一種具有良好熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性的畢赤酵母高效表達(dá)的重組N酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶。該重組N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶可以作為一種新型抗菌藥物和防腐劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和保藏。圖laiia-B546基因PCR擴(kuò)增電泳圖。1，對照；2，aiia-B546;M，lkbplusLadderDNAmaker。圖2活性平板法篩選陽性轉(zhuǎn)化子；CK，未經(jīng)酶液處理的對照；17、49和13為陽性轉(zhuǎn)化子酶液處理的樣品(其中13號酶活最高)。圖3酵母表達(dá)的重組酶AiiA-B546的純化；1，為酵母表達(dá)的重組AiiA_B546粗酶液(發(fā)酵液上清)；2，純化的重組AiiA-B546;3，純化的重組AiiA-B546N端脫糖基化；M，低分子量蛋白marker。圖4pH和溫度對N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶AiiAB546的影響；a，AiiA_B546的最適pH;b，AiiA-B546的pH穩(wěn)定性；c，AiiA_B546的最適溫度；d，AiiA_B546的溫度穩(wěn)定性。圖5各蛋白酶對重組酶AiiA-B546的影響。圖6發(fā)酵罐中酵母表達(dá)的重組酶AiiA-B546的SDS-PAGE分析；17分別為誘導(dǎo)12、36、60、84、108、132和156小時(shí)的發(fā)酵液上清。圖7發(fā)酵罐中的細(xì)胞濕重和單位酶活隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明中依賴的遺傳資源是芽孢桿菌(Bacillussp.)B546CGMCCNo3228由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所(北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號，郵政編碼100081)篩選并保存。該菌種按史曉柳等(史曉柳等，中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)。37:728-732)方法自池塘底泥(由周志剛，于2007年6月，采集自天津市武清區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站魚塘)分得。本發(fā)明中的其它材料如下1.菌株及載體畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及畢赤酵母(P.pastoris)GS115購自于Invitrogen公司。檢測菌株AgrobacteriumtumefaciensKYC55由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)朱軍教授饋贈，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是(ZhuJ，etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.69:6949-6953)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所已保存一份。pEASY-T3載體和EscherichiacoliTOP10購自北京全式金生物公司。2.酶類及其他生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，T4DNA連接酶連接酶和EndoH脫糖基化酶購NEB公司。實(shí)驗(yàn)中使用的底物包括C6-HSL(N-Hexanoyl-DL-homoserinelactone)，C8-HSL(N_0ctanoyl_DL_homoserinelactone)，C10-HSL(N_Decanoyl_DL_homoserinelactone)，C12-HSL(N_Dodecanoyl_DL_homoserinelactone)，3-0X0-C6-HSL(N_(P-Ketoc即royl)_L_homoserinelactone)，3_0X0_C8_HSL(N_(P-Ketooctanoyl)_L_homoserine)均購自Sigma公司。SDS-PAGE的LowMolecularWeightCalibrationKit購自GE公司。脫糖基化酶EndoH購自NEB公司。3.培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基O.5X酵母提取物，1.0X蛋白胨，1.0XNaCl，用Na0H調(diào)至pH7.0，(固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂)12rC滅菌15min。YPD培養(yǎng)基1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。匪固體培養(yǎng)基1.34%YNB，O.00004%生物素(Biotin)，0.5%甲醇，1.5%瓊脂。MD固體培養(yǎng)基1.34%YNB，O.00004%生物素(Biotin)，2%葡萄糖，1.5%瓊脂。BMGY培養(yǎng)基1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L磷酸緩沖液(p朋.0)，1.34%YNB酵母氮源，不含氨基酸(美國BD公司)，0.00004%生物素(Biotin)，l%(體積百分比)甘油。B匪Y培養(yǎng)基除了以0.5%(體積百分比)甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基26.7mlH3P04，0.93gCaS04*2H20，18.2gK2S04，14.9gMgS047H20，4.13gK0H，40.0g甘油(Glycerol)，定容至1L。PTM1:6.OgCuS04*51120，0.08gNa2I，3.OgMnS04，0.2gNa2Mo04*21120，0.02gH3B03，0.5gCoCl2*6H20，20.OgZnCl2，65.0gFeS047H20，0.2g生物素(Biotin)，5.Oml貼04，定容至IL，過濾除菌，室溫保存。說明本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來進(jìn)行，包括MolecularCloning,ALaboratoryManual(SambrooketJ，etal.VersionIII2001);GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(KrieglerM，1990);禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(AusubelM，etal.1994);PichiaExpressionKit(Invitrogen，VersionM)。實(shí)施例1基因工程重組菌的獲得1、N-?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶基因的克隆芽孢桿菌(Bacillussp.)B546CGMCCNo3228的基因組為模板，利用特異性引物BT1(5'-GCGGAATTCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTCG-3')和BT2(5'-ATAGCGGCCGCCTATATATACTCTGGGAACAC-3')(下劃線部分分別為EcoRI和NotI酶切位點(diǎn))，按如下條件進(jìn)行擴(kuò)征94°C5min;94。Clmin，58。C30s，72。Clmin，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。擴(kuò)增得到750bp左右的片段(見圖1中2)，將該片段回收后的連接pEASY-T3載體轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擴(kuò)增得到的片段具有序列表中序列2的自5'端第1位到753位所示的序列，其中，編碼區(qū)是自5'端第1位到750位，編碼序列l(wèi)所示的蛋白，將該蛋白的編碼基因命名為aiia-B546。2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建pPIC9載體和連有aiia-B546的pEASY-T3載體用EcoRI，Not1雙酶切片段，1\0脆連接酶后轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆子進(jìn)行測序，得到重組表達(dá)載體，命名為pPIC9-aiia-B546。3、基因工程重組菌的構(gòu)建測序正確的陽性克隆大量提取重組載體pPIC9-aiia-B546，BalII酶切使重組載體線性化，線性化的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母(P.pastoris)GS115。按PichiaExpressionKit中方法挑選并誘導(dǎo)陽性轉(zhuǎn)化子。通過Grametal.(GramL，etal.A卯liedandEnvironmentalMicrobiology.68:4111-4116)的方法對基因工程重組菌的N_?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶活性進(jìn)行檢測，酶活檢測方法如下配制200ii1的反應(yīng)體系，包括1y13-0X0-C8-HSL(以無水乙醇溶解為0.lmg/ml的溶液)，lOyl酶液和189iU的lxPBS(pH8.0)。以上體系在25°C反應(yīng)45min后加入50iU10%SDS終止反應(yīng)。對照以lOiilIO(TC失活5min的酶液代替?；钚云桨宸ò碐rametal.的方法制備的制備將3ml過夜培養(yǎng)的報(bào)告菌株KYC55與20ml含有1.5%瓊脂的LB混合，倒平板，凝固后打孔備用。取10上述反應(yīng)體系溶液加到活性平板的加樣孔中，3(TC培養(yǎng)24h，量取平板中藍(lán)色區(qū)域半徑。藍(lán)色區(qū)域半徑小，則N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯水解酶酶活性高。而N-?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶酶活性的定量結(jié)果還需根據(jù)信號分子6(3-0X0-C8-HSL)的質(zhì)量(y，yg)的對數(shù)和平板中藍(lán)色區(qū)域半徑(R，cm)的關(guān)系，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ln(y)=1.3809f-11.95，根據(jù)該方程計(jì)算酶活。一個(gè)酶活單位(U)定義為在pH8.025。C條件下，每分鐘降解lnmol3-0X0-C8-HSL所需要的酶量。通過上述方法將標(biāo)記為17號、49號和13號的陽性轉(zhuǎn)化子的上清液的酶活進(jìn)行定性檢測，結(jié)果如圖2所示，13號的陽性轉(zhuǎn)化子的藍(lán)色區(qū)域半徑最小，其N-?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶酶活性高，將13號陽性轉(zhuǎn)化子作為工程菌，用于以下實(shí)驗(yàn)。該工程菌是巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)AiiA-B546CGMCC漁.3369。已于2009年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3369。另制備出以下兩種菌作為對照1、空載體菌株按照獲得工程菌的方法，得到轉(zhuǎn)空表達(dá)載體的pPIC9的重組酵母菌，作為空載體對照。2、重組大腸桿菌菌株通過EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)將aiiAB546克隆到pET-22b(+)載體；L連接酶連接酶切后的基因和載體；電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞；通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆送上海生工測序；通過序列分析，得到正確轉(zhuǎn)化aiiAB546的重組大腸桿菌，作為大腸桿菌對照。實(shí)施例2AiiA-B546在P.pastorisAiiA-B546中的高效表達(dá)1、工程菌在搖瓶水平上的表達(dá)及其分析將上述工程菌、空載體菌株對照重新接種于裝有200mLBMGY培養(yǎng)基的1000mL三角瓶，30°C，250-280rpm搖床培養(yǎng)48h，3000Xg離心5min，棄上清(盡量將上清除盡)，沉淀細(xì)胞中加入200mL含有0.5%甲醇的B匪Y培養(yǎng)基，重新在25°C，250-280rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)，為補(bǔ)償甲醇的損失，在菌液中每隔12h補(bǔ)加甲醇溶液，使菌液中的甲醇濃度保持在0.5%，直至誘導(dǎo)72h，于12000Xg離心5min，按照實(shí)施例1中提供的方法測定上清酶活。將重組的大腸桿菌接種于加有Amp(100yg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至0D6。。=0.6-0.8，添加終濃度為lmM的IPTG，25°C、200rpm搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。收集菌體，重懸于lxPBS(pH8.0)，超聲波細(xì)胞破碎，于12000Xg離心10min，按照實(shí)施例l中提供的方法測定上清酶活。檢測工程菌株酶活為27.1U/ml發(fā)酵液，比原核表達(dá)(重組大腸桿菌表達(dá))的酶活(0.24U/ml發(fā)酵液)提高了111.7倍。試驗(yàn)中空載體對照組未檢測到酶活。2、酵母表達(dá)重組酶AiiA-B546的純化及蛋白分析搖瓶表達(dá)的上清液(工程菌培養(yǎng)72小時(shí)的上清)經(jīng)中空纖維(天津紡織工學(xué)院膜分離工程研究所)進(jìn)行濃縮并更換為低鹽緩沖液(pH8.0的20mMTris-HCl)。然后通過5kDa膜包(Sartorius，German)做進(jìn)一步的濃縮處理。濃縮后酶液用80%的硫酸氨使蛋白質(zhì)沉淀，沉淀物用pH8.0的20mMTris-HCl緩沖液溶解，透析過夜，通過PEG8000吸附透析袋中的水分。2mL的樣品上預(yù)先用20mM、pH8.0的Tris-HCl平衡的HiTr即QS印haroseXL陰離子柱(AmershamPharmaciaBiotech)。用NaCl(0-1M)鹽梯度洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，在0.3M的鹽梯度下，含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯水解酶的蛋白被洗脫下來，至此，得到純化后的AiiA-B546酶液。SDS-PAGE顯示，純化的酵母表達(dá)AiiA_B546蛋白(約35kDa)比理論分子量7(28.06kDa)偏大，可能存在糖基化修飾(圖3中2)。純化蛋白用EndoH脫糖基化酶進(jìn)行處理后分子量接近理論分子量(約28kDa)(圖3中3)，說明酵母表達(dá)AiiA_B546存在N糖基化修飾。從上述SDS-PAGE膠(圖3中2)中，切取約35kDa大小的條帶，送中科院微生物所進(jìn)行質(zhì)譜測序。結(jié)果表明有5段不相鄰的序列，與目的蛋白相匹配，說明此蛋白為表達(dá)的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶AiiA-B546。取以上純化后的AiiA-B546酶液，通過考馬斯亮藍(lán)法測定酶液中的蛋白含量，計(jì)算每mg蛋白中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活力，得到比活為3333U/mg。實(shí)施例3酵母表達(dá)AiiA-B546酶學(xué)性質(zhì)的研究酶促反應(yīng)體系除步驟4外，其余步驟中均以3-0X0-C8-HSL為底物，采用活性平板法測定N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶酶學(xué)性質(zhì)。本實(shí)施例所用酶液是實(shí)施例2純化后的AiiA-B546酶液。1、AiiA-B546的pH和溫度適應(yīng)性。經(jīng)純化的AiiA-B546在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0和5.8)，0.2M的磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.8、6.0、7.0和8.0)，50mMTris-HCL緩沖液(pH8.0和9.0)。純化的AiiA-B546在不同pH的緩沖體系，25t:下測定的pH適性結(jié)果如圖4a(以最高酶活為100X，其余pH的酶活與該最高酶活的比值為縱坐標(biāo))所示其的最適作用PH為8.0，p朋.5-8.5范圍內(nèi)，酶活性均能維持在80X以上，pH在5.0以下和9.0以上無法測得酶活。這說明該酶在中性范圍及附近均具有非常好的酶活性。將酶液在不同pH值的緩沖液中，包括50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，0.2M的磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0和7.0)，50mMTris-HCL緩沖液(pH8.0和9.0)，50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0、10.0U1.0和12.0)。于25。C下預(yù)處理lh，再測定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果如圖4b(以未經(jīng)過預(yù)處理的酶活定為100%，以經(jīng)過預(yù)處理的酶活與未經(jīng)預(yù)處理的酶活的比值為縱坐標(biāo))所示，AiiA-B546在pH7.0-12.0之間均很穩(wěn)定。最適溫度的測定在pH8.050mM的磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉緩沖體系中及不同的溫度(0、15、20、25、30、35、40、45、50、55和6(TC)下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果如圖4c所示(以最高酶活為100%，其余各溫度下測得的酶活與最高酶活的比值為縱坐標(biāo))，AiiA-B546的最適作用溫度2(TC，0。C及20-37。C，具有60%以上的酶活。測定AiiA-B546在不同的溫度(60。C和70°C)下分別保溫2、5、10、15、20、30和60min時(shí)的相對酶活力，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線。在5(TC下處理30min后酶活剩余約50%，熱穩(wěn)定性較好。酶反應(yīng)溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖4d所示(以不經(jīng)處理的酶測得的酶活為100%，以經(jīng)過預(yù)處理的酶活與未經(jīng)預(yù)處理的酶活的比值為縱坐標(biāo))，AiiA在6(TC下保溫60min，酶活性基本維持不變，7(TC下處理60min后，酶活仍在65^以上。說明該酶在6(TC和7(TC條件下，具有非常好的熱穩(wěn)定性。2、金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對酵母表達(dá)AiiA-B546酶活的影響在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質(zhì)終濃度分別為lmM和10mM。在25°C、pH8.0條件下測定酶活性。結(jié)果如表1所示。表l.不同金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對AiiA-B546的影響離子和化學(xué)相對酶活力(%)離子和化學(xué)相對酶活力(%)試劑終濃度終濃度試劑終濃度終濃度1raM10mM1函10raMCK100100ZnS0489.3109.5NaCl109.5104.6PbCL跳687.5KC1104.5109.3FeCl3104.8103.3LiCl115.465.8MnS04107.6112.1CaCl2106.5117.5AgN0300MgCl264.8108.4HgCl200CoCL118.5103.8SDS73.20CrCl329.149.6P-巰基乙醇112.292.0CuS0468.558.8EDTA66.5103.6NiS04103,4102.6表1中CK未加任何金屬離子或相關(guān)化學(xué)試劑，相對酶活是以CK的酶活為100%，其余處理的酶活與CK的酶活的比值。3、AiiA-B546抗蛋白酶的能力的研究將蛋白酶分別用下列溶液配制成lmg/mL的溶液用pH7.00.1MTris-HCl配制胰蛋白酶、a-糜蛋白酶溶液；用pH7.50.1MTris-HCl配制枯草桿菌蛋白酶、膠原蛋白酶溶液；用PHIO.O0.1M甘氨酸-NaOH配制堿性蛋白酶溶液。蛋白酶/N_?；呓z氨酸內(nèi)酯酶(質(zhì)量之比)"0.1，37"處理30和60min取樣，25"、pH8.0條件下保溫45min測定處理酶的剩余酶活。結(jié)果如圖5所示，用不同蛋白酶處理后AiiA-B546酶活沒有下降。因此，該酶對多種蛋白酶具有良好的抗性。4、AiiA-B546對不同底物的降解情況。本步驟酶活的測定方法與實(shí)施例l提供的酶活測定方法相同。不同之處在于將底物分別換成C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，3-0X0-C6-HSL。結(jié)果顯示AiiA-B546對C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，3-0X0-C6-HSL3-0X0-C8-HSL均可有效降解。實(shí)施例4AiiA-B546重組酵母菌株的高密度發(fā)酵重組酵母的高密度發(fā)酵是在3.7L的發(fā)酵罐(BioengineeringKLF2000，公司，公司所在城市，Switzerland).中進(jìn)行的，首先挑取產(chǎn)N_?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的高酶活陽性克隆，在YPD的液體酵母培養(yǎng)基中3(TC搖瓶培養(yǎng)48h獲得一級種子，一級種子接種到200ml的YPD的液體酵母培養(yǎng)基中3(TC過夜培養(yǎng)獲得二級種子，然后移至3.7L的發(fā)酵罐3(TC發(fā)酵，發(fā)酵罐中含有2L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，其中含有PTM1。(4.5mlPTM1/L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)I.接種。發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基在接種前首先加入28%氨水使培養(yǎng)基的pH達(dá)到5.O，然后每毫升培養(yǎng)基添加4.37mL的PTM1。5_10%接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18_24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌體的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量由100%逐漸降低。當(dāng)碳源消耗完后溶氧量會再度升高，當(dāng)溶氧升高至80%以上時(shí)，開始碳源添加階段。II.碳源添加階段。流加25%葡萄糖(12mL/LPTM1)，流加量為36mL/h/L，培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20%。III.碳源_甲醇混合添加階段。流加25%葡萄糖甲醇(8:1)培養(yǎng)4h，流加量為9mL/h/L，控制溶氧量始終大于20%。IV.誘導(dǎo)表達(dá)階段。加入誘導(dǎo)劑甲醇(12mL/LPTM1)，使甲醇的終濃度維持在0.3%，溶氧量始終大于20%。發(fā)酵12h后開始取樣，以后每隔24h取樣。測定樣品單位酶活及濕重(濕重是指每毫升發(fā)酵液含有的菌體量)。酶活測定方法按實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)方法。同時(shí)對不同時(shí)間點(diǎn)的取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。高密度發(fā)酵不同時(shí)間取樣單位酶活及濕重變化如圖6所示，隨著甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的延長，發(fā)酵上清液中AiiA-B546酶活力顯著增加。誘導(dǎo)132h后活性可達(dá)3560U/ml發(fā)酵液，菌體濕重達(dá)333g/L(圖6)，上清中累計(jì)蛋白達(dá)0.3mg/mL。高密度發(fā)酵不同時(shí)間取樣SDS-PAGE分析顯示(圖7)，蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而增加，在發(fā)酵132h時(shí)，蛋白表達(dá)量開始無明顯變化，此時(shí)細(xì)胞濕重增加變緩，發(fā)酵液的單位酶活開始下降。對AiiA-B546酵母工程菌在搖瓶水平和高密度發(fā)酵水平的最高表達(dá)酶活進(jìn)行測定和比較。結(jié)果顯示，AiiA-B546酵母高密度發(fā)酵酶活(3560U/ml)比搖瓶水平發(fā)酵酶活(27.1U/ml發(fā)酵液)提高了131倍。實(shí)施例5酵母表達(dá)AiiA-B546的應(yīng)用研究1、AiiA-B546在對Aeromonashydrophila引起的爆發(fā)性魚病的防控作用酵母高密度發(fā)酵的AiiA-B546酶液通過中空纖維將緩沖液置換為lxPBS(pH7.4)，濾滅。以80日齡錦鯉(長約4cm)作為實(shí)驗(yàn)動物，AeromonashydrophilaATCC7966作為攻毒菌株(實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證產(chǎn)生AHLs)。設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10尾魚，取10yl溶液進(jìn)行腹腔注射。其中，I-CK組只注射lxPBS;II-酶液組，注射終濃度為100U/ml的上述酶液；III-菌組，注射終濃度為108CFU/mlATCC7966菌體(pH7.41xPBS沖洗并重懸)；VI-酶液加菌組，同時(shí)注射終濃度為108CFU/mlATCC7966菌體和終濃度為100U/ml的上述酶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酵母高密度發(fā)酵表達(dá)的AiiA-B546單獨(dú)注射不會引發(fā)魚體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致其死亡，但是可以顯著延長ATCC7966攻毒實(shí)驗(yàn)動物的死亡時(shí)間降低死亡率。2、AiiA_B546對低溫保藏食品魚類的防腐作用上述處理的酶液按終濃度100U/ml噴灑于魚體(超市購買的活羅非魚)表面，4t:冰箱中放置，在3、7、14、21和28天時(shí)分別取lg魚肉檢測組胺含量和總菌數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AiiA-B546的加入可以使魚肉中的組胺含量和總菌數(shù)明顯下降。處理28d后，未加酶處理的魚肉腐敗變質(zhì)，失去彈性；酶液處理過的魚肉未腐敗，彈性良好，符合國家魚類的食用標(biāo)準(zhǔn)。0105]序列表0106]〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所0107]〈120>N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其生產(chǎn)方法與專用重組菌0108]〈160>20109]〈210>10110]0111]〈211>250〈212>PRT0112]〈213〉芽孢桿菌(Bacillussp.)0113]〈400>10114]MetThrValLysLysLeuTyrPheValProAlaGlyArgCysMetLeu0115]1510150116]AspHisSerSerValAsnSerThrLeuThrProGlyAsnLeuLeuAsn0117]2025300118]LeuProValTrpCysTyrLeuLeuGluThrGluGluGlyProlieLeu0119]3540450120]ValAspThrGlyMetProGluSerAlaValAsnAsnGluAsnLeuPhe0121]5055600122]AspGlyThrPheValGluGlyGinlieLeuProLysMetThrGluGlu0123]657075800124]AspArglieValAsnlieLeuLysArgValGlyTyrGluProGluAsp0125]8590950126]LeuLeuTyrlielieSerSerHisLeuHisPheAspHisAlaGlyGly0127]1001051100128]AsnGlyAlaPheThrAsnThrProlieLeuValGinArgAlaGluTyr0129]1151201250130]GluThrAlaGinHisSerGluGluTyrLeuLysGluCyslieLeuPro0131]1301351400132]AsnLeuAsnTyrLyslielieGluGlyAspTyrGluValValProGly0133]1451501551600134]ValGinLeuLeuTyrThrProGlyHisThrProGlyHisGinSerLeu0135]1651701750136]PhelieGluThrGluAsnSerGlyProValLeuLeuThrlieAspAla0137]1801851900138]SerTyrThrLysGluAsnPheGluAspGluValProPheAlaGlyVal0139]1952002050140]AspSerGluLeuAlaLeuSerSerlieLysArgLeuLysGlulieVal0141]21021522011<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求一種蛋白，是序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5'端第1位-第750位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的基因。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權(quán)利要求2或3所述的基因插入pPIC9的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。7.如權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求2或3所述的基因通過權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中，得到的轉(zhuǎn)基因重組菌。8.如權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是巴氏畢赤酵母(Pichi即astoris)AiiA-B546CGMCC漁3369。9.權(quán)利要求6-8任一所述的重組菌在生產(chǎn)權(quán)利要求1所述蛋白中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求6-8任一所述的重組菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖抗病性或水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其生產(chǎn)方法與專用重組菌。該蛋白是序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了一種工程菌，該工程菌是是上述蛋白的編碼基因?qū)氘叧嘟湍窯S115中，得到的重組菌。該重組菌經(jīng)過發(fā)酵，酶活可達(dá)4034.71U/ml。文檔編號C12N5/10GK101705212SQ200910238630公開日2010年5月12日申請日期2009年12月3日優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日發(fā)明者何夙旭,周志剛,姚斌,曹雅男,柏映國,石鵬君,陳瑞東,黃火清申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所