專利名稱：Tt1基因在提高微生物耐酸堿性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TTl基因在提高微生物耐酸堿性中的用途。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的酸堿度通常以氫離子濃度的負對數(shù)即PH值來表示。環(huán)境中的pH值對微 生物的生命活動影響很大，主要作用在于由于pH的變化引起微生物體表面的電荷變化，進而影響微生物對營養(yǎng)物的吸收；pH除了對微生物細胞有直接影響外，還可以影響培養(yǎng)基中有機化合物的離子化作 用，從而對微生物有間接影響，因為多數(shù)非離子狀態(tài)化合物比離子狀態(tài)化合物更容易滲入 細胞；酶只有在最適宜的PH值時才能發(fā)揮最大活性，不適宜的PH值使酶的活性降低，進 而影響微生物細胞內(nèi)的生物化學(xué)過程；過高或過低的PH都降低微生物對高溫的抵抗能力。每種微生物都有其最適pH值和一定的pH范圍。在最適范圍內(nèi)酶活性最高，如果其 他條件適合，微生物的生長速率也最高。大多數(shù)細菌、藻類和原生動物的最適PH為6. 5 7. 5，在pH 4 10之間也可以生長；放線菌一般在微堿性即pH7. 5 8最適合；酵母菌、霉 菌則適合于PH5 6的酸性環(huán)境，但生存范圍在pHl. 5 10之間。有些細菌甚至可在強酸 性或強堿性環(huán)境中生活。微生物在基質(zhì)中生長，代謝作用會改變基質(zhì)中氫離子濃度。隨著環(huán)境PH值的不斷 變化，微生物生長受阻，當(dāng)超過最低或最高PH值時，將引起微生物的死亡。同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中，對pH值的要求也 不同。在發(fā)酵工業(yè)中，控制PH值尤其重要，例如Aspergillus niger在pH2 2. 5范圍時 有利于合成檸檬酸，當(dāng)在PH2. 5 6. 5范圍內(nèi)時以菌體生長為主，而在pH7. 0時，則以合成 草酸為主。丙酮丁醇梭菌在PH5. 5 7. 0范圍時，以菌體生長為主，而在pH4. 3 5. 3范圍 內(nèi)才進行丙酮丁醇發(fā)酵。同一種微生物由于環(huán)境pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。例如黑曲霉pH值 為2 3時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH值在7左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少 量檸檬酸。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和基因克隆技術(shù)的不斷完善，因工程研究正向縱深 發(fā)展，培育出抗性微生物品種也是一個可行之道，其關(guān)鍵是尋找到有效的抗性基因。在申請 人之前遞交的中國專利申請200810045667. 8中記載了分離自油菜的新基因，命名為TT1。本領(lǐng)域需要開發(fā)出能夠提高微生物抗酸堿性的備選基因，以及運用基因工程技術(shù) 提高微生物抗酸堿性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高微生物抗酸堿性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種 新的有效選擇。
本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了 TTl基因在提高微生物耐酸堿性中 的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；或(2)在(1)中的核苷酸序列經(jīng)過取 代、缺失或添加一個或幾個核苷酸所得的衍生序列，且該衍生序列與SEQ ID NO :1的序列編 碼功能相同的多肽。本發(fā)明解同時提供了 TTl基因編碼的多肽在提高微生物耐酸堿性中的用途。上述 TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過 取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼 功能相同的多肽。能提高微生物耐酸堿性。本發(fā)明還提供了一種培育抗酸堿微生物的方法。該方法包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組 載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入微生物；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化微生物，然后將轉(zhuǎn)化微生物培育成轉(zhuǎn)基因耐酸堿株系。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因為誘餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個EST序列，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE的方法獲得序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。然后根據(jù)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物，從油 菜cDNA中擴增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO=I中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO :1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同 氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO 1 同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO :1所述的序列。另外“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度 嚴(yán)謹條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹條件下與SEQ ID NO :1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術(shù)語還包括與SEQ ID NO :1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%，更佳地 至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本發(fā)明中的相同功能是指提高微生物的耐酸 堿性。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO :1相同功能的蛋白的SEQ ID NO=I 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1 90個，較佳地1 60個，更佳地1 20個，最佳地1 10個)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為 10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高微生物的耐酸堿性本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域
4已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主微生物，篩選獲得轉(zhuǎn)化微生物及其后代。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽 的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位 置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTl基因在提高微生物耐酸堿性方面的用 途，在本發(fā)明的實施例中也通過實驗證明轉(zhuǎn)入了 TTl基因并過表達的微生物在較高和較低 PH值環(huán)境下其生存能力有了明顯提高，證明了 TTl基因能有效的提高微生物的耐酸堿性。 本發(fā)明培育耐酸堿微生物的方法也簡便而有效，為提高微生物耐酸堿性提供了新的有效選 擇，具有好的應(yīng)用前景。


圖1、pH4. 0，37°C轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌和非轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的生長情況。縱坐標(biāo) 為0D600值，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間。圖 2、ρΗ4· 0、5· 5、7· 0、8· 5,10. 0，37°C，14h，轉(zhuǎn) TTl 基因(T)和非轉(zhuǎn)基因大腸桿菌 (C)的生長情況。
具體實施例方式
下面通過實施例并結(jié)合附圖，進一步說明而不限定本發(fā)明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施 例中，所用載體PET28，pGEX-2T，pGEM-T購自于Qiagen公司，菌株BL21購自于Qiagen公 司，菌株EHA105、載體pBI121購自于Clontech公司。其余化學(xué)試劑均為市售分析純。下述實施例中，“SEQ ID NO 1”單獨出現(xiàn)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解1其為“SEQ IDNO 1所示核苷酸序列”的簡稱，實施例一TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因為誘餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:3所示)， 再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE (見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發(fā)明 所述提高微生物耐酸堿性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據(jù)SEQ ID NO :1所示核苷酸序列設(shè)計引物，上游引物(SEQID NO 5) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 6) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下
1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)30次6. 72 °C 5min (終延伸)7.4°C 保存。對PCR產(chǎn)物純化(按Qiagen公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作)，經(jīng)測序驗證， 得到序列SEQ ID NO 1的基因片段。實施例二、過表達TTl基因的微生物的制備根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計引物，上游引物(SEQID NO 7) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 8) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經(jīng)PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2-4步驟循環(huán)30次6. 72 °C 5min (終延伸)7.4°C 保存。對PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書)，然后用BamHl與 Sacl酶切，膠回收，與載體pBI121連接(連接位點BamHl與Sacl)，獲含SEQ ID NO :1的 過量表達重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上。經(jīng)測序驗 證，得到含重組質(zhì)粒的E. coli pET28菌株。實施例三轉(zhuǎn)TTl基因微生物在各種PH條件下的生長實驗配制培養(yǎng)基配制LB液體培養(yǎng)基，加入抗生素Kan 50ug/ml，Cam 50ug/ml及 0. ImMIPTG后，分裝，分別調(diào)pH至4. 0,5. 5,7. 0,8. 5、10. 0后再分裝試管，每種pH裝2管，每 管5ml，待用。制備細菌懸液取轉(zhuǎn)TTl基因和非轉(zhuǎn)基因大腸桿菌單菌落37°C過夜活化。滴加供試菌在各pH水平的每管LB液體培養(yǎng)基中接入活化菌液0. 05ml，搖勻后 振蕩培養(yǎng)(370C，225rpm，14h)。培養(yǎng)與觀察37°C培養(yǎng)14h后觀察結(jié)果。以目測來判斷轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌在各 檔PH條件下的生長情況(以“_”表示不生長，“ + ”表示稍有生長，“++”表示生長好，“+++” 表示高濃度菌液)，結(jié)果見圖2。同時定時多次測試OD值，用以繪制不同pH值下的生長曲 線，結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有TTl耐熱基因的大腸桿菌比非轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌有較高的酸堿耐 受性。正常pH條件下(pH7.0)，轉(zhuǎn)TTl基因(T)和非轉(zhuǎn)基因(C)的生長情況基本相同，如圖可見，菌液濃度基本一致。而在酸性條件下，轉(zhuǎn)TTl基因(T)和非轉(zhuǎn)基因(C)的生長情況出 現(xiàn)差異，如圖可見，PH5. 5時，轉(zhuǎn)TTl基因(T)菌液濃度較高，非轉(zhuǎn)基因(C)菌液濃度較低； PH4.0時，轉(zhuǎn)TTl基因(T)菌液濃度較高，非轉(zhuǎn)基因(C)細菌幾乎不生長。而在堿性性條件 下，轉(zhuǎn)TTl基因(T)和非轉(zhuǎn)基因(C)的生長情況也存在差異，如圖可見，pH8. 5時，轉(zhuǎn)TTl基 因(T)菌液濃度較高，非轉(zhuǎn)基因(C)菌液濃度較低；pHIO時，轉(zhuǎn)TTl基因(T)菌液濃度較高， 非轉(zhuǎn)基因(C)細菌幾乎不生長。定時多次對37°C、pH4. 0條件下，轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌和非轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的生長 情況進行測定(北京普析通儀器公司TU-1800型紫外分光光度計)，OD值越大，表明菌液濃 度越大，如圖可見，隨時間變化，轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌的生長曲線斜率明顯大于非轉(zhuǎn)TTl基 因大腸桿菌，說明轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌的生長速度明顯大于非轉(zhuǎn)TTl基因大腸桿菌。實施例四TTl基因提高微生物耐酸堿性的初步機理研究本發(fā)明使用寶生物工程(大連)有限公司銷售的E. coli CHIP Version 2. O基因 芯片，按其說書進行操作(基因篩選標(biāo)準(zhǔn)見表1)，對過表達TTl基因的大腸桿菌與空白對照 的大腸桿菌的基因組表達進行比較，以初步探討TTl基因提高耐酸堿性的機理。參照組轉(zhuǎn)入空pET28a的大腸桿菌(Cy3)，實驗組TTl-pET28a (Cy5)表1基因篩選標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
TT1基因在提高微生物耐酸堿性中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高微生物耐酸堿性中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.一種培育耐酸堿微生物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入微生物；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化微生物，然后將轉(zhuǎn)化微生物培育成轉(zhuǎn)基因耐酸堿株系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在提高微生物耐酸堿性中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高微生物抗酸堿性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了TT1基因在提高微生物抗酸堿性方面的用途，經(jīng)實驗證明轉(zhuǎn)入了TT1基因并過表達的微生物在較高和較低pH值環(huán)境下其生存能力有了明顯提高，證明了TT1基因能有效的提高微生物的耐酸堿性。本發(fā)明培育耐酸堿微生物的方法也簡便而有效，為提高微生物耐酸堿性提供了新的有效選擇，具有好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/70GK101962653SQ200910304708
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司