專利名稱：與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白BnLEC1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物中的脂肪酸又被稱為植物油，它廣泛存在于植物的種子中。植物油用途廣泛， 運(yùn)用生物技術(shù)改良植物體內(nèi)脂肪酸的組分和含量具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，遺傳工程技 術(shù)所選用的操作基因必需是植物體內(nèi)脂肪酸生物合成過程中的關(guān)鍵基因，但是目前人們對(duì) 于植物脂肪酸生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還不甚了解，因此，利用遺傳工程技術(shù)提高油料作 物含油量的工作目前進(jìn)展緩慢。以雙子葉模式植物擬南芥為例，植物的胚胎發(fā)生主要分為 兩個(gè)階段早期形態(tài)發(fā)生過程和晚期成熟過程。整個(gè)胚胎發(fā)育過程中伴隨著淀粉、蛋白質(zhì) 和脂肪酸等貯藏物質(zhì)的積累。在胚胎發(fā)育早期，主要是淀粉的大量積累，在組織和器官形 成以后，淀粉被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和脂肪酸。在發(fā)育的種子中，碳水化合物通過糖酵解途徑被分 解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體后再轉(zhuǎn)化成丙酮 酸和乙酰CoA，乙酰CoA作為底物參與脂肪酸的合成(Ruuska, S. A.，Girke, T.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. B. (2002). Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling. Plant Cell 14,1191-1206.)。在種子發(fā)育過程中，質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸合成酶復(fù)合物中的酶類負(fù)責(zé)脂肪酸的合成， 所合成的脂肪酸被導(dǎo)入胞質(zhì)?；鵆oA庫中以維持三酯酰甘油(TAG)積累。植物種子中的TAG 的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。TAG的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的過 程共需要三種?；D(zhuǎn)移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶 血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Ohlrogge 等，1979，Proc Natl Acad ki，USA，76 :1194-1198)。這三種?；D(zhuǎn)移酶催 化甘油骨架的逐步?；^程。近十余年來，科學(xué)家們對(duì)利用遺傳工程技術(shù)提高植物體 內(nèi)，特別是種子中的脂肪酸含量進(jìn)行了各種有益的探索。Shintani等在煙草中過量表達(dá) 了 ACCase的一個(gè)亞基-生物素羧化酶(BC亞基)，在煙草葉片中BC的表達(dá)水平提高了 3 倍，其它三個(gè)亞基的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，但脂肪酸的含量和組成也沒有明顯改變 (Shintani，D· , Roesler,K. ,Shorrosh,B.，Savage，L，and Ohlrogge,J. (1997). Antisense expression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves. Plant Physiol 114,881-886.)。另一項(xiàng)研究表明，增加丙酰CoA的含量能夠提高脂肪酸的含量。 Roeseler等利用種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子在油菜中過量表達(dá)擬南芥中的HO-ACCase基因， 結(jié)果使ACCase的活性明顯提高，種子中的含油量提高3-5% (Roesler，K.，Shintani, D.， Savage, L.，Boddupalli, S.，and Ohlrogge, J. (1997). Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds. Plant Physiol 113，75-81.)。Roeseler等的研究結(jié)果表明，丙酰CoA水平能夠提高脂肪酸的含量，但提高 幅度較小。Dechesh等將菠菜的KASIII基因在煙草中過量表達(dá)，結(jié)果使KASIII的酶活性提高了 100-300 倍，但脂肪酸的含量卻降低了 5-10% (Dehesh等，2001 ,Plant Physiol.，125 1103-1114)。上述研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)的脂肪酸代謝是一個(gè)復(fù)雜和高度協(xié)調(diào)的過程，通 過對(duì)脂肪酸代謝途徑中的個(gè)別或單個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作并不能夠有效地改變脂肪酸的含 量。因此，Girke等人預(yù)言在脂肪酸的代謝過程中，很可能存在一種蛋白激酶或其它調(diào)控因 子(例如轉(zhuǎn)錄因子)在起調(diào)控作用(Girke，Τ.，Todd, J.，Ruuska，S.，White, J.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. (2000). Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol 124，1570-1581.)。目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子有擬南芥的WRIl和LECl等。其 中，WRIl編碼一個(gè)AP2/ERra轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它可能是植物體內(nèi)由蔗糖向TAG轉(zhuǎn)化的一個(gè) 關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(Cernac，Α.，and Benning, C. (2004). WRINKLEDlencodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J 40，575-585.)。LECl屬于能結(jié)合啟動(dòng)子中順式作用元件CCAAT盒的 一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控胚胎的發(fā)生與種子成熟，同時(shí)可能對(duì)胚胎形成過程中胚胎儲(chǔ)存物的積 Mii^fiIK (Lotan, T. ，Ohto, M. ，Yee, K. M. ，West, Μ. Α. ，Lo, R. ，Kwong, R. W. ，Yamagishi, K. , Fischer, R. L. , Goldberg, R. B. , and Harada, J. J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell 93，1195-1205.)。過量表達(dá)LECl能大幅度增加轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.， Tan, H. , Zheng, Q. , Fu, F. , Liang, Y. , Zhang, J. , Yang, Χ. , Wang, Τ. , Chong, K. , Wang, Χ. J., et al. (2008). LEAFYC0TYLED0N1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol 148，1042—1054.)。在擬南芥基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個(gè)，占整 個(gè)基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110_2113)。這些轉(zhuǎn)錄因子大多 屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有 的。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)一類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié) 控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性。CCAAT盒是一個(gè)廣泛存在于基因啟動(dòng)子上的順式作 用元件，與CCAAT序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一個(gè)由三種不同亞基構(gòu)成的異源三聚體復(fù)合物，它特異性地識(shí)別DNA 上的CCAAT序列，并與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個(gè)亞 族NF-YA(又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF_YB(又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF_YC(又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結(jié)構(gòu)域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個(gè)緊密結(jié)合的異源二聚體復(fù)合物，NF-YA再結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物的表面， 形成異源三聚體復(fù)合物。該三聚體復(fù)合物對(duì)DNA有很高的親和力(Gusmaroli，G.，Tonelli， C. , and Mantovani, R. (2002). Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits. Gene 283,41-48. ；Romier, C., Cocchiarella, F. ， Mantovani, R. ， and Moras, D. (2003).The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y. J Biol Chem 278,1336-1345)。編碼NF-Y亞基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母與動(dòng)物體中，各種亞 基都是由單基因編碼的。而在植物的基因組中，NF-Y亞基是由多種不同基因編碼的。在擬南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年報(bào)道了三個(gè)NF-Y亞族中的共29個(gè) ESTs 的序列(Gusmaroli, G. , Tonelli, C. , and Mantovani, R. (2001). Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene 264,173-185),本發(fā) 明的發(fā)明人于2004年完成了該家族32個(gè)基因cDNA的克隆，其中9個(gè)HAP2，11個(gè)HAP3， 12 個(gè) HAP5 (Wei 等，2004，Plant Physiol.，135 :773_782)。NF-YB 亞族的轉(zhuǎn)錄因子在基 因內(nèi)部都含有一個(gè)保守的B結(jié)構(gòu)域，依據(jù)B結(jié)構(gòu)域序列的差異，該家族被分為兩類=LEAFY COTYLEDON 1 (LECl)類型和非 LECl 類型(Kwong, R. W.，Bui，A. Q.，Lee，H.，Kwong, L. W.， Fischer, R. L. , Goldberg, R. B.，and Harada, J. J. (2003) · LEAFY COTYLEDON 1-LIKE defines a class of regu lators essential for embryo development. Plant Cell 15，5—18)。 LECl類型包括兩個(gè)基因LEC1和LEAFY COTYLEDONl-Iike (LlL)。這兩個(gè)基因都是特異性 地在胚胎和種子發(fā)育過程中表達(dá)。LECl類型的轉(zhuǎn)錄因子的B結(jié)構(gòu)域含有16個(gè)保守的氨 基酸殘基，這16個(gè)氨基酸殘基在非LECl類型的轉(zhuǎn)錄因子中是不存在的。B結(jié)構(gòu)域是決定 LECl類轉(zhuǎn)錄因子在功能上區(qū)別于其它非LECl類轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵因素(Hyes eimg等，2003， Proc Natl Acad Sci，USA, 100 :2152_2156)。LECl 是 HAP3 家族中功能研究的較為清楚的 一個(gè)蛋白。LECl是擬南芥胚胎發(fā)生過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。LECl參與了種子成熟的 多個(gè)過程，包括種子的干燥和養(yǎng)分的積累。目前，在玉米、向日葵和胡蘿卜中，均發(fā)現(xiàn)了 LECl 白勺胃(Zhang, S. ， Wo ng, L. ， Meng, L. ， and Lemaux, P. G. (2002). Similarity of expression patterns of k nottedl and ZmLECl during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zea mays L·)· Planta 215,191-194. ；Yazawa, K. , Takahata, K. , and Kamada, H. (2004). Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledonl and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis. Plant Physiol Biochem 42,215-223.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白。本發(fā)明提供與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白，是調(diào)控種子脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子， 來源于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)油菜(Brassica napus L.)名稱為LEAFYC0TYLED0N1 (簡稱 BnLECl)，該蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO :1由231個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第59-126 位氨基酸殘基為NF-YB結(jié)構(gòu)域。所述取代和/或缺失和/或添加的一至幾個(gè)氨基酸殘基是1-10個(gè)氨基酸殘基，可 以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。為了使1)中的BnLECl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成 的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2_10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-my c10EQKLISEEDL上述2)中的BnLECl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述2)中的BnLECl的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'末端第20-715位堿基所示 的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義 突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述與種子脂肪酸合成相關(guān)蛋白的cDNA基因(命名為BnLECl)也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。與種子脂肪酸合成相關(guān)蛋白的cDNA基因具體可為如下1)_4)中任一所述的基 因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第20-715位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；3)在嚴(yán)格條件下與與1)或2)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。序列表中的序列2由724個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(open reading frame，簡 稱0RF)為自5'末端第20-715位堿基，編碼具有序列表中序列1的氨基酸序列的BnLECl 蛋白；序列2的自5'端第194-397位堿基編碼NF-YB結(jié)構(gòu)域。上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。上述3)或4)的基因具體可指序列表中序列3所示的基因，序列3所示的基因是上 述eDNA的基因組DNA，序列表中的SEQ ID NO 3基因組DNA序列由1898個(gè)堿基組成，包括 19個(gè)堿基的5' UTR區(qū)，3' UTR區(qū)為1889到1898位堿基。自5'端第20-72位堿基為該 基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5'端第73-1246位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子， 自5'端第1247-1889位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5'端第1889-1898位堿 基為該基因組基因的3'非編碼區(qū)。所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因既可為BnLECl的cDNA序列，也可 為BnLECl的基因組基因序列；與BnLECl具有90%以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列， 是將BnLECl的cDNA用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)該理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或 者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變異的基因的有效性的 方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因BnLECl或其同源序列可以正義方 向或反義方向?qū)胫参锝M織、細(xì)胞或器官。擴(kuò)增上述BnLECl基因全長或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重 組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有BnLECl基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。使用BnLECl或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上 任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜 花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻Actinl啟動(dòng)子等；所述組織特 異性表達(dá)啟動(dòng)子可為種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng) 子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào)X87764)；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受ABA、乙烯或化學(xué)等誘導(dǎo) 的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū) 域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以 保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然 的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或潮霉素標(biāo) 記物等或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的 宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考 慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采 用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有 目的基因。上述重組載體是按照下述的方法制備得到的重組表達(dá)載體將序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的啟動(dòng)子與任一所述基因一起插 入pCAMBIA-2300的多克隆位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育種子含油量高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育種子含油量高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述與種子脂肪酸 合成相關(guān)的蛋白的編碼基因BnLECl導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的 含油量高于所述目的植物種子的含油量。所述與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白的編碼基因BnLECl是通過上述重組表達(dá)載體 導(dǎo)入目的植物中的。
攜帶有本發(fā)明編碼調(diào)控植物種子脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子BnLECl的基因或其同源序 列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體_化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病 毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的 任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官 培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因BnLECl或 BnLECl具有90 %以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可 從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株脂肪酸含量和組分的改變包括植物 體內(nèi)各組織和器官內(nèi)各種脂肪酸含量包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的改善和提高，及各 種脂肪酸組分的提高或降低。本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、 組織或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴 薯或煙草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪 草等單子葉植物。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明保護(hù)的基因BnLECl適量表達(dá)后可以提高油菜種子中的含油量。 本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了在種子特異并適度表達(dá)的啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因油菜BnLECl基 因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明能顯著提高油料作物油菜種子中的油含量，為轉(zhuǎn)基因方法提高油 料作物的脂肪酸含量提供一條行之有效的途徑。這對(duì)提高植物(特別是油料作物)的脂肪 酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng) 前景。


圖1為BnLECl蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，數(shù)字表示氨基酸殘基位置，59-126為保守的 NF-YB結(jié)構(gòu)域。圖2為napin A啟動(dòng)子缺失片段與⑶S基因融合表達(dá)載體簡圖，+1表示預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn) 錄起始點(diǎn)，箭頭指示轉(zhuǎn)錄方向；數(shù)字表示napin A啟動(dòng)子以及相應(yīng)突變體(D系列突變體) 的長度與突變的相對(duì)位置，GUS編碼區(qū)未按長度比列繪制。圖3為napin A啟動(dòng)子缺失片段驅(qū)動(dòng)⑶S表達(dá)酶活分析，D0、D4、D6和D7為napin A啟動(dòng)子的缺失片段驅(qū)動(dòng)GUS的轉(zhuǎn)基因擬南芥果莢中GUS酶活，每個(gè)缺失片段啟動(dòng)子測(cè)定5 個(gè)獨(dú)立家系，以典型家系表示該缺失片段啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)能力，數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立測(cè)定的平均值。圖4為D7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnLECl表達(dá)載體，+1表示預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，箭頭指示轉(zhuǎn) 錄方向；D7表示napin A啟動(dòng)子突變體的長度，啟動(dòng)子按照長度比例繪制，BnLECl基因未按 長度比列繪制。圖5為D7: IBnLECl轉(zhuǎn)基因油菜種子中油含量，Westar為非轉(zhuǎn)基因野生型油菜對(duì) 照；D7: :BnLECl#2、D7: :BnLECl#3、D7: :BnLECl#4、D7: :BnLECl#5 為以 Westar 為背景的轉(zhuǎn)基 因油菜株系。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
中油821、Westar油菜均由西南大學(xué)李加納老師在2007年7月贈(zèng)送，其原始來源 不清楚。擬南芥(Col-O)種子由 2001 年 5 月 ABRC(http//www. arabidopsis. org)贈(zèng)送， 其原始來源不清楚。實(shí)施例1、種子含油量高的轉(zhuǎn)基因油菜的獲得一、啟動(dòng)子的獲得及其檢測(cè)1、啟動(dòng)子的獲得根據(jù)napin A啟動(dòng)子的核苷酸序列(GenBank號(hào)J02798. 1)，按照?qǐng)D2設(shè)計(jì)napin A啟動(dòng)子缺失片段引物(F為前端引物，R為反向引物)，用于擴(kuò)增十字花科蕓薹屬甘藍(lán)油菜 (Brassica napus L.)中的種子胚胎特異表達(dá)的啟動(dòng)子，引物序列如下(劃線為酶切位點(diǎn)， 前面三個(gè)堿基為保護(hù)堿基))DO F 5' -CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC-3‘；D7 F 5' -CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG-3‘；D6 F 5' -CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC-3‘；D4 F5' -CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT-3‘；napinA R 5' -TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3‘。用CTAB法提取油菜中油821 (謝柱存.中油821的特性與栽培[J].廣西農(nóng)業(yè)科 學(xué)，1991，(05) 213)基因組 DNA，在 napin A 前端引物(DO F、D4 F、D6 F 和 D7 F)和后端 引物napinA R的分別引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，得到DO、D4、 D6和D7擴(kuò)增片段。將回收純化的D0、D4、D6和D7片段連接入到載體pGEM-Teasy (Promega 公司)中。然后將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽 性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培 養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，分別命名為pGEM-D0、pGEM_D4、 PGEM-D6和pGEM-D7。對(duì)上述重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增得到的4個(gè)片 段與napin A啟動(dòng)子(GenBank號(hào)J02798. 1)序列相對(duì)應(yīng)部分相同。各個(gè)啟動(dòng)子序列分別 如下DO的序列如序列表中序列4所示；D4的序列如序列表中序列4的自5’端第 832-1145位所示；D6的序列如序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示；D7的序列如 序列表中序列4的自5，端第891-1145位所示。2、啟動(dòng)子的檢測(cè)Dnapin A啟動(dòng)子缺失片段(D系列啟動(dòng)子)與GUS編碼區(qū)的融合表達(dá)載體構(gòu)建分別挑選pGEM-D0、pGEM_D4、pGEM_D6和pGEM_D7序列正確的陽性克隆，大量制 備質(zhì)粒DNA，用購于NEB公司的Hindlll/Sal I雙酶切得到相應(yīng)啟動(dòng)子插入片段，用膠回 收試劑盒(購自鼎國公司)回收DO、D4、D6和D7啟動(dòng)子片段，純化后的片段用T4連接酶 (Roche公司)與經(jīng)過同樣酶切的pBI121(購自Clontech)載體連接，形成pBI121_D0:⑶S、 PBI121-D4: :GUS、pBI121_D6: :GUS 和 pBI121_D7: :GUS 的 GUS 表達(dá)載體。熱激法轉(zhuǎn)化大腸 桿菌(E. coli)DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。載體的構(gòu)建簡圖， 見圖2。
2)轉(zhuǎn)基因擬南芥中啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS蛋白表達(dá)的檢測(cè)A、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得將步驟1)得到的 pBI121-D0: :GUS、pBI121-D4: :GUS、pBI121-D6: :GUS 和 PBI121-D7:⑶S四種表達(dá)載體分別用電激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入不同的農(nóng)桿菌GV3101菌株中。挑 取轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌單菌落接種于20ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/ L)中，28°C，150rpm振蕩培養(yǎng)2天。所獲菌液以2 %接種量接菌于含有利福平和卡那霉 素的300ml LB培養(yǎng)基，按照上述條件振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。所獲菌液經(jīng)5，000rpm、20分 鐘離心收集菌體，菌體重懸于250ml含有5%蔗糖和Silwet L-77轉(zhuǎn)化液中，慢慢搖勻。 轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)入250ml燒杯中，將已去掉花和果莢的擬南芥Col-O野生型(Feng，H.，An, F.， Zhang, S.，Ji, Z.，Ling, H. Q.，and Zuo, J. (2006). Light-regulated, tissue-specific, and cell differentiation-specific expression of the Arabidopsis Fe(III)-chelate reductase gene AtFR06. Plant Physiol 140，1345-1354.)倒置于燒杯中，真空抽 20 秒為 宜。為提高轉(zhuǎn)化效率，一周后可再重復(fù)轉(zhuǎn)化一次。將轉(zhuǎn)化后的擬南芥培養(yǎng)得到種子，將得到 的擬南芥種子在含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出綠葉和根系的苗為轉(zhuǎn)基因擬南芥。B、⑶S酶活性的檢測(cè)取步驟A中的轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代的相同標(biāo)記時(shí)間的同期擬南芥果莢lOOmg，用 液氮研磨成干粉，加500 μ 1提取液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 0 ；lOmmol/L巰基乙醇； lmmol/L EDTA，pH8. 0 ；0. 月桂酸肌氨酸鈉；0. 1% Triton X-100)，13，OOOrpm 離心 10 分 鐘，上清液用于⑶S活性及蛋白濃度測(cè)定。取5 μ 1酶提取液加入到45 μ 1檢測(cè)液中(酶 提取液中加入2mmol/L 4-甲基傘型酮酰-β -葡萄糖醛酸苷[4_Methyl umbelIiferyl β -D glucuronide, MUG])，立即混勻，快速取5 μ 1反應(yīng)混合液，加入到195 μ 1反應(yīng)終止液 (0. 2mol/L Na2CO3)中，混勻，即酶活性測(cè)定0點(diǎn)；反應(yīng)混合液于37°C保溫，一小時(shí)后取5 μ 1 反應(yīng)混合液加入到195ul反應(yīng)終止液中終止反應(yīng)；用Tecan GENios熒光分光光度計(jì)(激 發(fā)光波長為365nm，發(fā)射光為455nm)測(cè)定每個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算反應(yīng)生成的4-甲基傘 型酮(4-methylumbelliferone，MU)的量；按照 Bradford 方法，用 Tecan GENios 測(cè)定樣品 中蛋白含量；計(jì)算樣品中GUS活性，GUS活性=單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位 pmol MU -mg-1 ^irT1)，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明隨著啟動(dòng)子長度的縮短，啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)能 力降低。二、種子含油量高的轉(zhuǎn)基因油菜的獲得及其檢測(cè)1、調(diào)控種子脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因BnLECl的克隆根據(jù)擬南芥LlL的核苷酸序列(GenBank號(hào)AB025628)設(shè)計(jì)引物P3和P4，用于 擴(kuò)增十字花科蕓薹屬甘藍(lán)油菜(Brassica napus L.)中的調(diào)控種子脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子 BnLECl基因基因組DNA序列，引物序列如下P3 (BnLEC 1 上游引物)5 ‘ -TTAGTCGACCGAGGACGGCAGAGAAACAAT-3 ‘P4 (BnLECl 下游引物)5, -CGAGGATCCTTTACTAGTTCACTTATACTG-3‘用CTAB法提取油菜基因組DNA，在引物P3和P4的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反 應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用購自鼎國公司的DNA回 收試劑盒回收長度約為1. 8Kb的目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將回收片段連接入到載體 pGEM-Tcasy (Promega公司)中。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，提質(zhì)粒，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-BnLECl。對(duì) 其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段具有序列表中的SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，包括19 個(gè)堿基的5' UTR區(qū)，放閱讀框架為5'端第20到第1889位堿基，3' UTR區(qū)為1889到1898 位堿基。自5'端第20-72位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5'端第73-1246位 堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5'端第1247-1889位堿基為該基因組基因的第 二個(gè)外顯子，自5'端第1889-1898位堿基為該基因組基因的3'非編碼區(qū)。將該基因命名 為BnLECl，將其編碼蛋白命名為BnLECl，該基因蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中所含保守的NF-YB結(jié)構(gòu)域 簡圖，見圖1。BnLECl的cDNA的序列如序列表中序列2所示，序列2由724個(gè)堿基組成，其 開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第20-715位堿基，編碼具有序列表中序列1的氨基酸序 列的BnLECl蛋白；序列2的自5'端第194-397位堿基編碼NF-YB結(jié)構(gòu)域。2、用D7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnLECl表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建挑選步驟二的步驟1中pGEM-BnLECl序列正確的陽性克隆，大量制備質(zhì)粒DNA，用 從NEB公司購得的Sal I/BamH I雙酶切得到基因插入片段，用膠回收試劑盒(購自鼎國公 司)回收BnLECl基因片段，純化后的片段用T4連接酶(Roche公司)與經(jīng)過相同酶切過的 pCAMBIA-2300(簡稱 pC2300) (CAMBIA 公司，http://www. cambia. org/daisy/cambia/585. html))連接，形成pC2300: BnLECl的中間載體。然后分別把步驟一中步驟2得到pGEM-D7正確的陽性克隆，大量制備質(zhì)粒DNA，經(jīng) HindIII/Sal I雙酶切得到啟動(dòng)子插入片段，用膠回收試劑盒(購自鼎國公司)回收D7啟 動(dòng)子片段，純化后的片段用T4連接酶(Roche公司)與經(jīng)過相同酶切過的pC2300: BnLECl 中間載體連接，分別形成PC2300-D7: :BnLECl的最終載體。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切 鑒定。表達(dá)載體的構(gòu)建圖，見圖4。3、轉(zhuǎn)基因油菜的獲得1)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將步驟2得到的表達(dá)載體pC2300-D7: BnLECl)用電激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。 挑取轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌單菌落接種于20mlLB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L) 中，28°C，150rpm振蕩培養(yǎng)2天。然后，所獲菌液以2%接種量接菌于含有利福平和卡那霉 素的300ml LB培養(yǎng)基，按照上述條件振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。所獲菌液經(jīng)5，000rpm、20分鐘 離心收集菌體，菌體重懸于250ml含有5 %蔗糖和Silwet L-77轉(zhuǎn)化液中，慢慢搖勻，得到含 有 pC2300-D7: BnLECl 的轉(zhuǎn)化液。2)轉(zhuǎn)化油菜轉(zhuǎn)pC2300-D7: BnLECl 的轉(zhuǎn)基因油菜把含有pC2300-D7: =BnLECl的轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)入塑料袋中，將已經(jīng)去掉果莢和花 的 Westar 油菜花序(該油菜是 Westar，Chandler, S. F.，and Thorpe, Τ. Α. (1987). Characterization of Growth, Water Relations, and Proline Accumulation in SodiumSulfate Tolerant Callus of Brassica napus L. cv Westar(Canola). Plant Physiol 84，106-111.)浸泡在轉(zhuǎn)化液中，浸泡1分鐘為宜，浸泡期間不?；蝿?dòng)浸染液。為提
11高轉(zhuǎn)化效率，隔兩天后可重復(fù)浸染轉(zhuǎn)化一次，共轉(zhuǎn)化三次。將轉(zhuǎn)化后的油菜培養(yǎng)，得油菜種 子，將油菜種子在含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出綠葉和根系的苗為轉(zhuǎn)基因油菜苗，至此 獲得轉(zhuǎn)PC2300-D7: BnLECl的轉(zhuǎn)基因油菜。4、轉(zhuǎn)基因油菜的檢測(cè)以非轉(zhuǎn)基因油菜Westar為野生型對(duì)照。將轉(zhuǎn)基因油菜苗培養(yǎng)，得到Tl代種子，對(duì)Tl代種子(轉(zhuǎn)pC2300-D7: BnLECl的轉(zhuǎn) 基因油菜和野生型對(duì)照)進(jìn)行含油量的測(cè)定與計(jì)算，其中含油量=種子油脂(質(zhì)量)/種子 干重(質(zhì)量)。種子油脂的質(zhì)量是采用德國BRUKE公司的VECT0R22/N型傅立葉變換近紅外 光譜儀測(cè)定，運(yùn)用OPUS 5. 5軟件進(jìn)行分析得到的。光譜采集條件分辨率ScnT1，掃描次數(shù)32 次，譜區(qū)范圍UOOOIOOOcnT1，室溫23-25°C。測(cè)定結(jié)果如圖5所示，D7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnLECl 過表達(dá)，轉(zhuǎn)PC2300-D7: IBnLECl的轉(zhuǎn)基因油菜種子含油量高于Westar野生型對(duì)照種子含油 量，說明D7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnLECl過量表達(dá)后可以提高油菜種子中的含油量。
0087]序列表0088]<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所0089]<120>與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白BnLECl及其編碼基因與應(yīng)用0090]<160>40091]<210>10092]<211>2310093]<212>PRT0094]<213> 甘藍(lán)油菜(Brassicanapus L.)0095]<400>10096]Met Glu ArgGlyAlaProLeuSerHisTyrGlnLeuProLysSerAsn0097]1510150098]Ser Gly LeuAsnLeuAspGlnHisAsnAsnSerlieProThrMetThr0099]2025300100]Gly Ser IleGlyAlaCysAspAspLysAsnLysThrlieLeuProGln0101]3540450102]Gln Gln ProSerMetProArgGluGlnAspGlnTyrMetProlieAla0103]5055600104]Asn Val lieArgIleMetArgLyslieLeuProProHisAlaLyslie0105]657075800106]Ser Asp AspAlaLysGluThrlieGlnGluCysValSerGluTyrlie0107]8590950108]Ser Phe ValThrGlyGluAlaAsnGluArgCysGlnArgGluGlnArg0109]1001051100110]Lys Thr lieThrAlaGluAsplieLeuTrpAlaMetSerLysLeuGly0111]1151201250112]Phe Asp AspTyrValGlyProLeuAsnValPhelieAsnArgTyrArg0113]1301351400114]Glu Phe Glu ThrAsp ArgGly Cys0115]1451500116]Lys Pro Val TyrGly GlySer Gly0117]1650118]Pro Gly Ser TyrGly TyrGly Met0119]1800120]Gly Gly Arg TyrTyr HisAsn Gly0121]1952000122]Gly Gly Gly GlySer SerSer Ser0123]2102150124]Asp Gln Tyr GlyGln TyrLys0125]2252300126]<210>20127]<211>7240128]<212>DNA0129]<213> 甘藍(lán)油菜(Brassicanapus L0130]<400>20131]cgaggacggcagagaaacaatggaacgtgg0132]atctaactctggactgaacttggaccagca0133]catcggtgcatgcgacgacaagaacaagac0134]tcgtgagcaagaccaatacatgccaatcgc0135]accgccacacgccaaaatctctgacgacgc0136]gtacatcagcttcgtgaccggtgaagctaa0137]aataactgctgaagatatcctttgggcaat0138]accactcaacgtgttcattaaccggtaccg0139]tagaggtgagtcatcatttaaaccggtcta0140]acctccaccgggttcttatggttatggtat0141]tcggtactaccataacggatcgggtccgga0142]ctcttctatgaatggaatgccggttaatta0143] ￡1￡1￡10144]<210>30145]<211>18980146]<212>DNA0147]〈213〉甘藍(lán)油菜(Brassicanapus L0148]<400>30149]cgaggacggcagagaaacaatggaacgtgg0150]atctaactctggtaatcaaataataagtgc0151]tatactcacgaatcataaacttgttttgag0152]ctttcatgtcttcttaaaacagtagagatt
Ser Leu Arg Gly Glu Ser Ser Phe 155160
Met Gly Phe His Gly Pro Pro Pro
170175
Leu Asp Gln Ser Met Val Met Gly 185190
Ser Gly Pro Asp Gly Ser Val Gly 205
Met Asn Gly Met Pro Val Asn Tyr
220) agctcctctctctcactatcagctacccaa60caacaactcaatcccgacaatgaccggctc120tatcttgccgcagcaacaaccaagcatgcc180aaacgtgataaggatcatgcgtaaaatctt240aaaagaaacgattcaagaatgcgtctccga300cgagcgttgccaacgtgagcaacgtaagac360gagcaaacttgggttcgatgattacgttgg420tgagttcgagaccgatcgtgggtgttcact480tggaggaagtggtatggggtttcacggccc540gttggatcagtctatggtcatgggtggtgg600tggatcagtaggtggtggcggtggatcttc660tgaccagtatggtcagtataagtgaactag720724) agctcctctctctcactatcagctacccaa60ctatttatgtatatacgtgcctgcactatg120attttttgtatatcaacaaagaactagaga180tttatttcttagatttttttaaaggtacgg240
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gtatgttggatcagtctatggtcatgggtggtggtcggtactaccataacggatcgggtc1800
cggatggatcagtaggtggtggcggtggatcttcctcttctatgaatggaatgccggtta1860
attatgaccagtatggtcagtataagtgaactagtaaa1898
<210>4
<211>1145
<212>DNA
<213> (Brassica napus)
<400>4
aagctttcttcatcggtgattgattcctttaaagacttatgtttcttatcttgcttctga60
ggcaagtattcagttaccagttaccacttatattctggactttctgactgcatcctcatt120
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attttagaca tgggtatgaaatgtgtgtta420tgaagtggca taccgttctcgagtaaggat480ttttagtatcagagtaaaatgtgtacctat5403.3. C 3. 3.3.3.3. taaaccagcctgcacctgca600gctcctatccaccgggtgtaacaagacgga660cccaatttatattgaccgtgactaaatcaa720caatttatattcccaacggcactacctcca780caacttagta aacgtttttttttttaattt840aaagaatcgttcataagatgccatgccaga900gccgcggagaattgtttttcttcgccactt960ctctcacagcacacacatacaatcacatgc1020caaatctcctttatagcctataaattaact1080ctcatcaatacaaacaagat 3.3.3.3.3. C 3. 3.1140 114權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因是如下1)-4) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第20-715位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；3)在嚴(yán)格條件下與與1)或幻的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述權(quán)利要求3中，3)或4)的基因 是序列表中序列3所示的基因。
5.含有權(quán)利要求2-4任一所述基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是按照下述的方法制 備得到的重組表達(dá)載體將序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的啟動(dòng)子與權(quán)利 要求2-4任一所述基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體。
7.一種培育種子含油量高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2-4任一所述的編碼基 因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的含油量高于所述目的植物種 子的含油量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2-4任一所述的編碼基因是通 過權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子 葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、 棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小 麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將該蛋白的編碼基因?qū)胫参镏校梢蕴岣哂筒朔N子中的含油量。這對(duì)提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102070707SQ20091023828
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者付福友, 左建儒, 楊曉輝, 牟金葉, 譚河林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所