專(zhuān)利名稱(chēng)::一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)pva降解酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶產(chǎn)量的方法,屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域,具體來(lái)說(shuō)是一種通過(guò)添加1,4_丁二醇提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù):
:PVA降解酶是一個(gè)酶系,它們作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式報(bào)道的PVA降解酶主要包含三個(gè)種類(lèi)PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)、PVA脫氫酶(EC1.1.99.23)和氧化型PVA水解酶(P-雙酮水解酶)(EC3.7.1.7)。近年還發(fā)現(xiàn)了專(zhuān)一性比較高的降解低醇解度PVA長(zhǎng)鏈上殘存乙酸酯鍵的PVA酯酶。目前對(duì)于PVA降解的研究主要集中在三個(gè)方面1.篩選能夠降解PVA的微生物;2.純化PVA降解酶;3.克隆與PVA降解相關(guān)的基因。目前研究中的一個(gè)難點(diǎn)是PVA降解酶的酶活較低?,F(xiàn)在主要有兩種提高PVA降解酶產(chǎn)量的方法l.篩選高產(chǎn)PVA降解酶的微生物;2.優(yōu)化發(fā)酵條件。在PVA降解酶高產(chǎn)微生物的基礎(chǔ)上,本技術(shù)通過(guò)一種特殊碳源(1,4-丁二醇)顯著提高了PVA降解酶的產(chǎn)量,使其酶活水平達(dá)到了國(guó)內(nèi)先進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶產(chǎn)量的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明的技術(shù)方案如下在微生物發(fā)酵生產(chǎn)PVA降解酶過(guò)程中,添加1,4-丁二醇。所述1,4-丁二醇的添加方式為以5.0g/LPVA和5.lg/L1,4-丁二醇作為初始復(fù)合碳源。所述1,4-丁二醇的添加方式為以5.Og/LPVA作為唯一初始碳源,在發(fā)酵36h添加5.lg/Ll,4-丁二醇;所述1,4-丁二醇的添加方式為以5.Og/LPVA作為唯一初始碳源,在發(fā)酵36h添加5.lg/Ll,4-丁二醇,在發(fā)酵48h,添加5.Og/LPVA。所述微生物為從無(wú)錫太平洋紡織廠PVA退漿車(chē)間下水道口篩選出一個(gè)可以徹底降解培養(yǎng)基中l(wèi)g/LPVA的混合微生物體系(ChenJ,ZhangY,DuG_C,HuaZ_Z,ZhuY,Biodegradationofpolyvinylalcoholbyamixedmicrobialculture,EnzymeMicrob.Technol.,2007,40(7),1686-1691)。微生物發(fā)酵產(chǎn)PVA降解酶的培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.O,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min;微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的過(guò)程為液體種子培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,30。C振蕩培養(yǎng)36h;3兩步發(fā)酵法第一步,500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,30。C振蕩培養(yǎng);第二步,發(fā)酵36h添加5.lg/L1,4_丁二醇;三步發(fā)酵法第一步,500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,3(TC振蕩培養(yǎng);第二步,發(fā)酵36h添加5.lg/L1,4_丁二醇;第三步,發(fā)酵48h添加5.Og/LPVA。PVA含量測(cè)定采用Finley法,其具體方法為將發(fā)酵液離心(10000r/min,10min),棄去沉淀,收集上清液。將上清液經(jīng)微孔濾膜(孔徑0.45iim,直徑50mm)過(guò)濾,然后用0.lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)透析24h,即為粗酶液。在5X15試管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(lg/LPVA1799溶于pH8.0的磷酸鉀緩沖液中),將此混合體系于35°C反應(yīng)6h,分別測(cè)定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液所對(duì)應(yīng)PVA含量的吸光度。每分鐘吸光度下降0.001定義為一個(gè)酶活單位。細(xì)胞干重測(cè)定方法為將每個(gè)三角瓶中的發(fā)酵液過(guò)濾,收集菌體于濾紙上,去離子水洗兩次,在105t:烘箱中烘至恒重,稱(chēng)量所得數(shù)值減去預(yù)先稱(chēng)量好的濾紙的重量即為細(xì)胞干重。發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明采用的原料1,4-丁二醇是PVA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,它在細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和PVA類(lèi)似,因此它不會(huì)抑制PVA降解酶的產(chǎn)生;同時(shí)它作為一種小分子碳源容易被微生物吸收利用,能提高微生物的生物量。所以1,4-丁二醇通過(guò)提高微生物的生物量,從而顯著提高PVA降解酶的產(chǎn)量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶的產(chǎn)量,PVA降解酶產(chǎn)量從1.11U/mL高到3.43U/mL,為PVA降解酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種方法。本發(fā)明還具有操作簡(jiǎn)單、原料價(jià)格便宜、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式對(duì)比例1培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.O,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,3(TC振蕩培養(yǎng)36h。結(jié)果見(jiàn)表l,在不添加1,4-丁二醇的情況下,混合體系發(fā)酵結(jié)束后,菌體干重達(dá)到1.17g/L,PVA降解酶活力為1.11U/mL。表1混合碳源對(duì)混合微生物產(chǎn)PVA降解酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>DCW:細(xì)胞干重,PVADE:PVA降解酶。對(duì)比例2:培養(yǎng)基組成PVA和葡萄糖培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.0,葡萄糖6.8,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mLPVA和葡萄糖培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,30。C振蕩培養(yǎng)36h。結(jié)果見(jiàn)表l,在以PVA和葡萄糖作為復(fù)合碳源的情況下,混合體系發(fā)酵結(jié)束后,菌體干重達(dá)到0.98g/L,PVA降解酶活力為1.16U/mL。對(duì)比例3:培養(yǎng)基組成PVA和淀粉(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.0,可溶性淀粉6.2,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mLPVA和淀粉培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,30°C振蕩培養(yǎng)36h。結(jié)果見(jiàn)表l,在以PVA和可溶性淀粉作為復(fù)合碳源的情況下,混合體系發(fā)酵結(jié)束后,菌體干重達(dá)到0.99g/L,PVA降解酶活力為1.33U/mL。實(shí)施例1:含有1,4_丁二醇的復(fù)合碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成PVA和1,4-丁二醇培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.0,1,4-丁二醇5.1,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mLPVA和1,4_丁二醇培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,30。C振蕩培養(yǎng)36h。結(jié)果見(jiàn)表l,在以PVA和葡萄糖作為復(fù)合碳源的情況下,混合體系發(fā)酵結(jié)束后,菌體干重達(dá)到1.40g/L,PVA降解酶活力為2.12U/mL,相對(duì)于對(duì)比例,菌體干重與PVA降解酶活力均有較大幅度提高。實(shí)施例2:培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.O,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,121。C滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法兩步發(fā)酵法第一步,500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,3(TC振蕩培養(yǎng);第二步,發(fā)酵36h添加5.lg/Ll,4-丁二醇。結(jié)果見(jiàn)表l,發(fā)酵結(jié)束后,細(xì)胞干重和PVA降解酶的產(chǎn)量都得到了提高,菌體干重達(dá)到1.66g/L,PVA降解酶的活力達(dá)到2.92U/mL。實(shí)施例3:培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa,醇解度99.0%)5.O,酵母粉2.0,K2HP041.0,KH2P040.125,MgS047H200.1,F(xiàn)eS047H200.05,CaCl20.025,NaCl0.01,pH7.5,12rC滅菌15min。微生物培養(yǎng)方法三步發(fā)酵法第一步,500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min,3(TC振蕩培養(yǎng);第二步,發(fā)酵36h添加5.lg/L1,4_丁二醇;第三步,發(fā)酵48h添加5.Og/LPVA。結(jié)果見(jiàn)表l,發(fā)酵結(jié)束后,菌體干重達(dá)到1.88g/L,PVA降解酶酶活達(dá)到了3.43U/mL,與起始的1.11U/mL相比提高了3倍。權(quán)利要求一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶產(chǎn)量的方法,其特征在于,在微生物發(fā)酵生產(chǎn)PVA降解酶過(guò)程中添加1,4-丁二醇。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,所述添加l,4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA和5.lg/L1,4-丁二醇作為初始碳源。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,所述添加l,4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA作為唯一初始碳源,在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中添加5.lg/L1,4-丁二醇。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,所述添加l,4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA作為唯一初始碳源,在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中添加5.lg/L1,4-丁二醇,在發(fā)酵48h向發(fā)酵液中添加5.Og/LPVA。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)PVA降解酶產(chǎn)量的方法。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加1,4-丁二醇,提高了PVA降解酶的產(chǎn)量。通過(guò)兩步發(fā)酵法、三步發(fā)酵法,發(fā)酵結(jié)束后,PVA降解酶產(chǎn)量分別達(dá)到2.92U/mL和3.43U/mL,與不添加1,4-丁二醇相比,產(chǎn)量分別提高了2.6倍和3倍。本發(fā)明還具有操作簡(jiǎn)單、原料價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N9/04GK101724609SQ20091026099公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者唐波,堵國(guó)成,張東旭,陳堅(jiān)申請(qǐng)人:江南大學(xué)